hromycin);山環(huán)素(sancycline);山費(fèi)培南鋼(sanfetrinem sodium);沙莫西林 (sarmoxici 1 Iin);沙匹西林(sarpicillin);司可芬凈(scopafungin);西索米星 (sisomicin);硫酸西索米星(sisomicin sulfate);司帕沙星(spai^f ioxacin);鹽酸大觀 霉素 (spec tinomy C in hydrochloride);螺旋霉素(spiramycin);鹽酸司他霉素 (StalIimycin hydrochloride);司替霉素 (steff imycin);硫酉堇鏈霉素 (streptomycin sulfate);鏈異煙阱(Streptonicozid);礦胺苯(sulfabenz);礦胺苯醜(sulfabenzamide); 石黃胺乙醜(sulfacetamide);礦胺乙醜鋼(sulfacetamide sodium);礦胺西汀 (sulfacytine);礦胺嚼晚(sulfadiazine);礦胺嚼晚鋼(sulfadiazine sodium);礦胺多辛 (sulfadoxine);礦胺林(sulfalene);礦胺甲基嚼晚(SUIfamerazine);礦胺對甲氧嚼晚 (sulfameter);礦胺二甲嚼晚(sulfamethazine);石黃胺甲二P坐(sulfamethizole);石黃胺甲曝 口坐(sulfamethoxazole);礦胺間甲氧嚼晚(sulfamonomethoxine);礦胺曝口坐 (sulfamoxole);氨基苯礦酸轉(zhuǎn)(sulfanilate zinc);礦胺硝苯(sulfanitran);柳氮礦比晚 (sulfasalazine);礦胺異嗟P坐(sulfasomizole);礦胺嗟P坐(sulfathiazole);礦胺比口坐 (sulfazamet);礦胺異曝P坐(sulf isoxazole);礦胺乙醜異曝P坐(sulf isoxazole acetyl); 石黃胺異曝P坐二乙醇胺(sulfisoxazole diolamine);橫粘菌素(sulfomyxin);硫培南 (3111096116111);舒他西林(3111巾3111;[(3;[11;[11);森西林鋼(31111(3;[11;[1130(1;[加1);鹽酸獻(xiàn)氨西林 (talampici 11 in hydrochloride);替考控寧(teicoplanin);鹽酉堇替馬沙星(temaf Ioxacin hydrochloride);替莫西林(temocillin);四環(huán)素(tetracycline);鹽酸四環(huán)素 (tetracycline hydrochloride);四環(huán)素石葬酉堇復(fù)鹽(tetracycline phosphate complex); 四氧普林(tetroxoprim);甲諷霉素(thiamphenicol);苯硫甲氨霉素鐘(thiphencillin potassium);簇嗟酷青霉素甲苯醋鋼(ticarci Ilin cresyl sodium);替卡西林二鋼 (t icarci 1 Iin disodium);替卡西林--^^(ticarcillin monosodium);替克控酉同 (ticIatone);氯化喬多(tiodonium chloride);妥布霉素(tobramycin);硫酸妥布霉素 (tobramycin sulfate);妥舒沙星(tosufIoxacin);甲氧節(jié)晚(trime化oprim);硫酸甲氧節(jié) 晚(trimethoprim sulfate) 礦嚼晚(trisulfapyrimidines);醋竹桃霉素 (troleandomycin);硫酸丙大觀霉素 (trospectomycin sulfate);短桿菌素 (tyrothricin);萬古霉素(vancomycin);鹽酉堇萬古霉素 (vancomycin hydrochloride);維 及霉素(virginiamycin);佐博霉素(zorbamycin); W及它們的組合。
[00八]在此披露的組合物可任選地進(jìn)一步包含一種或多種另外的微生物生物體,例如, 農(nóng)藝學(xué)上有益的微生物。此類農(nóng)藝學(xué)上有益的微生物可與本披露的生物體協(xié)同或協(xié)調(diào),或 W其他方式與其配合。農(nóng)藝學(xué)上有益的微生物的例子包括芽胞桿菌屬(Bacillus SP.)、假 單胞菌屬、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、固氮螺菌屬(Azospirillum sp.)、固氮菌屬 (Azotobacter sp.)、光能利用細(xì)菌和纖維素降解細(xì)菌、梭菌屬(Clostridium sp.)、木霉屬 (Trichoderma sp.)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解,此列表僅僅是示例性的,并且不通過參照 此處提供的具體例子而受限。
[0078] 在±壤環(huán)境中,可發(fā)現(xiàn)接種細(xì)菌難^在天然存在的競爭者和捕食者生物體之間存 活。為了幫助本披露的組合物中存在的微生物在施用于環(huán)境中之后的存活,可將這些菌株 中的一種或多種膠囊化于例如一種適合的聚合物基體之中。在一個例子中,膠囊可包括藻 酸鹽珠粒,如由楊(Young)等人,2006,植物生長-促進(jìn)細(xì)菌于富含腐殖酸的藻酸鹽珠粒中的 圭寸裝(Encapsulation of plant growth-promoting bacteria in alginate beads enriched with humic acid),生物技術(shù)和生物工程(Biotechnology and Bioengineering) ,95:76-83所描述,其披露內(nèi)容通過引用^其全文結(jié)合在此。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員應(yīng)了解,可使用任何適合的膠囊化材料或基體??墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方 法和技術(shù)來實現(xiàn)膠囊化。除了這些微生物,膠囊化的微生物可包括營養(yǎng)物質(zhì)或組合物的其 他組分。
[0079] 可將在此披露的組合物直接或間接地施用或給予至需要處理的任何植物或動物。 在向植物施用的情況下,可將組合物施用到植物部分(如葉)或種子上,或可替代地,可施用 到其中這些植物生長或?qū)⒁L、或其中已經(jīng)播撒或?qū)⒁ト龇N子的上壤中??蒞通過任 何適合的手段進(jìn)行施用并且可^任何適合的規(guī)模施用。例如,施用可包括傾倒、噴涂或噴 霧,包括大規(guī)?;蚺繃娡炕驀婌F、在種植之前浸泡種子、和/或在種植之后浸潤種子或幼 苗。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解,多種施用手段可組合使用(例如在種植之前浸泡種子,然后 浸潤已種植的種子和/或施用到幼苗或成熟植株上)。種子、幼苗或成熟植株可W根據(jù)需要 處理多次。所需的施用數(shù)量可W由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)W下各項容易地確定:例如,所討 論的植物、待治療的病原體或病害、治療開始時植物的發(fā)育階段、植物的健康狀態(tài)、生長、植 物生長的環(huán)境和/或氣候條件、W及生長植物的目的。
[0080] 因此,根據(jù)本披露,在此披露的組合物可制備為任何適合的形式,取決于將組合物 施用到±壤或植物種子或植物營養(yǎng)生長部分上所借助的那些手段。適合的形式可包括例如 漿液、液體、W及固體形式。固體形式包括粉劑、顆粒體、較大的微粒形式W及球粒。固體形 式可被膠囊化在水溶性包衣中(例如染色或未染色的明膠球體或膠囊)、延長釋放包衣中, 或者使用例如明膠、聚乙締醇、乙基纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、或苯乙締馬來酸酢中 的一種或多種通過微膠囊被膠囊化為一種自由流動的粉末。液體可包括水性溶液和水性懸 浮液、W及乳油。
[0081] 為了實現(xiàn)在此披露的組合物的有效分散、粘附和/或在環(huán)境中的保存或穩(wěn)定性,將 運(yùn)些組合物與適合的有助于分散、粘附W及保存/穩(wěn)定性的載體組分一起配制可W是有利 的。適合的載體應(yīng)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的并且包括例如殼聚糖、賠石、堆肥、滑石粉、乳 粉、凝膠等。
[0082] 可W將另外的組分滲入本披露的組合物中,如腐殖物質(zhì)、痕量元素、有機(jī)材料、滲 透劑、宏量營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素 W及其他±壤和/或植物添加劑。
[0083] 可W滲入的腐殖質(zhì)或腐殖物質(zhì)可包括但不限于源自例如氧化褐煤或風(fēng)化褐煤的 腐殖酸、富里酸W及腐殖酸鹽如腐殖酸鐘。
[0084] 所添加的有機(jī)材料可包括但不限于生物固體、動物糞肥、堆肥或堆肥有機(jī)副產(chǎn)物、 活性污泥或經(jīng)過加工的動物或植物副產(chǎn)品(包括血粉、羽毛粉、棉巧粉、海洋海帶粉、海藻提 取物、魚精W及魚粉)。
[0085] 滲透劑包括但不限于非離子潤濕劑、基于去污劑的表面活性劑、娃酬和/或有機(jī)娃 酬。適合的滲透劑應(yīng)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的,非限制性例子包括聚合的聚氧化締、阿洛 醇(allinol)、壬苯醇酸、辛苯聚醇、氧基嘉實多(oxycastrol)、曲通(TRITON)、吐溫 (TWEEN)、娃酬樹脂(Sylgard)309、喜威(511巧日*化-77、^及和博克斯化日&姑)(娃酬/表面 活性劑共混物)。
[0086] 包含在組合物中的示例性痕量元素在實例3中提供。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn) 識到,適合的痕量元素不限于此,并且可W使用任何痕量元素(天然的或合成的)。
[0087] 可W添加到本披露的組合物的任選的另外的±壤和/或植物添加劑包括,例如,水 捕獲劑如沸石、酶、植物生長激素如赤霉素、W及有害生物控制劑如殺蛾劑、殺昆蟲劑、殺真 菌劑W及殺線蟲劑。
[0088] 可W冷凍干燥本披露的組合物,包括包含膠囊化菌株的組合物,W延長存放期和/ 或有助于農(nóng)業(yè)應(yīng)用如田間分散。
[0089] 在本說明書對任何現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或任何已知素材的引用都不 會且不應(yīng)被視為承認(rèn)或認(rèn)可或W任何形式暗示該現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或已知 素材構(gòu)成本說明書設(shè)及的所努力領(lǐng)域內(nèi)的一般常識的一部分。
[0090] 現(xiàn)在將參照W下具體實例描述本披露,所述實例不應(yīng)當(dāng)解釋為W任何方式限制本 發(fā)明的范圍。 實例
[0091] W下實例示意本發(fā)明并且不應(yīng)當(dāng)解釋為W任何方式限制貫穿本說明書而描述的 披露內(nèi)容的一般性質(zhì)。 實例1-微生物菌株和菌株組合
[0092] W下微生物菌株和菌株組合用于在此描述的實驗。
[0093] 帕氏乳酸桿菌LplS分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與具有危害等級1 (TRBA)的帕氏乳酸桿菌AB 262735具有100 %相似性。當(dāng)在34°C下在MRS培養(yǎng)基上無氧培養(yǎng)3 天時,LplS產(chǎn)生奶油狀、圓形、具輕微光澤、凸面的菌落,直徑為^2111111(兼性厭氧菌)。其微觀 形態(tài)是革蘭氏陽性、不動的、短柱狀矩形、大部分為二倍體。帕氏乳酸桿菌LplS是于2011年 10月27日W檢索號V11/022945保藏在澳大利亞國家計量研究院。
[0094] 布赫納氏乳酸桿菌化23分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與具有危害等 級1 (TRBA)的布赫納氏乳酸桿菌AB 429368具有99 %相似性。當(dāng)在34°C下在MRS培養(yǎng)基上無 氧培養(yǎng)4天時,化23產(chǎn)生奶油狀、有光澤的、凸面的菌落,直徑為^21111]1(兼性厭氧菌)。其微觀 形態(tài)是革蘭氏陽性、不動的、鏈柱狀。布赫納氏乳酸桿菌化23是于2011年10月27日W檢索號 V11/022946保藏在澳大利亞國家計量研究院。
[0095] 瑞氏乳酸桿菌Lr24分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與具有危害等級1 (DSMZ)的瑞氏乳酸桿菌AB 366389具有99%相似性。當(dāng)在34°C下在MRS培養(yǎng)基上無氧培養(yǎng)4 天時,Lr24產(chǎn)生奶油狀、圓形、有光澤的的菌落,直徑為0.5mm(兼性厭氧菌)。其微觀形態(tài)是 革蘭氏陽性、不動的、短柱狀的單或二倍體。瑞氏乳酸桿菌Lr24是于2011年10月27日W檢索 號V11/022947保藏在澳大利亞國家計量研究院。
[0096] API?'50CH條(生物梅里埃(Biomerieux))的發(fā)酵結(jié)果顯示Lr24僅使k阿拉伯糖、 D-核糖、D-木糖、D-果糖W及屯葉靈巧樣酸鐵發(fā)酵。
[0097] 玉米乳酸桿菌Lz26分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與具有危害等級1 (TRBA)的玉米乳酸桿菌AB 008213.1具有99%相似性。當(dāng)在34°C下在MRS培養(yǎng)基上無氧培養(yǎng) 48小時時,Lz26產(chǎn)生白色、圓形、有光澤的、凸面的菌落,直徑為1mm(兼性厭氧菌)。其微觀形 態(tài)是革蘭氏陽性、不動的、短柱狀,幾乎全為球菌狀二倍體W及一些鏈狀。玉米乳酸桿菌 Lz26是于2011年10月27日W檢索號V11/022948保藏在澳大利亞國家計量研究院。
[0098] APr.WCH條(生物梅里埃)的發(fā)酵結(jié)果顯示Lz26使D-阿拉伯糖、D-核糖、D-側(cè)金盞 花醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖a-鼠李糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、D-甘露醇、D-山梨 醇、N-乙酷葡糖胺、苦杏仁巧、熊果巧、屯葉靈巧樣酸鐵、水楊巧、D-纖維二糖、D-乳糖、D-海 藻糖、D-松=糖、龍膽二糖、D-松二糖、D-塔格糖、1^-巖藻糖阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鐘W及 2-酬葡糖酸鐘。
[0099] 法伯爾醋酸菌Af 15分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與具有危害等級1 (DSMZ)的法伯爾醋酸菌AM 905849具有100%相似性。當(dāng)在34°C下在麥芽提取物培養(yǎng)基上培 養(yǎng)3天時,AF15產(chǎn)生不透明物狀、圓形、有光澤的、凸面的菌落,直徑為1 mm(需氧的)。其微觀 形態(tài)是革蘭氏陰性、柱狀單或二倍體。法伯爾醋酸菌Af 15是于2011年10月27日W檢索號 Vll/022943保藏在澳大利亞國家計量研究院。
[0100] 嗜酒假絲酵母Ce31分離自環(huán)境來源。部分16S rRNA測序表明其與嗜酒假絲酵母 AB534618具有89%相似性。當(dāng)在%°0下在麥芽提取物培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天時,Ce31產(chǎn)生奶油 狀、扁平的、暗淡的、略圓的菌落,直徑為2-3mm(需氧的)。其微觀形態(tài)是出芽、卵形酵母。嗜 酒假絲酵母Ce31是于2011年10月27日W檢索號V11/022944保藏在澳大利亞國家計量研究 院。
[0101] 在此描述的實驗中使用的其他菌株為:于2012年12月14日W檢索號V12/022847保 藏在澳大利亞國家計量研究院的迪氏乳酸桿菌(N3);于2012年12月14日W檢索號V12/ 022848保藏在澳大利亞國家計量研究院的帕氏乳酸桿菌(Nil);于2012年12月14日W檢索 號V12/022851保藏在澳大利亞國家計量研究院的短乳酸桿菌(TD);于2012年12月14日W檢 索號V12/022849保藏在澳大利亞國家計量研究院的在此命名為'T9'的菌株;W及于2012年 12月14日W檢索號V12/022850保藏在澳大利亞家計量研究院的在此命名為'TB'的菌株。
[0102] 于2012年12月14日W檢索號V12/022850保藏在澳大利亞家計量研究院的在此命 名為'TB'的菌株與干酪乳酸桿菌具有31.5%的全基因組整體相似性,如通過小16S核糖體 RNA(rRNA)序列的SILVA BLAST比對捜索所確定的(夸斯特(Quast)等人,2013,SILVA核糖體 RNA基因數(shù)據(jù)庫計劃:改進(jìn)的數(shù)據(jù)處理和基于網(wǎng)絡(luò)的工具(The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools),核酉《石開究 (Nucl. Acid Res.),41 (D1):D590-596)。A!)r 50CH條(生物梅里埃)的發(fā)酵結(jié)果顯示TB使D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甲基-地-化喃甘露糖巧、甲基-地-化喃葡萄糖巧、N-乙酷葡糖胺、苦杏仁巧、熊果巧、屯葉靈巧樣酸鐵、水楊巧、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、 薦糖、D-松S糖、D-棉子糖、龍膽二糖、D-塔格糖W及葡萄糖酸鐘。
[0103] 于2012年12月14日W檢索號V12/022849保藏在澳大利亞家計量研究院的在此命 名為' T9 '的菌株與類干酪乳酸桿菌具有95.3 %的全基因組整體相似性,如通過SILVA BLAST比對捜索所確定的。APr 50CH條(生物梅里埃)的發(fā)酵結(jié)果顯示T9使D-核糖、D-半乳 糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-山梨醇、甲基-aD-化喃葡萄糖巧、N-乙酷葡糖 胺、苦杏仁巧、熊果巧、屯葉靈巧樣酸鐵、水楊巧、D-纖維二糖、D-麥芽糖、薦糖、D-海藻糖、菊 糖、龍膽二糖、D-松二糖、D-塔格糖阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鐘W及2-酬葡糖酸鐘。
[0104] W上描述的微生物菌株的W下組合用于下文描述的實驗。
[0105] 在下文被稱為乂 L組合物'的組合物包含六種W上所述的微生物菌株(即法伯爾醋 酸菌Af 15、帕氏乳酸桿菌Lpl8、布赫納氏乳酸桿菌化23、瑞氏乳酸桿菌Lr24、玉米乳酸桿菌 Lz26、W及嗜酒假絲酵母Ce31),每種乳酸桿菌菌株的終濃度為2.5 X IO5C化/ml、嗜酒假絲 酵母Ce31的終濃度為1.0 X 105cfu/ml、并且法伯爾醋酸菌Af 15的終濃度為1.0 X 106cfu/ml。
[0106] 在下文被稱為'混合液G'的組合物包含=種W上所述的微生物菌株,具體地是玉 米乳酸桿菌Lz26、菌株TB(NMI檢索號V12/022850)W及T9(NMI檢索號V12/022849)。將新鮮 的細(xì)菌培養(yǎng)株添加到2%痕量元素、0.3%腐殖質(zhì)、4%糖蜜W及水的混合液中,對應(yīng)的終濃 度為1 X l〇7cfu/ml的玉米乳酸桿菌Lz26、l X l〇7c化/ml的TB、W及1 X l〇7cfu/ml的T9。用憐 酸將組合物調(diào)節(jié)到pH 3.8-4.2。
[0107] 在下文被稱為'混合液I'的組合物包含五種W上所述的微生物菌株,具體地是玉 米乳酸桿菌Lz26、布赫納氏乳酸桿菌化23、帕氏乳酸桿菌Lpl8、嗜酒假絲酵母Ce31、W及法 伯爾醋酸菌Af 15。將新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)株添加到2%痕量元素、0.3%腐殖質(zhì)、4%糖蜜W及水 的混合液中,對應(yīng)的終濃度為1 X IO7C化/ml的玉米乳酸桿菌Lz26、1 X IO7C化/ml的布赫納氏 乳酸桿菌化23、1 X 107cfu/ml的帕氏乳酸桿菌Lpl8、1 X 105cfu/ml的嗜酒假絲酵母Ce31、W 及1 X 106Cfu/ml的法伯爾醋酸菌Af 15。用憐酸將組合物調(diào)節(jié)到pH 3.8-4.2。
[0108] 在下文被稱為'混合液2'的組合物包含五種W上所述的微生物菌株,具體地是玉 米乳酸桿菌Lz26、帕氏乳酸桿菌Lpl8、布赫納氏乳酸桿菌化23、瑞氏乳酸桿菌Lr24、W及法 伯爾醋酸菌Af 15。將新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)株添加到2%痕量元素、3%糖蜜W及反滲透(RO)水的 無菌混合液中,對應(yīng)的終濃度為1 X IO7C化/ml的玉米乳酸桿菌Lz26、l X IO6C化/ml的帕氏乳 酸桿菌Lp 18、1 X IO6Cfu/ml的布赫納氏乳酸桿菌化23、1 X IO6Cfu/ml的瑞氏乳酸桿菌Lr24、 W及1 X IO6CfVml的法伯爾醋酸菌Af 15。
[0109] 在下文被稱為'混合液3'的組合物包含四種W上所述的微生物菌株,具體地是玉 米乳酸桿菌Lz26、帕氏乳酸桿菌Lpl8、布赫納氏乳酸桿菌化23、^及瑞氏乳酸桿菌1'24。將 乳酸桿菌屬的新鮮培養(yǎng)株添加到3%糖蜜和反滲透水的無菌混合液中,對應(yīng)的終濃度為1 X IO7C化/ml的玉米乳酸桿菌Lz26、1 X IO6Cfu/ml的帕氏乳酸桿菌Lp 18、1 X 106cfu/ml的布赫 納氏乳酸桿菌化23、W及1 X IO6C化/ml的瑞氏乳酸桿菌Lr24。 培養(yǎng)株的維持
[0110] 由每種分離株制備30%甘油原種并且維持在-80°C