一種兩性離子納米顆粒的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有兩性離子特性的納米顆粒 的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥被認為是僅次于心腦血管的致使人死亡的主要原因。目前，治療癌癥的重要 的方法化療。但該法有很多缺陷，許多抗癌藥物都存在著難溶于水、穩(wěn)定性差等缺點，且不 僅對癌細胞有殺滅作用，對正常細胞的也有較大的毒副作用。且易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)進行清 除，造成細胞吸收差。
[0003] 智能納米載藥體系給癌癥治療帶來了新的希望。納米體系能夠增強滲透性和停留 (EPR)效應(yīng)，并能躲過人體的網(wǎng)狀內(nèi)皮質(zhì)系統(tǒng)的識別和捕獲，延長了載藥系統(tǒng)在血液中的循 環(huán)時間，提高了藥物的生物利用度。同時，利用癌細胞與正常細胞的區(qū)別(癌細胞的PH較低， 癌細胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽的含量較正常細胞高，癌細胞的細胞膜表面有過量產(chǎn)生的受 體，如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白）能夠迅速的將藥物釋放到腫瘤部位。
[0004] 目前，制備納米顆粒的廣泛使用的親水部分為聚乙二醇(PEG)，但是近年來研究認 為:PEG除了親水性之外還具有一定的疏水性，在氧和過渡金屬離子存在下被氧化;PEG修飾 的蛋白質(zhì)藥物可能的免疫反應(yīng)也被觀察到；另外納米膠束的PEG外殼屏蔽作用，不利于納米 膠束細胞內(nèi)的攝取。而且，PEG修飾的納米顆粒缺少活性靶向的反應(yīng)性基團。
[0005] 作為PEG的替代品兩性離子表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，比如超親水性、高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以 及極好的"隱形"作用。然而與此同時也存在一些缺陷，最為突出的問題就是制備兩性離子 聚合物的原材料是非生物降解型的。而這將產(chǎn)生一系列的問題，如聚合物的降解的殘余部 分會導(dǎo)致藥物的不完全釋放以及產(chǎn)生不良的副反應(yīng)。另外，制備兩性離子納米顆粒的方法 是復(fù)雜的且說需時間較長。因而成為此類材料實際應(yīng)用的瓶頸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決這些缺陷，本研究設(shè)計的目的是一種可生物降解的具有pH和還原敏感性的 兩性粒子納米顆粒的制備。
[0007] 本發(fā)明提供了一種可還原降解的兩性離子納米顆粒，包含有丁二酸酐、葡聚糖和 胱胺合成的兩性離子納米顆粒，其中葡聚糖是可生物降解的多糖，具有大量的反應(yīng)性基團、 可控的分子量、生物可降解特性、生物兼容性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。為了使該納米顆粒具有PH 和還原敏感性，制備過程中，引入丁二酸酐，是葡聚糖具有不同程度的羧基并與胱胺結(jié)合， 其中葡聚糖和丁二酸酐的質(zhì)量比為100:25~400,羧化的葡聚糖和胱胺的質(zhì)量比為1:0.2~ 3。因而通過設(shè)計丁二酸酐和胱胺的質(zhì)量來控制納米顆粒的粒徑。
[0008] 本發(fā)明還提供一種可還原降解聚兩性離子納米膠束的制備方法，依次包括以下步 驟：
[0009] (1)不同質(zhì)量比例的葡聚糖和丁二酸酐在催化劑的作用下進行羧化反應(yīng)。反應(yīng)溶 劑為二甲亞砜。
[0010] (2)不同質(zhì)量比例的羧化后的葡聚糖和胱胺二鹽酸鹽在催化劑的作用下進行酰胺 化反應(yīng)。反應(yīng)所需溶劑為二甲亞砜。
[0011] (3)將步驟(2)制備的產(chǎn)物經(jīng)過純化干燥后溶解。溶解所需的溶劑為二甲亞砜。
[0012] (4)持續(xù)攪拌后，向溶液中滴加超純水。
[0013] (5)將步驟(4)所得的溶液進行透析。
[0014] 具體的，所述步驟(1)中羧化反應(yīng)所需的催化劑為4-二甲氨基吡啶。
[0015] 具體的，所述步驟(1)中反應(yīng)在氮氣保護下60°C反應(yīng)24h。
[0016] 具體的，所述步驟(1)中，質(zhì)量比為100:25~400。
[0017]具體的，所述步驟(2)中酰胺化反應(yīng)催化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞 胺鹽酸鹽和1-羥基苯并三唑。
[0018] 具體的，所述步驟(2)中反應(yīng)在氮氣保護下25°C反應(yīng)24h。
[0019] 具體的，所述步驟(2)中，質(zhì)量比為1:0.2~3。
[0020]具體的，所述步驟(5)中，透析所用截留分子量為3500的透析袋，透析處理不少于 48小時，得到兩性離子納米顆粒。透析袋的目的在于除去未反應(yīng)的小分子和低聚物，選擇 3500的可達到目的
[0021] 本發(fā)明還提供一種生物可降解的具有pH和還原敏感性兩性離子納米顆粒，在制備 化療藥物載體中的應(yīng)用。正常細胞與癌細胞的pH的不同（血液pH為7.4，溶酶體和內(nèi)涵體pH 為5-6)，藥物可盡可能的釋放到靶向位點。另外，谷胱甘肽在腫瘤細胞內(nèi)的濃度比在體液內(nèi) 高100到1000倍。載藥納米顆粒進入腫瘤細胞內(nèi)，在谷胱甘肽的還原作用下，聚合物發(fā)生降 解，釋放出藥物。
[0022] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：
[0023] 1.由于該納米顆粒同時含有氨基、羧基和雙硫鍵等結(jié)構(gòu)單元，具有靈敏的pH和還 原響應(yīng)性，在腫瘤細胞內(nèi)部環(huán)境下（弱酸性和還原性），納米顆粒結(jié)構(gòu)易斷裂，促使藥物釋 放；
[0024] 2.納米顆粒中的含有氨基和羧基，使其具有了兩性離子性能，賦予納米顆粒優(yōu)異 的抗蛋白質(zhì)非特異吸附性能；
[0025] 3.所用的材料可生物降解，該納米顆粒引入雙硫鍵，納米顆粒進入腫瘤細胞后，在 高濃度谷胱甘肽的刺激下斷裂，藥物可完全釋放，作為抗癌藥物載體具有實際的應(yīng)用價值；
[0026] 4.納米膠束無細胞毒性，滿足人體使用的安全性標準；
[0027] 5.該納米顆粒含有大量羧基，可通過靜電作用與抗癌藥物阿霉素，載藥量較高。
[0028] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒的合成路線
[0030] 圖2為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒的透射電鏡照片（&:〇61/3六1-〇2;13 :〇61/3八1-04;c:Dex/SAl-07;d:Dex/SAl-15;e:Dex/SAl-30);
[0031 ]圖3為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒在不同pH值溶液中的Zeta電位和粒徑的變化；
[0032] 圖4為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒在不同濃度的二硫蘇糖醇(DTT)溶液中、不同時 間下的粒徑變化(樣品為:Dex/SAl-02);
[0033] 圖5為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒的抗牛血清白蛋白的非特異吸附性能；
[0034]圖6為本發(fā)明中兩性離子納米顆粒的細胞毒性結(jié)果。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實施例1 [0037] 1)葡聚糖的羧化：
[0038]將0.500g葡聚糖溶解于4mL干燥好的二甲亞砜中，之后將其轉(zhuǎn)入事先干燥好的燒 瓶中，加入往燒瓶中加入0.5mL二甲亞砜溶解的4-二甲氨基吡啶，接著加入1.0 mL二甲亞砜 溶解好的丁二酸酐，反應(yīng)在氮氣環(huán)境下60°C反應(yīng)24h。產(chǎn)物用冷乙醇提取，用乙醇洗滌幾次， 最后在真空干燥箱中干燥。具體使用過程中根據(jù)納米膠束不同取代度的需要，調(diào)節(jié)葡聚糖 和丁二酸酐的質(zhì)量的配比。
[0039] 表1葡聚糖改性配方一覽表
[0041] 2)葡聚糖/ 丁二酸酐與胱胺的酰胺化反應(yīng)：
[0042] 葡聚糖/ 丁二酸酐（IOOmg)添加到5. OmL含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽(2.68mg)和1-羥基苯并三挫(4.05mg)二甲亞砜中，用磁力攪拌器在800rpm下攪拌 3h。隨后，含有20mg的胱的3mL的二甲亞砜溶液逐滴滴入到上述溶液中，在室溫下反