[0051]A.修復(fù)后小鼠頭蓋骨的X射線觀察；
[0052]B.修復(fù)后小鼠頭蓋骨的微型CT掃描圖譜；
[0053]C.微型CT掃描的定量分析
[0054]圖6為生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合材料與新鮮骨髓復(fù)合后修復(fù)小鼠頭蓋骨修復(fù)后的組織學(xué)觀察:
[0055]A.Von-Kassa 染色(骨I丐沉積);
[0056]B.MASSON三色染色法；
[0057]C.蘇木精一伊紅染色法。
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。
[0059]實(shí)施例1:生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合材料的制備及表征
[0060]1)取經(jīng)過Co60伽馬射線滅菌的豬皮脫細(xì)胞去抗原后的微纖維狀生物組織基質(zhì)材料，以10毫克/毫升的濃度懸浮于0.9%生理鹽水中；
[0061]2)用無菌去離子水清洗三次以上，所制備的脫細(xì)胞基質(zhì)微纖維參數(shù)如圖1所示，其平均長(zhǎng)寬比為0.05-0.95，其粒徑分布為40-1000微米；
[0062]3)取磷酸氫鈣微顆粒，加入無菌去離子水，制備成10毫克/毫升的均勻懸濁液
[0063]4)將磷酸氫鈣微顆粒迅速通過粒徑40微米的濾膜，除去其中過大的團(tuán)聚顆粒；
[0064]5)將懸濁液在1200rpm離心2分鐘，去除上清液；
[0065]6)在lg磷酸氫鈣微顆粒內(nèi)加入0.5毫升無菌去離子水，反復(fù)漩渦震蕩及攪拌，制備成糊狀物；
[0066]7)以脫細(xì)胞微纖維基質(zhì)與磷酸氫鈣微顆粒的質(zhì)量比為4:6的比例，將磷酸氫鈣微顆粒加入脫細(xì)胞微纖維基質(zhì)內(nèi)；
[0067]8)置于渦旋混合器上充分混合一個(gè)小時(shí)，使二者混合均勻；
[0068]9)在1200rpm下離心2分鐘，去除上清液；
[0069]10)在4重量份脫細(xì)胞基質(zhì)微纖維及6重量份磷酸氫鈣微顆粒內(nèi)，加入2重量份的無菌生理鹽水；
[0070]11)充分?jǐn)嚢韬?，獲得可注射的復(fù)合材料，如圖2所示，可以用標(biāo)準(zhǔn)注射器將該材料應(yīng)用于患者傷處；
[0071]12)復(fù)合材料以糊狀物形態(tài)保存，其微觀結(jié)構(gòu)如圖3所示，掃描電鏡照片表明磷酸氫鈣微顆粒非常均勻地分布于脫細(xì)胞基質(zhì)微纖維的周圍，沒有發(fā)生明顯團(tuán)聚；其外，高放大倍數(shù)照片顯示，脫細(xì)胞基質(zhì)由大量膠原蛋白纖維構(gòu)成，并且膠原蛋白完整保持了其天然的三螺旋結(jié)構(gòu)，并且成束狀分布于復(fù)合材料內(nèi)。
[0072]實(shí)施例2:生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合可注射材料的骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)
[0073]用此發(fā)明所制備的可注射的生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合材料，以無胸腺裸鼠的頭骨缺損模型來評(píng)估該材料的骨缺損修復(fù)能力。小鼠(6例)麻醉后，剃去頭部皮毛，在頭頂開一個(gè)1厘米的口子，撥開皮膚后，用牙科鉆頭在頭蓋骨上打一個(gè)直徑3.5毫米的原型缺損；用本發(fā)明制備的材料將骨缺損填充滿后，將傷口縫合；六周后，人道犧牲小鼠，肉眼觀察修復(fù)后頭蓋骨發(fā)現(xiàn)，材料和周圍骨組織復(fù)合良好，X射線觀測(cè)表明在缺損處有大量骨組織形成；骨缺損的橫切面用組織學(xué)切片觀察，發(fā)現(xiàn)骨缺損處被細(xì)胞填滿，并通過骨鈣染色表明，有大量骨鈣在缺損處沉積，骨缺損在很大程度上得到修復(fù)，見圖4，本實(shí)施例是第一次實(shí)現(xiàn)僅通過生物材料，而不添加任何生物活性因子或干細(xì)胞的大面積骨缺損修復(fù)。
[0074]實(shí)施例3:生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合可注射材料作為新鮮骨髓載體的骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)
[0075]將實(shí)例1制備的可注射的生物組織基質(zhì)/磷酸氫鈣復(fù)合材料與新鮮提取的小鼠全骨髓混合，調(diào)制成糊狀材料；使用實(shí)例2中所使用小鼠模型，將混合小鼠全骨髓的混合復(fù)合材料填充骨缺損，然后縫合傷口 ；六周后，X射線觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)原型骨缺損已被新形成的骨組織填滿，沒有在骨缺損邊緣發(fā)現(xiàn)任何組織間隙。微型CT掃描圖譜顯示同樣結(jié)果，整個(gè)骨缺損已被新形成的骨組織填充，并在新骨和自體骨之間形成無縫連接。骨形成定量分析表明，實(shí)施例1制備的材料可以形成遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于Healos產(chǎn)品的骨量，并且其骨密度更接近于自體骨組織(圖5)。組織學(xué)觀察表明，整個(gè)骨缺損已被鈣化的骨組織所連接，大量骨小梁已經(jīng)形成；Mass0n三色染色說明大量膠原蛋白沉積于骨缺損處，并發(fā)現(xiàn)有成骨細(xì)胞在新骨表明，參與新骨形成。蘇木精一伊紅染色法的結(jié)果與前面兩種染色得到的結(jié)論一致，并且沒有在骨缺損周圍發(fā)現(xiàn)有纖維組織形成，新骨和自體骨以之間為骨連接，使得本實(shí)例所展示的修復(fù)方法為一種可行的臨床策略。
[0076]上述僅對(duì)本發(fā)明中的幾種具體實(shí)施例加以說明，但并不能限定為本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是依據(jù)本發(fā)明中的設(shè)計(jì)精神所作出的等效變化或修飾，均應(yīng)認(rèn)為落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于，包括以下重量份數(shù)的原料:1-7份的生物組織基質(zhì)材料、1-9份的生物陶瓷和2-8份的生理鹽水或其他等滲水溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于:所述生物組織基質(zhì)材料為由哺乳動(dòng)物軟組織制備的、以膠原纖維為主的、保持其天然交聯(lián)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于:所述哺乳動(dòng)物的軟組織為豬的軟組織、牛的軟組織或人體的軟組織；所述軟組織包括皮膚、真皮、血管、隔膜、肌腱、韌帶、大腸、小腸和神經(jīng)組織。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于:所述生物組織基質(zhì)材料呈微纖維狀，微纖維狀的所述生物組織基質(zhì)材料的直徑為1-1500微米，微纖維狀的所述生物組織基質(zhì)材料的直徑和長(zhǎng)度的比值分布區(qū)間為0.05-0.95。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于:用生物玻璃、含鍶、鋅、鎂、或者硅的礦物質(zhì)或含鍶、鋅、鎂、或者硅的鹽代替所述生物陶瓷作為增強(qiáng)相所用材料；所述生物陶瓷為羥基磷灰石、α -磷酸三鈣、β -磷酸三鈣、磷酸氫鈣、二水合磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、硫酸鈣或碳酸鈣。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，其特征在于:所述生物陶瓷以顆粒形式分布于所述生物組織基質(zhì)材料內(nèi)，生物陶瓷顆粒在所述生物組織基質(zhì)材料內(nèi)形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中陶瓷顆粒的粒徑為1-500微米。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)微纖維狀的生物組織基質(zhì)材料的制備，包括以下步驟: 1.1)收集組織原材料，清洗血污后，切割成寬為0.5-2厘米、長(zhǎng)為4-8厘米的長(zhǎng)條狀，_20°C保存； 1.2)消毒滅菌:組織原材料使用質(zhì)量濃度為0.1%氨水溶液滅菌，將組織原材料浸泡于溶液中緩慢搖動(dòng)6-36小時(shí)；并用無菌去離子水充分清洗，然后用無菌生理鹽水漂洗； 1.3)組織破碎:將消毒過的組織原材料用研磨器粉碎，打勻； 1.4)采用脫細(xì)胞液脫去細(xì)胞后，采用脫氧核糖核酸酶溶液脫去剩余脫氧核糖核酸；并采用α -半乳糖苷去除液脫去α -半乳糖苷；采用雙氧水，乙酸和過氧乙酸的混合溶液進(jìn)行病毒滅活； 1.5)組織基質(zhì)清洗:用質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水對(duì)步驟1.5)的產(chǎn)物清洗三遍以上，去除步驟1.4)處理產(chǎn)生的殘余物； 1.6)清洗:將步驟1.5)的產(chǎn)物用無菌去離子水清洗三次以上； 1.7)終端滅菌:采用Co60伽瑪射線、X射線或者電子束進(jìn)行滅菌，將得到的生物組織基質(zhì)微纖維密封于密閉容器內(nèi)保存，生物組織基質(zhì)材料保存于pH值中性的緩沖液內(nèi)，所述緩沖液包括生理鹽水和磷酸緩沖液； 2)生物陶瓷微顆粒的制備，包括以下步驟: 2.1)生物陶瓷根據(jù)具體應(yīng)用，經(jīng)機(jī)械粉碎，高速球磨，以及過篩步驟后，得到粒徑在0.1-500微米范圍的生物陶瓷顆粒，再經(jīng)高溫高壓消毒，除菌及殺滅病毒； 2.2)將生物陶瓷微顆粒與無菌生理鹽水以1:1到1:5的比例混合，并經(jīng)充分?jǐn)嚢杓罢鹗帲纬删鶆虻膽覞嵋海? 3)將步驟1.7)得到的生物組織基質(zhì)微纖維懸濁在1-5倍重量的生理鹽水中，充分搖勻，形成均勻的生物組織基質(zhì)微纖維懸濁液； 4)按權(quán)利要求1所述的原料配比，將生物陶瓷顆粒與生物組織基質(zhì)微纖維混合； 5)將混合物置于渦旋混合器上充分混合一個(gè)小時(shí)，直至生物陶瓷顆粒完全吸附于生物組織基質(zhì)微纖維上； 6)用離心法以200?lOOOOrpm轉(zhuǎn)速去除多余水分，并使混合物以固態(tài)方式沉積于底部； 7)加入1-5倍混合物重量的生理鹽水，置于渦旋混合器上形成均勻的流體狀混合物，其中水分含量的質(zhì)量百分比為20-80% ； 8)終端滅菌:將得到的流體狀混合物密封于密閉容器內(nèi)保存，用伽瑪射線、X射線或者電子束進(jìn)行滅菌。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料的制備方法，其特征在于:所述步驟1.4)所述脫細(xì)胞溶液為每升含1-10%脫氧膽酸鈉、2-15mM乙二胺四乙酸以及10_50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸，所述脫細(xì)胞溶液pH值為6.8-7.2 ;所述脫氧核糖核酸酶溶液每升含0.5-5毫克脫氧核糖核酸酶、10-50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸、l_20mM氯化鈣以及l(fā)_20mM氯化鎂；所述α -半乳糖苷去除液為每升含0.2-10毫克α -半乳糖苷酶、2_40mM 4_羥乙基哌嗪乙磺酸，所述α-半乳糖苷去除液pH值為5.0-7.5 ;所述用病毒滅活的溶液為濃度為0.10%雙氧水、0.50%乙酸和0.50%過氧乙酸的混合溶液。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料的制備方法，其特征在于:用于分散生物陶瓷顆粒和生物組織基質(zhì)材料的溶液用血液、骨髓或高濃度血小板血漿替代所述步驟7)中的生理鹽水。10.一種向骨缺損處輸送干細(xì)胞的方法，其特征在于:將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或者提取自血液的干細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，再與權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所獲得的骨修復(fù)用復(fù)合材料混合，作為一種向骨缺損處輸送干細(xì)胞的方式。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可注射的骨修復(fù)用復(fù)合材料，該復(fù)合材料以生物組織材料和生物陶瓷有機(jī)結(jié)合，形成一種具有三維支架功能的可注射用醫(yī)學(xué)材料。本發(fā)明所涉及的生物組織材料基質(zhì)為天然交聯(lián)結(jié)構(gòu)的微纖維，無需額外涉及物理或化學(xué)交聯(lián)，生物相容性優(yōu)良，并且可以在體內(nèi)被緩慢完全降解。生物組織材料和生物陶瓷可以用多種方式結(jié)合。該復(fù)合材料中，作為增強(qiáng)相的生物陶瓷與生物組織材料結(jié)合后，可以為體內(nèi)骨組織再生提供良好的模板，能有效地誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)。本發(fā)明制備的可注射材料，可以用以無縫填充任何尺寸的骨缺損，并在過程中添加包括骨髓在內(nèi)的生物制劑，進(jìn)一步增強(qiáng)其生物活性。因此，該材料可廣泛用于由于創(chuàng)傷，腫瘤切除，骨壞死及感染等造成的骨缺失。
【IPC分類】A61L27/50, A61L27/46, A61L27/44
【公開號(hào)】CN105311681
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510891068
【發(fā)明人】俞春華, 廖化
【申請(qǐng)人】俞春華
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日