°C，5% 0)2下，將抗原-致敏的DC與新鮮自體PBMC(6)以1:10的比例在 具有10%自體血清、10IU/mL IL-2和5ng/mL IL-7的RPMI-1640中共培養(yǎng)。每周一次加 入輻照的自體PBMC飼養(yǎng)細胞和重組CTA (50 y g/mL)，并且每三天加入一次IL-2。重組 CTA無內(nèi)毒素，如通過ToxinSensor Chromogenic LAL內(nèi)毒素分析試劑盒（GenScript USA Inc.，08854, NJ)進行的內(nèi)毒素檢測分析所證實的。
[0047] 為了測試CTA-刺激的T細胞的細胞毒活性，本發(fā)明人使用DELFIA?EuTDA系統(tǒng) (Perkin Elmer，USA)，根據(jù)制造商的指示進行了基于銪的細胞毒性分析。靶細胞包括自體 DC (未使用肺癌不相關的HPV-E/抗原刺激或致敏）和自體腫瘤細胞（效應細胞-靶細胞比 例為 40:1、20:1 或 10:1)。針對 HLA I 類（W6/32)和 HLA II 類（L243)的抗體以 25 y g/mL 的濃度加入以評價HLA限制性細胞毒性，效應細胞：靶細胞比例固定為20:1。
[0048] 對活化PBMC和自體腫瘤細胞4小時共培養(yǎng)物（20:1的效應細胞：靶細胞 比）的上清液進行ELISA。根據(jù)制造商的說明，使用U-CyTech夾心ELISA試劑盒 (U_CyTech，Utrecht，The Netherlands)檢測人 IL_4、IL_5、IL-10、干擾素（IFN)-y 和腫瘤 壞死因子a (TNF)-a。通過加入TMB微孔底物進行反應，通過加入2M H2SOJf止反應。在 450nm下讀取吸光度。數(shù)據(jù)顯示為使用活化PBMC測量的OD除以使用在無抗原的情況下使 用自體DC孵育的PBMC獲得的OD (0D比）。
[0049] 如本發(fā)明人在別處所述，根據(jù)制造商的說明，使用ELISP0T分析 (UCyTech, Utrecht, The Netherlands)評價患者的 CTL 的 IFN-y 表達（20:1 效應細胞：革巴 細胞比）（15)。使用 AID ELISP0T 讀取系統(tǒng)（Cell Technology, Inc.，Columbia, MD)進行點 計數(shù)。
[0050] 圖1A-1C是顯示CTA表達的RT-PCR分析的圖像。圖IA是顯示由正常組織組制備 的cDNA的PCR的凝膠圖像。圖IB是顯示來自NSCLC細胞系CRL-5928 (I)、CRL-5922 (2)或 正常支氣管上皮來源細胞CRL-2503 (3)的cDNA的PCR的凝膠圖像。圖IC是顯示來自NSCLC 原發(fā)腫瘤的cDNA的PCR的凝膠圖像。陽性對照為由睪丸制備的cDNA，而陰性對照為在沒有 先前逆轉(zhuǎn)錄（無RT)的情況下使用RNA進行的PCR，以及在沒有模板的情況下（無模板）進 行的PCR。P -肌動蛋白用于證實成功的逆轉(zhuǎn)錄。發(fā)現(xiàn)SP17/AKAP4/PTTG1RNA選擇性地由 NSCLC細胞系和原發(fā)腫瘤表達，而不在非腫瘤細胞系和組織中表達。如圖IA中所見，使用來 自一組正常組織的RNA，借助RT-PCR測定SP17、AKAP4和PTTGl的基因表達。三個細胞系 (兩個源自NSCLC，一個源自正常支氣管上皮）顯示在圖IB中，且一群新近診斷患有NSCLC 的17名患者顯示在圖1C。作為陽性對照，本發(fā)明人分析了在睪丸中的CTA表達（6、16、17)， 而使用未經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄的匯集RNA獲得陰性對照（以排除污染的基因組DNA的可能的擴增）， 并且其中在沒有模板的情況下進行RT-PCR。雖然沒有正常組織針對SP17、AKAP-4和PTTGl 表達可檢測的RNA水平（如圖IA所見），但是正常支氣管細胞系CRL-2503顯示SP17RNA的 微弱表達（如圖IB所示）。NSCLC細胞系CRL-5928和CRL-5922顯示評價的三種CTA的顯 著的RNA表達（如圖IB所見）。此外，來自所有17名NSCLC患者的腫瘤對于SP17是陽性 的，而65%的腫瘤表達AKAP4 (11/17)，59%表達PTTGl (10/17)(如圖IC所見）。
[0051] 圖2顯示使用指定抗體（有色直方圖）或相應的同種型對照（黑色直方圖）孵 育的細胞的流式細胞術分析。使用FACS-Canto流式細胞儀（BD)在FLl通道中（對數(shù)級） 對FSC/SSC-門控細胞（gated cell) (10, 000事件）測量熒光強度。圖表按照在細胞系和 原發(fā)患者樣品中的SP17、AKAP4和PTTGl排列。SP17、AKAP4和PTTGl由NSCLC細胞系和原 發(fā)患者樣品在蛋白水平上表達，但不由正常支氣管上皮表達。為了研究CTA組在蛋白水平 上的表達，本發(fā)明人通過對透化細胞的CTA-特異性抗體染色進行流式細胞術分析。圖2顯 示SP17、AKAP4和PTTGl由NSCLC來源細胞系而不是由正常支氣管來源細胞系表達。應注 意的是，即使SP17基因微弱地表達，非腫瘤CRL-2503細胞對SP17蛋白也是陰性的（圖IB 和2)。本發(fā)明人對源自患者的NSCLC腫瘤/組織進行了類似分析，其與RT-PCR數(shù)據(jù)完全一 致。圖2顯示來自3名患者的代表性結(jié)果。CTA表達的特異性通過在源自評價的健康個體 之一的組織中不存在SP17、AKAP4和PTTGl陽性染色來證實11 (例如，代表性結(jié)果顯示在圖 2中）。為了進一步評價選擇的CTA在腫瘤和正常細胞中的表達，本發(fā)明人進行了離心涂片 (cytospun)的NSCLC細胞系、正常支氣管細胞系和源自原發(fā)腫瘤的細胞的免疫熒光分析。
[0052] 圖3顯示了對NSCLC細胞系、CRL-5928、CRL-5922、對正常支氣管上皮來源細 胞CRL-2503和一名代表性患者進行的免疫熒光。代表性免疫熒光針對NSCLC細胞系、 CRL-5928、CRL-5922、針對正常支氣管上皮來源細胞CRL-2503和一名代表性患者（7號）進 行。本發(fā)明人顯示了在細胞質(zhì)中，SP17、AKAP4和PTTGl的陽性染色（綠色信號）。在60X 放大倍數(shù)下通過倒置熒光顯微鏡（Olympus 1X71)拍攝圖片。為了測量可能的針對SP17、 AKAP4和PTTGl的體液應答，本發(fā)明人通過間接ELISA比較了來自NSCLC患者的血清中的循 環(huán)CTA-特異性IgG自身抗體的水平與來自受試者的那些。如果ELISA信號比健康受試者 的中值信號高至少3個標準偏差，則認為受試者是陽性的（20)。
[0053] 圖4A-4C是用于檢測針對SP17、AKAP4和PTTGl的循環(huán)CTA-特異性IgG的ELISA 數(shù)據(jù)的圖表。圖4A-4C是用于檢測循環(huán)CTA-特異性IgG的ELISA。圖表顯示由一式三份進 行的研究計算的平均OD值（正方形，NSCLC患者的血清；菱形，健康受試者的血清）。水平 線表示陽性界限，計算為從健康對照組獲得的中值的三倍。與來自RT-PCR、流式細胞術和免 疫熒光的表達數(shù)據(jù)一致，圖4A-4C顯示大多數(shù)NSCLC患者顯示CTA特異性循環(huán)自身抗體。
[0054] 圖5A-5F是CTL活性和特異性分析的圖表。直方圖顯示在指定的不同條件下，通 過基于非放射性銪的分析獲得的特異性細胞溶解的百分比。左側(cè)圖顯示在不同的效應細胞 (E):祀細胞22⑴比例下的CTL活性。條代表一式三份進行的實驗的平均值，誤差條表示 標準偏差。右側(cè)圖顯示CTL特異性的分析。條代表由對選擇的5名患者進行的實驗獲得的 平均值，而誤差條表示標準偏差。以25 y g/mL的濃度加入針對HLA I類（W6/32)和HLAII 類（L243)的抗體以評價HLA限制性細胞毒性。CTL表示細胞毒性T淋巴細胞；DC，樹突細 胞；HLA，人白細胞抗原；E7, HPVE7抗原；PBMC，外周血單核細胞。本發(fā)明人成功地生成能夠 有效殺死來自5名患者的自體腫瘤細胞的CTL，如圖5A-F左列所見。對于該分析，本發(fā)明人 選擇顯示在其腫瘤細胞中在蛋白水平上特異性CTA表達的患者。細胞毒效應的特異性由自 體腫瘤細胞和NSCLC來源細胞系的細胞溶解的高百分比（40%至高于80%)來支持，而非 腫瘤細胞（DC，使用不相關的HPV-E7抗原致敏的DC，和正常支氣管來源細胞系CRL-2503) 的細胞溶解〈10% (圖5A-F，右側(cè)）。HLA I類限制通過針對12單態(tài)HLA I類分子而不是 HLA II類分子的抗體的細胞溶解抑制來顯示，如圖5A-F右列所見。
[0055] 圖6A、6C和6E是分析指定細胞因子的水平的ELISA，并且圖6B、6D和6F是與 自體腫瘤細胞共培養(yǎng)的患者的CTL的IFN-y表達的ELISP0T分析。圖6A、6C和6E是來 自自體腫瘤細胞的共培養(yǎng)物（效應細胞：靶細胞比為20:1)的上清液的ELISA，并且分析 使用CTA致敏的或未改性的DC刺激的PBMC的指定的細胞因子的水平。所有測量均一式 三份地進行。結(jié)果顯示為使用活化PBMC測量的平均OD除以使用在沒有抗原的情況下與 自體DC孵育的PBMC獲得的平均OD (OD45。比）。圖6B、6D和6F是與自體腫瘤細胞共培養(yǎng) 的患者的CTL的IFN-y表達的ELISP0T分析（效應細胞：靶細胞比為20:1)，使用如在 材料和方法部分詳細描述的ELISP0T分析進行評價。使用AID ELISP0T讀取系統(tǒng)（Cell Technology, Inc.，Columbia, MD)進行點計數(shù)，并每106個PBMC歸一化。結(jié)果代表一式三 份進行的分析的平均值土標準偏差。基于ELISA的細胞因子表達的測量顯示了朝向Thl 效應細胞表型的T細胞活化和極化：在使用CTA-致敏的DC刺激并且與腫瘤細胞共培養(yǎng)后， IFN- y和TNF- a的水平升高超過50倍，而IL-4、IL-5和IL-10基本未改變（如圖6A、6C 和6E所示）。IFN- y的ELISP0T結(jié)果進一步證實了在使用與自體腫瘤細胞共培養(yǎng)的精子 蛋白（ropporin)呈遞DC活化的PBMC中，產(chǎn)生IFN-Y的細胞的升高的高發(fā)生率（圖6A、6C 和 6E)。
[0056] SP17/AKAP4/PTTG1RNA選擇性地由NSCLC細胞系和原發(fā)腫瘤表達，但不在非腫瘤 細胞系和組織中表達。
[0057] 使用來自一組正常組織（圖1A)、三個細胞系（兩個源自NSCLC，一個源自正常支 氣管上皮，圖1B)和一群新近診斷患有NSCLC的17名患者（圖1C)的RNA，使用RT-PCR測 定SP17、AKAP4和PTTGl的基因表達。作為陽性對照，本發(fā)明人分析了在睪丸中的CTA表達 (6、16、17)，而使用未經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄的匯集RNA獲得陰性對照（以排除污染的基因組DNA的可 能的擴增），并且其中在沒有模板的情況下進行RT-PCR (圖1A-C)。雖然沒有正常組織針對 SP17、AKAP-4和PTTGl表達可檢測的RNA水平（圖1A)，但是正常支氣管細胞系CRL-2503 顯示SP17RNA的微弱表達（圖1B)。NSCLC細胞系CRL-5928和CRL-5922顯示評價的三種 CTA的顯著的RNA表達（圖1B)。此外，來自所有17名NSCLC患者的腫瘤對于SP17是陽性 的，而 65% 的腫瘤表達 AKAP4 (11/17)，59% 表達 PTTGl (10/17)(圖 1C)。
[0058] NSCLC細胞系和原發(fā)患者樣品在蛋白水平上表達SP17/AKAP4/PTTG1，而正常支氣 管上皮不表達。
[0059] 為了研究我們的CTA組在蛋白水平上的表達，本發(fā)明人通過透化細胞的CTA-特異 性抗體染色進行流式細胞分析。圖2顯示SP17/AKAP4/PTTG1由NSCLC來源細胞系而不是由 正常支氣管來源細胞系表達。應注意的是，即使SP17基因微弱地表達，非腫瘤CRL-2503細 胞對SP17蛋白也是陰性的（圖IB和2)。本發(fā)明人隨后對源自患者的NSCLC腫瘤/組織進 行了類似分析，其與RT-PCR數(shù)據(jù)完全一致。圖2顯示來自3名患者的代表性結(jié)果。CTA表 達的特異性通過在來自評價的健康個體之一的組織中不存在SP17/AKAP4/PTTG1陽性染色 來證實（代表性結(jié)果顯示在圖2中）。為了進一步評價選擇的CTA在腫瘤和正常細胞中的 表達，本發(fā)明人進行了離心涂片的（cytospun) NSCLC細胞系、正常支氣管細胞系和源自原 發(fā)腫瘤的細胞的免疫熒光分析。圖3顯示腫瘤細胞中的SP17/AKAP4/PTTG1的胞質(zhì)定位，但 是根據(jù)來自流式細胞術的結(jié)果，在正常支氣管細胞系CRL-2503中未顯示或顯示邊界信號。
[0060] 循環(huán)CTA-特異性自身抗體在NSCLC患者的血清中是可檢測的。
[0061] 為了測量可能的針對SP1