一種熒光標(biāo)記的磁性山奈酚微球體系及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光標(biāo)記的磁性山奈酚微球載藥體系及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磁性微球因具有磁響應(yīng)性和不同的表面功能，在靶向載藥、細(xì)胞分離、固定化酶等領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)生物醫(yī)用材料要求的提高，兼具磁性和優(yōu)異熒光標(biāo)記功能的磁性微球越來越受到人們的關(guān)注。
[0003]山奈酚(Kaempferol，KAE)來源于姜科植物山奈的根莖，是一種天然多酚類黃酮化合物，在抗癌、抗菌、抗炎、抗癲癇、止咳等方面具有較高的的醫(yī)用價(jià)值。但是山奈酚屬于疏水性藥物，生物利用率較低，因此，學(xué)者們一直致力于山奈酚制劑的開發(fā)，以提高其溶解度而增加療效。超聲化學(xué)法是指兩種(或兩種以上)不相溶液體在強(qiáng)超聲波空化作用下混合均勻形成分散物質(zhì)系，其中一種液體均勻分布在另一液體之中而形成乳狀液，此方法反應(yīng)周期短，對(duì)溫度、反應(yīng)體系要求低，并且能制備各種形態(tài)的納米結(jié)構(gòu)。
[0004]石墨烯量子點(diǎn)是石墨烯家族的一分子，具有零維結(jié)構(gòu)，擁有許多優(yōu)點(diǎn)，如:大的比表面積、良好的光學(xué)性質(zhì)、良好的水溶性和生物相容性等，在示蹤成像、藥物運(yùn)輸?shù)确矫婢哂辛己玫膽?yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，如果將它們與抗癌藥物一起接枝在同一載體上，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記與治療。
[0005]目前，熒光標(biāo)記磁性微球的合成方法有很多，常用的有包埋法、接枝法、單體聚合法、偶聯(lián)劑法等，然而這些方法反應(yīng)條件苛刻，且制備步驟繁瑣、生產(chǎn)周期長、能耗多、污染大。
[0006]CN201210112174.8公開了熒光磁性微球與氧化石墨烯的復(fù)合材料及其制備方法，此方法首先對(duì)氧化石墨烯進(jìn)行羧基化，再將熒光磁性微球進(jìn)行氨基化，采用接枝法制備熒光磁性微球與氧化石墨烯的復(fù)合材料。此方法制備的熒光磁性微球?qū)Σ≡畈课贿M(jìn)行靶向定位的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了熒光標(biāo)記，此方法未進(jìn)行負(fù)載抗腫瘤藥物體系的研究。
[0007]CN201410330474.2公開了一種應(yīng)用聚乳酸和納米鐵合成阿霉素靶向制劑的方法。該專利選擇納米鐵作為磁性粒子、量子點(diǎn)作為熒光探針、阿霉素作為藥物分子，通過自組裝的方式將納米鐵和藥物分子復(fù)合于聚乳酸微球內(nèi)，得到靶向制劑。但是該方法合成成本高，且未對(duì)負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素后的體系開展控制釋放性能分析。
[0008]目前，尚未有焚光磁性山奈酸微球載藥體系的研究或報(bào)道。本發(fā)明開發(fā)了一種工藝簡單、負(fù)載率高的熒光磁性山奈酚微球載藥體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、負(fù)載率高的熒光標(biāo)記的磁性山奈酚微球載藥體系。
[0010]為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:①首先將疏水性藥物山奈酚溶于油基改性磁流體，混合均勻后，用注射器滴入適量的牛血清蛋白溶液中，采用超聲化學(xué)法合成磁性山奈酚蛋白微球；②然后通過氨羧反應(yīng)連接自制的氨基化石墨烯量子點(diǎn)，得到了具有熒光磁性雙功能的山奈酚微球；③將磁性熒光雙功能的山奈酚微球與人體Hela細(xì)胞共培育，用MTT法檢測細(xì)胞毒性。
[0011]具體步驟為:
[0012]步驟1:首先將疏水性藥物山奈酚溶于油基改性Fe3O4磁流體，混合均勻后，用注射器滴入牛血清蛋白溶液中，超聲、攪拌形成均勻乳液；將該乳液在250?400W超聲功率下超聲破碎，超聲破碎時(shí)間10?20min，反應(yīng)后將產(chǎn)物磁吸洗滌、真空干燥，得到負(fù)載山奈酚藥物的磁性微球(Fe304/BSA@KAE);
[0013]所述油基改性磁流體，磁流體介質(zhì)為環(huán)己烷，F(xiàn)e3O4磁流體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ;所述所述牛血清蛋白溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% ;
[0014]所述的疏水性藥物山奈酚與油基改性Fe3O4磁流體的質(zhì)量比為1:400 ;
[0015]步驟2:通過氨羧反應(yīng)連接自制的氨基化石墨烯量子點(diǎn)，得到了具有熒光磁性雙功能的山奈酚微球，具體過程如下:
[0016]A、氨基化石墨烯量子點(diǎn)采用水熱法合成，利用有機(jī)化合物芘在熱濃硝酸條件下的硝化作用，稀釋過濾除酸后，得到黃色的1，3，6一三硝基花(I, 3，6-trinitropyrene)，再利用配制的NaOH溶液或者水合肼和氨水修飾改性；通過超聲處理和高壓反應(yīng)釜加熱合成水溶性GQDs的產(chǎn)物；過濾，在真空條件下加熱至30?50°C干燥，得到綠色的氨基化石墨烯量子點(diǎn)GQDs ；
[0017]B、將磁性山奈酚微球、羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入H2O中，磁性山奈酚微球的質(zhì)量濃度為0.4?0.6mg/mL、羥基琥珀酰亞胺(NHS)與磁性山奈酚微球的質(zhì)量比為86:75，在20?30°C的溫度下反應(yīng)0.5?lh，；
[0018]加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，于20?30°C下振蕩反應(yīng)I?3h，EDC與磁性山奈酚微球的質(zhì)量比為4:3 ；
[0019]在上述反應(yīng)后的溶液中加入濃度為0.01?0.5mol/L氨基化石墨烯量子點(diǎn)(GQDs-NH2)水溶液，氨基化石墨烯量子點(diǎn)與磁性山奈酚微球的質(zhì)量比為2:5 ;加入濃度為
0.2?0.4mg/mL氨基化石墨烯量子點(diǎn)(GQDs-NH2)水溶液后的反應(yīng)，于20?30°C的反應(yīng)溫度下振蕩反應(yīng)6?18h ;反應(yīng)后將產(chǎn)物磁吸分離、去離子水洗滌、在30?50°C下干燥，得到熒光標(biāo)記的磁性山奈酚微球；
[0020]步驟3:將磁性熒光雙功能的山奈酚微球與人體Hela細(xì)胞共培育，用MTT法檢測細(xì)胞毒性。
[0021 ] 所述步驟I中，所述的超聲功率優(yōu)選300W。
[0022]所述步驟I中，所述的超聲破碎時(shí)間優(yōu)選15min。
[0023]所述步驟2B中，所述的羥基琥珀酰亞胺(NHS)與磁性山奈酚微球反應(yīng)溫度優(yōu)選25。。。
[0024]所述步驟2B中，加入氨基化石墨烯量子點(diǎn)(GQDs-NH2)水溶液后的反應(yīng)，振蕩反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選12h。
[0025]根據(jù)上述步驟所制備的焚光標(biāo)記磁性山奈酸微球體系，粒徑50?120nm。
[0026]所述步驟2中，氨基化石墨稀量子點(diǎn)采用水熱法合成，參見文獻(xiàn):Wang L, WangYLj XuTj et al，Nature communicat1ns，2014，5:53570
[0027]所述步驟3中，將熒光磁性山奈酚微球體系與宮頸癌Hela細(xì)胞共培育，用MTT法檢測細(xì)胞毒性，具體過程如下:
[0028]在裝有熒光磁性山奈酚微球體系的EP管中，加入75%乙醇消毒，備用。將對(duì)數(shù)期生長的Hela細(xì)胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的熒光磁性山奈酚微球體系，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞作為空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后每孔加入二甲基亞砜(DMSO)，置搖床避光低速振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定吸光值(OD)。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100%，存活率按公式計(jì)算:
[0029]細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)X 100 %
[0030]本發(fā)明所取得的有益效果:
[0031](I)采用超聲化學(xué)法合成磁性山奈酚微球，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性藥物山奈酚的有效負(fù)載，制備方法操作簡單、實(shí)驗(yàn)條件溫和。
[0032](2)本發(fā)明的磁性熒光雙功能山奈酚微球，藥物負(fù)載率高，既具有磁性粒子的超順磁性，又保留了石墨烯量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光性能。
[0033](3)本發(fā)明制備的磁性熒光雙功能山奈酚微球體系能夠長效緩釋，并表現(xiàn)出對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞較好的抑制作用。
【附圖說明】
[0034]圖1為具體實(shí)施例所制備的樣品的FTIR圖譜:a曲線為磁性山奈酚微球的FTIR圖譜；b曲線為熒光磁性雙功能山奈酚微球的FTIR圖譜。
[0035]圖2為具體實(shí)施例所制備樣品的TEM圖譜:圖2A為Fe3O4磁流體的TEM圖；圖2B為磁性山奈酚微球的TEM圖。
[0036]圖3為具體實(shí)施例所制備磁性山奈酚微球的TG圖。
[0037]圖4為具體實(shí)施例所制備磁性山奈酚微球的磁滯回線VSM圖。
[0038]圖5為具體實(shí)施例所制備熒光磁性山奈酚微球的熒光光譜(PL)圖:a曲線，熒光磁性山奈酚微球；b曲線，熒光磁性山奈酚微球被磁鐵吸引后所剩上清液。
[0039]圖6熒光磁性山奈酚微球在37°C，pH = 5.5和pH = 7.4條件下的PBS緩沖溶液所測的藥物釋放曲線。
[0040]圖7為人體Hela細(xì)胞加入熒光磁性山奈酚微球溶液后的細(xì)胞毒性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍并無明確限制。
[0042]實(shí)施例
[0043]將5mg山奈酚加入2g油基改性Fe3O4磁流體中，形成混合溶液后，用注射器將此混合液緩慢滴入50mL 2%的牛血清蛋白溶液中，并攪拌形成均勻乳液。接著將該乳液在300W功率下超聲15min，反應(yīng)后將產(chǎn)物洗滌、干燥，制備磁性山奈酚微球，密封保存，備用。
[0044]氨基化石墨稀量子點(diǎn)采用水熱法合成，參見文獻(xiàn):Wang L, Wang YL, Xu T, etal, Nature communicat1ns, 2014，5:5357。先稱取 2g 的花(純度 >98% )，量取 160mL 的濃硝酸，混合并放入圓底燒瓶中。在恒溫水浴條件下，將混合物加熱至80°C，電動(dòng)攪拌12h，得黃色溶液，將所得的混合液冷卻至室溫。然后量取IL的去離子水，將混合物稀釋，放入壓濾機(jī)中，采用0.22um微孔膜過濾以除去酸。在真空下干燥得到1，3，6-trinitropyrene。再稱取上述反應(yīng)物1，3，6-trinitropyrene 3g，分別量取50mL水合肼溶液和1mL氨水，混合，放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲Ih后，得到懸浮液。將懸浮液轉(zhuǎn)移到襯有聚四氟乙烯的高壓反應(yīng)釜中，放至馬弗爐，加熱至200°C反應(yīng)10h，待冷卻至室溫后，將含有水溶性GQDs的產(chǎn)物放入壓濾機(jī)中，采用0.22 μπι微孔膜過濾以除去不溶碳產(chǎn)物，真空干燥，得到純化的氨基化石墨烯量子點(diǎn)，保存?zhèn)溆谩?br>[0045]將7.5mg的磁性山奈酸微球、8.6mg輕基琥?白酰亞胺(NHS)，