Sip1及其衍生物在制備預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于新藥領(lǐng)域，具體涉及Smad結(jié)合蛋白I (Smad interacting protein 1， SIPl)及其衍生物在制備預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 至今為止，人類對(duì)于皮膚創(chuàng)面這一多發(fā)病的愈合機(jī)制尚未完全闡明，深入探索其 分子機(jī)制并尋找理想的治療途徑，一直是燒傷外科等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)課題。皮膚創(chuàng) 傷修復(fù)的目標(biāo)是創(chuàng)面的迅速上皮化及功能外觀的恢復(fù)。創(chuàng)面上皮化可以使皮膚屏障重建， 患者免于體液流失及病原微生物的侵入感染；在功能和外觀的恢復(fù)過(guò)程中，瘢痕的增生程 度則是最重要的影響因素。皮膚創(chuàng)面的修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，各種不同來(lái)源的細(xì)胞、 分子等相互作用構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞、分子網(wǎng)絡(luò)，機(jī)體如何協(xié)同這些細(xì)胞及分子，決定了 不同的修復(fù)結(jié)果。由此設(shè)想，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的細(xì)胞、分子網(wǎng)絡(luò)中能否找到一類分子，既能 在加速創(chuàng)面上皮化中發(fā)揮作用，又能抑制瘢痕增生？
[0003] SIPl為鋅指核轉(zhuǎn)錄因子，因其可以和Smad蛋白相互作用而得名，屬于ZEB家族成 員，分子量為140KDa。其中間為一個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，N-末端和C-末端各由一個(gè)高度保守且相 互獨(dú)立的鋅指結(jié)構(gòu)簇構(gòu)成，N-末端包含4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，C-末端包含3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，如圖14 所示。SIPl具有特異性DNA結(jié)合活性，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)簇能獨(dú)立結(jié)合CACCT序列，完整的SIPl 單體對(duì)由（C)AGGTG靶點(diǎn)和CACCT(G)靶點(diǎn)構(gòu)成的二聚體具有高度親和力并與之緊密結(jié)合。 SIPl通常是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制物，通過(guò)和基因上游CACCT序列結(jié)合抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。既往 研究表明，SIPl主要具有以下功能：① SIPl為轉(zhuǎn)錄抑制物，通過(guò)結(jié)合基因上游特定區(qū)域抑 制表皮細(xì)胞粘附分子、膠原等基因的轉(zhuǎn)錄；②SIPl可以和Smads蛋白結(jié)合，拮抗TGF-β 1通 路；③SIPl可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs)高表達(dá)；④細(xì)胞對(duì)SIPl表達(dá)的調(diào)控可能通過(guò) microRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。以往對(duì)SIPl的研究主要集中在細(xì)胞分化及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中。2007 年Kato M等在腎纖維化組織中發(fā)現(xiàn)SIPl低表達(dá)，他們認(rèn)為TGF- β 1介導(dǎo)的腎纖維化與包 括SIPl在內(nèi)的ZEB家族蛋白的缺乏相關(guān)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，對(duì)SIPl和皮膚創(chuàng)面愈合及其纖維 化發(fā)生的研究鮮有報(bào)道，故對(duì)其在增生性瘢痕中的功能和作用還需進(jìn)一步深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供SIPl (Smad interacting protein 1，SIPl)及其衍生物或表 達(dá)SIPl或其衍生物的重組基因表達(dá)載體在制備預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，SIPl和細(xì)胞粘附分子E-cadherin、I型膠原的表達(dá)呈顯著 負(fù)相關(guān)，和基質(zhì)金屬蛋白酶I (MMPl)的表達(dá)呈顯著正相關(guān)；體外SIPl基因轉(zhuǎn)染既能促進(jìn)表 皮細(xì)胞迀移，又能抑制成纖維細(xì)胞膠原合成。
[0006] 本發(fā)明在成人皮膚cDNA文庫(kù)中篩選得到了攜帶SIP 1基因的真核表達(dá)載體 pcDNA3. l(+)/SIPl，在此基礎(chǔ)上，利用常規(guī)基因克隆技術(shù)，克隆了攜帶SIPl編碼基因和綠 色熒光蛋白基因 EGFP的重組質(zhì)粒CMV-SIP1-EGFP，然后利用基因同源重組，將SIP1-EGFP重 組到腺病毒載體Adeno-X?中，獲得重組腺病毒表達(dá)載體Adeno-X ?-SIPl-EGFP，并包裝成腺 病毒顆粒，用于SIPl蛋白功能和SIPI基因功能的鑒定。
[0007] 本發(fā)明分離了正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，并利用TGF-β 激正常皮膚成纖維細(xì)胞建立了成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化模型。鑒定了 SIPl在上述兩種細(xì)胞中 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SIPl在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中低表達(dá)。而且，成人正常皮膚成纖維細(xì) 胞經(jīng)TGF-^刺激后，SIPl的表達(dá)也明顯降低，表明SIPl的低表達(dá)加重了增生性瘢痕的纖 維化。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中高表達(dá)SIPl后檢測(cè)纖維化相關(guān)指標(biāo)I型 膠原、III型膠原的表達(dá)量。結(jié)果表明，在蛋白水平上增加 SIPl表達(dá)后，纖維化相關(guān)的指標(biāo) I型膠原、III型膠原的表達(dá)量顯著降低，抑制纖維化。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)在瘢痕成纖維細(xì)胞中增加 SIPl的表達(dá)，觀察該細(xì)胞經(jīng)TGF- β⑶激后 肌成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物a -SM和纖維化相關(guān)的指標(biāo)I型膠原。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比， 在瘢痕成纖維細(xì)胞中增加 SIPl的表達(dá)，肌成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物a -SM的表達(dá)明顯降低。
[0010] 本發(fā)明首次證明SIPl在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中能抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞、肌 成纖維細(xì)胞產(chǎn)生I型膠原蛋白。因此，本發(fā)明得出以下結(jié)論：在纖維化疾病中，SIPl的低表 達(dá)可能是一個(gè)調(diào)控成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和功能改變的重要始動(dòng)因素，SIPl可能是一個(gè)具有 強(qiáng)烈作用的纖維化形成相關(guān)的負(fù)性信號(hào)。因此SIPl的高表達(dá)則是具有明顯的抗纖維化作 用。因此，SIPl及其基因表達(dá)載體可以用于預(yù)防和治療增生性瘢痕等疾病。
[0011] 由于SIPl基因在真核細(xì)胞中的序列高度保守，其以SIPl的結(jié)合部位和功能部位 發(fā)揮生物學(xué)作用的天然或基因工程蛋白質(zhì)衍生物保留了保守功能結(jié)構(gòu)域，具有類似的功 能，也可以用于預(yù)防和治療增生性瘢痕等疾病。特別地，具有SIPl的結(jié)合部位和功能部分， 并且在高表達(dá)后能夠抑制I型膠原、III型膠原等纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，或抑制肌成纖維 細(xì)胞表面標(biāo)志物a -SM的表達(dá)的SIPl衍生物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0012] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供SIPl及其衍生物或表達(dá)SIPl或其衍生物的重 組基因表達(dá)載體在制備預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的SIPl衍生物是指具有SIPl的結(jié)合部位和功能部分，并且在高表達(dá)后能 夠抑制I型膠原、III型膠原等纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，或抑制肌成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志物 a-SM表達(dá)的物質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物或試劑盒，其特征在 于，包括有效量的SIPl或其衍生物、或表達(dá)SIPl或其衍生物的重組基因表達(dá)載體，和藥用 賦形劑或載體。
[0015] 所述的預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物或試劑盒還可以含有其他目前已知用于增生 性瘢痕病變的抑制劑。
[0016] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述預(yù)防和治療增生性瘢痕藥物或試劑盒可以局部 給藥到瘢痕處，也可以通過(guò)口服、靜脈內(nèi)注射、肌肉注射等常規(guī)使用方式施用。本領(lǐng)域中技 術(shù)人員通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌蚍謩e確定SIPl或其衍生物、或表達(dá)SIPl或其衍生物的重組基因 表達(dá)載體、以及藥物組合物的劑量水平。應(yīng)該理解，關(guān)于任何具體受試者的具體劑量水平依 賴于多種因素，包括受試者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑和 排泄率、藥物聯(lián)合和經(jīng)歷治療的具體疾病的嚴(yán)重性等。在施用所述藥物組合物的情形中， SIPl或其衍生物、或表達(dá)SIPl或其衍生物的重組基因表達(dá)載體可以與其他瘢痕病變抑制 劑同時(shí)、或間隔一定時(shí)間進(jìn)行施用。
[0017] 所述增生性瘢痕包括但不限于燒傷、燙傷、切割傷、化學(xué)損傷、冷凍傷等皮膚外傷。
[0018] 體外SIPl基因轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細(xì)胞能抑制其膠原合成，SIPl在皮膚創(chuàng)傷后的瘢 痕形成過(guò)程中能起到抑制作用。適時(shí)、高水平的SIPl干預(yù)對(duì)皮膚增生性瘢痕的形成起著積 極的抑制作用。因此，可以將SIPl及其衍生物或表達(dá)SIPl或其衍生物的重組基因表達(dá)載 體應(yīng)用到預(yù)防和治療增生性瘢中，從而為增生性瘢的預(yù)防和治療提供了藥物選擇。
【附圖說(shuō)明】：
[0019] 圖1是增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)（第3代細(xì) 胞，放大X 40)
[0020] 圖2是SIPl在增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色）
[0021] 圖3是SIPl在增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的表達(dá)（組織免疫熒光檢測(cè)）
[0022] 圖4是SIPl在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)
[0023] 圖5是SIPl、COL I A2及a -SM在增生性瘢痕組織中的表達(dá)
[0024] 圖6是正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF- β肩激后SIPUCOL I A2及a -SMA的 表達(dá)
[0025] 圖7是瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒后轉(zhuǎn)染效果觀察
[0026] 圖8是瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒后SIPl的mRNA表達(dá)
[0027] 圖9是瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒后SIP1、a-SMA、C0L I A2、C0LIII 的表達(dá)
[0028] 圖10是瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒后磷酸化Smad2和磷酸化Smad3 的表達(dá)
[0029] 圖11是構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型
[0030] 圖12是SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒對(duì)兔耳增生性瘢痕膠原纖維的影響
[0031] 圖13是SIPl過(guò)表達(dá)腺病毒對(duì)兔耳增生性瘢痕指數(shù)的影響
[0032] 圖14是SIPl蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，其中SID :Smad結(jié)合區(qū)域，CID :CtBp作用區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】：
[0033] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0034] 實(shí)施例1 :
[0035] 一、SIPl在增生性瘢痕組織及其來(lái)源的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)特性
[0036] 標(biāo)本收集于臨床整形手術(shù)中切取的增生性瘢痕組織，并取其術(shù)中剩余正常全層皮 膚組織標(biāo)本作為自身對(duì)照（均征得患者同意，并簽署知情同意書）。將瘢痕及其自體正常皮 膚標(biāo)本分成3份，其中一份用4%多聚甲醛固定并石蠟包埋切片后行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，另 一份用液氮冷凍用于提取組織總蛋白，第三份消毒后用酶消化法常規(guī)分離培養(yǎng)原代成纖維 細(xì)胞。
[0037] 1、人增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0038] 應(yīng)用組織塊法進(jìn)行人增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞的原代 培養(yǎng)。兩種細(xì)胞形態(tài)均呈梭形，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)呈明顯漩渦狀外觀，如圖1 所示。
[0039] 2、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SIPl在增生性瘢痕組織中的表達(dá)情況
[0040] 首先為觀察SIPl在正常皮膚和增生性瘢痕組織結(jié)構(gòu)中的表達(dá)情況，應(yīng)用免疫組 織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，與自體正常皮膚組織相比較，SIPl在增生性瘢痕組織中低表達(dá)，見 圖2。
[0041] 3、組織免疫熒光檢測(cè)SIPl在增生性瘢痕組織中的表達(dá)情況
[0042] 采用組織免疫熒光檢測(cè)SIPl在增生性瘢痕組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與自體正常 皮膚組織相比較，SIPl在增生性瘢痕組織中低表達(dá)，見圖3 (A-B)。
[0043] 4、細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)SIPl在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況
[0044] 應(yīng)用原代培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒 光檢測(cè)SIPl的表達(dá)，結(jié)果顯示，與自體正常皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞相比較，SIPl在增生性 瘢痕來(lái)源的成纖維細(xì)胞中低表達(dá)，見圖4(A-B)。
[0045] 5、Western-blot檢測(cè)增生性瘢痕組織中SIP1、COL I A2及a -SMA的表達(dá)情況
[0046] 為明確SIPl在增生性瘢痕組織中蛋白含量變化，我們對(duì)臨床整形手術(shù)中切除的 瘢痕