就微流化排列交互作用和背壓室的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/IB2010/003390,國際申請日為2010年12月 03日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?01080063020. 3,名稱為"就微流化排列交互作用和 背壓室"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2009年12月3日提交的美國臨時申請61/283, 548的優(yōu)先權(quán)，其全部 內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及通過微流化制備疫苗的水包油乳液佐劑領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0004] 稱作'MF59' [1-3]的疫苗佐劑是一種鯊烯、聚山梨酯80 (也稱作吐溫80)和去水 山梨糖醇三油酸酯（也稱作司盤85)的亞微米水包油乳液。它也可包含檸檬酸根離子，如 IOmM檸檬酸鈉緩沖劑。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0. 5%吐溫80和約0. 5% 司盤85。參考文獻4的第10章、文獻5的第12章、文獻6的第19章更詳細地描述了該佐 劑及其制備。
[0005] 如參考文獻7中所述，MF59的商業(yè)規(guī)模的制備是通過將司盤85分散在鯊烯相中且 吐溫80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后將這種粗乳液重復(fù)通過微流化機， 產(chǎn)生具有均一油滴尺寸的乳液。如參考文獻6所述，微流化乳液隨后濾過〇. 22 μ m膜，以除 去任何大油滴，所得乳液的平均液滴尺寸在4°C下保持至少3年不變?？扇鐓⒖嘉墨I8所述 測定最終乳液中的鯊烯含量。
[0006] 水包油乳劑含有油滴。這些乳劑中含有的較大油滴可作為聚集的成核位置，引起 儲存過程中的乳劑降解。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供制備微流化水包油乳液（例如MF59)的進一步和改良方法， 特定是適用于商業(yè)規(guī)模和提供改良的微流化以產(chǎn)生含較少大顆粒乳劑的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，所述方法包括：使具有第一平均油滴 尺寸的第一乳液通過微流化裝置形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的 第二乳液。所述微流化裝置包括交互作用室，其包含多條Z型管道和包含至少一條管道的 輔助處理模塊，其中所述輔助處理模塊位于交互作用室下游。
[0009] 所述第一乳液可在第一壓力下引入交互作用室且所述第二乳液可在低于所述第 一壓力的第二壓力下離開輔助處理模塊。在一個實施方式中，所述交互作用室上所述第一 和第二壓力之間的壓力差下降80-95%，且所述輔助處理模塊上所述第一和第二壓力之間 的壓力差下降5-20%的。
[0010] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)水包油乳液的方法，包括步驟：使具有第一平均油滴尺寸 的第一乳液通過微流化裝置形成具有小于第一平均油滴尺寸的第二平均油滴尺寸的第二 乳液。所述微流化裝置包括含有多條管道的交互作用室和含有多條管道的輔助處理模塊。 [0011] 所述第一乳液可（i)在第一壓力下引入交互作用室且所述第二乳液可在低于所 述第一壓力的第二壓力下離開輔助處理模塊；或所述第一乳液可（ii)在第一壓力下引入 輔助處理模塊且所述第二乳液可在低于所述第一壓力的第二壓力下離開交互作用室。在一 個實施方式中，所述交互作用室上所述第一和第二壓力之間的壓力差下降80-95%，且所述 輔助處理模塊上所述第一和第二壓力之間的壓力差下降5-20%。
[0012] 如下文詳述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸為 300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸>1. 2 μπι的油滴數(shù)量可為5xlOn/ml或更少。尺 寸>1. 2 μπι的油滴是不利的，因為它們可由于液滴聚集和凝結(jié)導(dǎo)致乳液不穩(wěn)定[14]。
[0013] 形成后，第一乳液可至少通過一次微流化，形成平均油滴尺寸減小的第二乳液。如 下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸為500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸>1. 2 μπι 的油滴數(shù)量為SxIO1Vml或以下。為了實現(xiàn)這些特征，必須將乳液組分通過微流化裝置多 次，例如 2、3、4、5、6、7 次。
[0014] 然后第二乳液可濾過例如親水聚醚砜膜，得到可適用作疫苗佐劑的水包油乳液。 過濾后產(chǎn)生的水包油乳液的平均油滴尺寸可為220nm或以下，例如135-175nm，145-165nm， 或約155nm。過濾后產(chǎn)生的水包油乳液中存在的尺寸>1.2 μπι的油滴數(shù)量可以是5x 10s/ ml或更少，例如5x 107/ml或更少，5x 106/ml或更少，2x 106/ml或更少，或5x 105/ml或更 少。
[0015] 過濾后形成的最終水包油乳液與第一乳液相比尺寸>1. 2 μΜ的油滴可少至少IO2 倍，理想的是至少少IO3倍（例如少10 4倍）。
[0016] 在一些實施例方式，在步驟（iii)之前進行一輪以上的步驟⑴和（ii)。類似的， 可多次重復(fù)獨立步驟（i)或（ii)。
[0017] 通常，在20-60°C，理想地在40+5°C進行本方法。雖然第一和第二乳液組分可能在 較高溫度下也相對穩(wěn)定，但一些組分的熱分解仍然會發(fā)生，因此優(yōu)選較低溫度。
[0018] 乳液組分
[0019] 可用動態(tài)光散射技術(shù)，如參考文獻13所述測定平均油滴尺寸（即乳液的油滴的平 均直徑數(shù)）。動態(tài)光散射測量機的一個例子是Nicomp 380亞微米粒度分析儀（來自PSS公 司(Particle Sizing Systems))。
[0020] 可用顆粒計數(shù)器，例如Accusizer?770 (來自PSS公司）測定尺寸>1. 2 μΜ的顆粒 數(shù)。
[0021] 本發(fā)明的方法用于制備水包油乳液。這些乳液包含三種核心成分：油；水性組分； 和表面活性劑。
[0022] 由于乳液要用于藥學(xué)應(yīng)用，油通常應(yīng)該是可生物降解的（可代謝的）和生物相容 的。
[0023] 所用油可包含角鯊烯，其是一種支鏈不飽和萜類的鯊魚肝油（C3(]H5I];[(CH 3)2C[= CHCH2CH2C(CH3)]2= CHCH 2-]2;2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6101418. 22, 22-二十四碳己 烯；CAS RN 7683-64-9)。鯊烯特別適用于本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明的油可包括油的混合物（或組合），例如包含角鯊烯和至少一種其他油。
[0025] 替代（或除了）使用鯊稀，乳液可含有來自例如動物（如魚）或植物來源的油。植 物油的來源包括堅果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的 示例。也可使用獲自（例如）霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽 油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕 麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。盡管甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯不是種籽油中 天然產(chǎn)生的，但可以從堅果和種籽油開始，通過對合適原料進行水解、分離和酯化而制備。 來自哺乳動物乳液的脂肪和油可代謝并因而可以使用。獲得動物來源純油所必需的分離、 純化、皂化和其它方法的過程為本領(lǐng)域熟知。
[0026] 大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨 油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支 鏈油，其總稱為砲類。也可采用鯊稀的飽和類似物鯊燒。包括角鯊稀和角鯊燒在內(nèi)的魚油， 易于從商業(yè)來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。
[0027] 其他有用的油為生育酚，特別是和角鯊烯聯(lián)合。當乳液的油相包含生育酚時，可采 用生育酚中的任何一種，但優(yōu)選α-生育酸?？赏瑫r采用D-α-生 育酚和DL-a-生育酚。優(yōu)選的a-生育酚是DL-a-生育酚。生育酚可取多種形式，例如 不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。如果采用這種 生育酚的鹽，那么優(yōu)選的鹽是琥珀酸鹽?？墒褂冒ń酋徬┖蜕樱ㄈ鏒L-a-生育酚） 的油組合。
[0028] 所述水性組分可為淡水（如w. f. i.)或可包括其他組分如溶質(zhì)。例如，可包含鹽以 形成緩沖液，例如檸檬酸或磷酸鹽，例如鈉鹽。常用緩沖劑包括：磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖 劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。包含的緩沖劑一般 是5-20mM。表面活性劑優(yōu)選是可生物降解（可代謝）和生物相容性的。可通過'HLB'（親 水/親脂平衡）對表面活性劑分類，其中1-10范圍內(nèi)的HLB表示表面活性劑比起水更易溶 于油，而10-20范圍內(nèi)的HLB表示比起油更易溶于水。乳液優(yōu)選包含至少一種HLB為至少 10,例如至少15或優(yōu)選至少16的表面活性劑。
[0029] 可以與本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表 面活性劑（通常稱為吐溫），特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX?出售的 環(huán)氧乙烷（EO)、環(huán)氧丙烷（PO)和/或環(huán)氧丁烷（BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物； 重復(fù)的乙氧基（氧-1，2-乙二基）數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通 (Triton) X-100,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；
[0030] (辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿（卵磷 脂）；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（稱為芐澤表面活性 劑），如三乙二醇單月桂基醚（芐澤30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯（通常 稱為司盤），如去水山梨糖醇三油酸酯（司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含 的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酯80 (吐溫80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯）、司盤85 (去 水山梨糖醇三油酸酯）、卵磷脂和曲通X100。
[0031] 所述乳液中可包括這些表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物或吐溫 80/曲通-XlOO混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯（吐 溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇（曲通X-100)的組合也適用。另一種 有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合 物可包括HLB值為10-20的表面活性劑（如吐溫80, HLB為15. 0)和HLB值為1-10的表面 活性劑（如司盤85, HLB為1. 8)。
[0032] 第一乳液的形成
[0033] 微流化步驟前，可混合乳液組分形成第一乳液。第一乳液中油滴的平均尺寸可 以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm或以下，2000nm或以下，1200nm或以下， 1000 nm或以下，例如平均尺寸為800-1200nm或300nm-800nm。
[0034] 在第一乳液中，尺寸>1. 2 μΜ的油滴數(shù)可以是5x IO1Vml或更少，例如SxlO1Vml 或更少，或5x 109/ml或更少。
[0035] 然后，可微流化第一乳液形成平均油滴尺寸小于第一乳液和/或尺寸>1. 2 μ M的 油滴更少的第二乳液。
[0036] 可通過將第一乳液組分在勻漿器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如圖 1所示，可將其在混合容器（12)中混合，然后將混合組分引入（13)機械勻漿器，例如轉(zhuǎn) 子-定子勻漿器（1)。
[0037] 可以垂直和/或水平方式操作勻漿器。為了方便在商業(yè)配置中使用，優(yōu)選直列式 勾衆(zhòng)器。
[0038] 將組分引入轉(zhuǎn)子-定子勻漿器，并接觸含有槽或孔的迅速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子。組分以類 似栗的方式向外離心甩出，通過槽/孔。在一些實施方式中，勻漿器包括多種轉(zhuǎn)子和定子的 組合方式，例如梳齒環(huán)同心排列，如圖1的特征（3)和（4) ;(5)和（6)及（7)和（8)以及圖 2所示。用于大規(guī)模勻漿器的轉(zhuǎn)子可以在水平方向的多刃葉輪上具有梳齒環(huán)（例如圖1中 的特征（9))，彼此精密排列，以配合靜態(tài)襯里中的齒。第一乳液通過轉(zhuǎn)子和定子之間空隙中 發(fā)生的湍流、空化和機械剪切組合形成。以與轉(zhuǎn)子軸平行的方向有用地引入組分。
[0039] 轉(zhuǎn)子-定子勻漿器中的重要性能參數(shù)是定子的葉尖速度（圓周速度）。該參數(shù)是 轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)子直徑的函數(shù)。至少IOms 1的葉尖速度是有用的，且理想上更快，例如彡20ms \ 彡30ms1、彡40ms1等。可用小型勾衆(zhòng)器在10, OOOrpm輕易實現(xiàn)40ms 1的葉尖速度，或用較 大的勻漿器在較低轉(zhuǎn)速（例如2, OOOrpm)實現(xiàn)。合適的高剪切勻漿器可市售獲得。
[0040] 對于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，勻漿器應(yīng)理想地具有至少300升/小時，例如彡400升/小 時，