一種以腙鍵連接的納米鉆石藥物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及納米鉆石藥物,特別涉及pH調控釋藥的納米藥物,具體屬于一種以腙鍵共價連接阿霉素的納米鉆石藥物及其制備方法,以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著科技與經濟的發(fā)展,環(huán)境惡化、食品安全和社會壓力等問題促使了惡性腫瘤的高增長率。然而在腫瘤的治療中存在著諸多問題,主要歸結為傳統(tǒng)的化學療法使用的小分子藥物存在著嚴重的毒副作用,其在殺死腫瘤細胞的同時也殺死正常組織及細胞,且頻繁用藥會致使腫瘤細胞產生多藥耐藥性,導致療效降低。因此,研發(fā)一種低毒高效的新型藥物顯得尤為迫切。
[0003]隨著現代納米技術的興起,納米技術對醫(yī)學的發(fā)展產生了巨大的影響,使納米藥物產生獨特優(yōu)勢,為攻克癌癥開創(chuàng)了新的診斷和治療思路,為新型化療藥物的合成提供了新的契機。納米藥物輸送系統(tǒng)因其具有對藥物可控釋放、可改變藥物的體內分布、提高藥物血液循環(huán)時的穩(wěn)定性、改善藥物吸收及部分逆轉腫瘤的多藥耐藥性等優(yōu)點,目前已經發(fā)展為用于腫瘤治療的研宄熱點之一。納米鉆石因其具有低毒性、高生物相容性和表面易修飾特性,將其作為載體制備納米藥物時受到了眾多研宄者的青睞。腙鍵因其具有在正常生理組織(pH 7.4)及弱堿性的血液循環(huán)中,保持良好的穩(wěn)定性,而腫瘤組織周圍環(huán)境呈弱酸性,細胞內內涵體或溶酶體中也呈pH 4-5.5的弱酸性,在這些弱酸性環(huán)境中,由腙鍵偶聯(lián)的化療藥物可以很快發(fā)生斷裂,使藥物釋放,從而明顯降低藥物的毒副作用?;诩{米鉆石具有低毒性及高生物相容性,其作為藥物輸送載體對人體幾乎不會產生生理毒性,而腙鍵因其具有良好的pH敏感性,因此我們將納米鉆石作為載體,以化療藥物阿霉素為藥物模型,將阿霉素以腙鍵連接于其表面,制備得到了納米鉆石藥物,并研宄了該藥物對腫瘤細胞活性、周期、凋亡等的影響。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種以腙鍵連接的納米鉆石藥物及其制備方法,以及該藥物在抗腫瘤藥物中的應用。
[0005]本發(fā)明提供的一種以腙鍵連接的納米鉆石藥物的制備方法,包括如下步驟:
[0006](I)稱取真空干燥的羧基化納米鉆石,按每毫克羧基化納米鉆石加入1-1.5mL的濃度為0.1M,pH為5.8的MES緩沖溶液中,超聲分散30min形成懸濁液,再按每毫克羧基化納米鉆石加入0.2mg EDC,0.25mg NHS,室溫攪拌反應6h,反應完畢后以15000rpm高速離心5min棄除上清液,從而得到活化羧基的納米鉆石沉淀物;接著將活化羧基的納米鉆石沉淀物迅速分散到濃度為0.1M,pH為8.4的硼酸緩沖溶液中,經過短暫超聲分散形成懸濁液,再按每毫克活化的羧基化納米鉆石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH),繼續(xù)室溫攪拌反應12h,待反應結束,以15000rpm高速離心5min吸除上清液,并用0.1M,pH 8.4的硼酸緩沖溶液高速離心洗滌三次,獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物;
[0007](2)稱取干燥的納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H),按每毫克納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)加入1-1.5mL的濃度為0.1M,pH為5.8的MES緩沖溶液中,超聲分散30min形成懸池液,再按每毫克羧基化納米鉆石-聚乙二醇加入0.2mg EDC、0.25mg NHS,室溫攪拌反應6h,反應完畢后以15000rpm高速離心5min棄除上清液,從而得到活化羧基的納米鉆石-聚乙二醇沉淀物;接著將活化羧基的納米鉆石-聚乙二醇沉淀物迅速分散到濃度為0.1M,pH為8.4的硼酸緩沖溶液中,經過短暫超聲分散形成懸濁液,再按每毫克活化的羧基化納米鉆石-聚乙二醇快速滴加0.0lmL水合肼(H2NN2H.H2O),繼續(xù)室溫攪拌反應12h,待反應結束,以15000rpm高速離心5min吸除上清液,并用0.1M,pH 8.4的硼酸緩沖溶液高速離心洗滌三次,再用無水甲醇高速離心洗滌三次,得到納米鉆石-聚乙二醇-水合肼(ND-PEG-HYD)沉淀物;并置于真空干燥箱中干燥;
[0008](3)按每毫克干燥的納米鉆石-聚乙二醇-水合肼(ND-PEG-HYD)加入2mL無水甲醇中超聲分散2h,形成懸濁液,接著按納米鉆石-聚乙二醇-水合肼(ND-PEG-HYD)與阿霉素(DOX)質量比為5: 1-2,將納米鉆石-聚乙二醇-水合肼懸濁液逐滴滴入快速攪拌的阿霉素的甲醇溶液中,并加入0.005mL三氟乙酸(TFA)與0.05mL三乙胺(TEA),通氮鼓泡30min,然后避光攪拌反應36h,待反應完畢,以15000rpm高速離心5min,并依次用蒸餾水(PH7.2)、無水甲醇高速離心洗滌各五次,得到以腙鍵連接阿霉素的納米藥物ND-PEG-HYD-DOX (NPHD),真空干燥,避光保存。該納米藥物粒徑大小為260.9 ±5.64nm。
[0009]制備的NPHD藥物,用MTT法檢測NPHD對人肝癌細胞(H印G2)、人宮頸癌細胞(Hela)、人乳腺癌細胞(MCF-7)活性的影響,表明該藥物對不同的癌細胞具有不同的殺傷力,并揭示NPHD具有緩釋藥物特性,該藥物能誘導腫瘤細胞凋亡且療效略強于游離阿霉素;因此制備的納米藥物NPHD,既能降低化療藥物對正常細胞的毒副作用,又能提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷力,所以NPHD可在制備抗腫瘤藥物中應用。
[0010]與現有技術相比,本發(fā)明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒、化學性質穩(wěn)定、表面易修飾等諸多優(yōu)點,通過ND-PEG-HYD與人肝癌細胞0fepG2)、人宮頸癌細胞(Hela)、人乳腺癌細胞(MCF-7)作用,表明ND-PEG-HYD載體具有生物兼容性;將納米載體ND-PEG-HYD通過酸敏感的腙鍵連接阿霉素,制備成NPHD納米藥物,可在制備抗腫瘤藥物中應用。
【附圖說明】
[0011 ] 圖1納米藥物NPHD (右側)和ND-DOX (左側)的紫外燈照射下的照片
[0012]圖2各種納米顆粒的紅外光譜圖
[0013]圖3不同pH對納米藥物NPHD體外釋藥的影響
[0014]圖4用熒光細胞成像儀檢測NPHD在HeLa細胞內阿霉素的釋放
[0015](A)對照組HeLa細胞;⑶NPHD和HeLa細胞共同孵育0.5小時;
[0016](C)NPHD和HeLa細胞共同孵育3小時
[0017]圖5A不同濃度的納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)H印G2細胞活性的影響
[0018]圖5B不同濃度的納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)HeLa細胞活性的影響
[0019]圖5C不同濃度的納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)MCF-7細胞活性的影響
[0020]圖6A納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)不同時間H印G2細胞活性的影響
[0021]圖6B納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)不同時間HeLa細胞活性的影響
[0022]圖6C納米藥物NPHD對體外培養(yǎng)不同時間MCF-7細胞活性的影響
【具體實施方式】
[0023]載體為納米鉆石(ND,元素六,直徑大約140nm, Ireland)。
[0024]阿霉素(DOX)是鹽酸多柔比星,分子式為C27H29NO11.HCl,分子量為579.99,深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產,規(guī)格按C27H29NO11.HCl計算為10mg。
[0025]聚乙二醇(H2N-PEG-COOH:分子量為2000)為上海西寶生物有限公司生產。
[0026]水合肼(H2NN2H.H2O:分子量為50.06)為天津市光復精細化工研宄所生產。
[0027]實施例1:
[0028](I)納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG)納米粒子的制備
[0029]準確稱取1mg羧基化納米鉆石,分別經過二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇(C2H5OH)、滅菌水(H2O)洗滌后,置于1mL MES (0.1M,pH5.8)緩沖溶液中,超聲分散30min形成懸濁液,接著加入2mg EDC、2.5mg NHS,室溫攪拌反應6h,待反應結束后以15000rpm高速離心5min,除去上清液,得到活化羧基的納米鉆石沉淀物;
[0030]把活化羧基的納米鉆石沉淀物迅速分散到1mL BBS(0.1M,pH8.4)緩沖溶液中,超聲分散1min形成懸濁液,接著加入3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH),繼續(xù)室溫攪拌反應12h,待反應完畢,以15000rpm高速離心5min收集上清液,并用蒸餾水繼續(xù)以15000rpm高速離心5min洗滌三次,獲得納米鉆石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)納米