用于遞送能調(diào)節(jié)干擾rna內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列的制劑的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于遞送能調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列的制劑
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于遞送核苷酸序列的納米乳劑型制劑，所述核苷酸序列能夠調(diào) 節(jié)干擾RNA的內(nèi)源性機(jī)制。
[0002] RNA干擾的機(jī)制是一種基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后抑制機(jī)制，其基于特異性降解靶mRNA并 高度選擇性、特異性抑制蛋白表達(dá)的雙鏈小干擾RNA。該機(jī)制在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，并涉及一種 多蛋白復(fù)合物，稱(chēng)為RISC復(fù)合物（RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）。
[0003] 自從發(fā)現(xiàn)了這一自然機(jī)制后，能夠調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列作為多 個(gè)生物領(lǐng)域中的研宄工具被應(yīng)用于大量的學(xué)術(shù)和/或藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中。例如，能夠調(diào)節(jié)干擾RNA 內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列被用于檢測(cè)多種疾病的新治療靶標(biāo)。通過(guò)高選擇性和特異性的抑 制給定蛋白的表達(dá)，就可能證實(shí)其在疾病發(fā)展進(jìn)程中所起的作用。然而將外源性遺傳物質(zhì) 插入細(xì)胞中（轉(zhuǎn)染）需要合適的物理、化學(xué)或生物學(xué)方法使得能夠調(diào)節(jié)RNA干擾的內(nèi)源性 機(jī)制的這些核苷酸序列-通常都是大分子（> IOKDa)且?guī)ж?fù)電荷-通過(guò)形成真正屏障的 帶負(fù)電荷質(zhì)膜。
[0004] 在所提到的物理方法中，可由電穿孔或通過(guò)超聲在細(xì)胞膜上形成孔洞。在生物學(xué) 方法中，可借助專(zhuān)門(mén)遞送核酸的系統(tǒng)，如病毒。在化學(xué)方法中，可采用：
[0005] -脂質(zhì)體復(fù)合物（由核酸和陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成的復(fù)合物），如lipofectamine? 2000，
[0006] -多聚復(fù)合物（由核酸和陽(yáng)離子聚合物（例如聚乙烯亞胺PEI)形成的復(fù)合物），
[0007] -由核酸和樹(shù)枝狀分子（如含有聚酰胺-胺PANAM的樹(shù)枝狀分子）形成的復(fù)合物，
[0008] -脂質(zhì)體多聚復(fù)合物（由核酸、脂質(zhì)體和聚合物形成的復(fù)合物），例如SNALP(《穩(wěn) 定核酸-脂質(zhì)顆?！罚?，對(duì)應(yīng)于陽(yáng)離子脂質(zhì)和由聚乙二醇（PEG)型聚合物穩(wěn)定的輔助形成脂 質(zhì)體混合物；
[0009] -核酸和高分子聚（DL-丙交酯-共-乙交酯）PLGA納米顆粒之間形成的復(fù)合物。
[0010] 據(jù)發(fā)明人所知，僅 Park 等（Molecular Pharmaceutics 5, 4, 622-631，2008)描 述了采用脂質(zhì)納米顆粒用于遞送siRNA。脂質(zhì)納米顆粒含有膽固醇，1，2-二油酰-sn-甘 油-3-磷酰乙醇胺（DOPE)和SiRNA衍生物，并用于轉(zhuǎn)染以及GFP蛋白的敲減。然而，為了防 止SiRNA自納米顆粒泄露，將上述物質(zhì)與其進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。將SiRNA共價(jià)連接于間插入納 米顆粒中的聚（氧乙烯）鏈，從而固定siRNA。此外，為了對(duì)轉(zhuǎn)染進(jìn)行示蹤，還將熒光標(biāo)記物 (顯影劑）與siRNA共價(jià)結(jié)合。然而，對(duì)SiRNA的任何化學(xué)修飾均可能造成其變性。此外， Park等所采用的技術(shù)需對(duì)每個(gè)所用的SiRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，非常費(fèi)時(shí)且昂貴。因此，需要提 供一種用于遞送核苷酸序列的系統(tǒng)，所述核苷酸序列可調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制，其中，這 些序列不經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾。
[0011] 此外，專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2010/018223中描述了用于遞送雙性或親脂性治療藥物的納 米乳劑型制劑，其含有一水相，和至少一含有兩性脂質(zhì)、溶解脂質(zhì)、治療藥物、和輔助表面活 性劑的分散相，所述輔助表面活性劑含有至少一種由氧化烯重復(fù)單元組成的鏈。所述治療 劑可以是siRNA。然而，由于siRNA為親水性化合物，它們會(huì)包含在納米乳劑的連續(xù)水相中 而不在分散相中。因此，該申請(qǐng)中描述的制劑就不適于遞送可調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源性機(jī)制的 核苷酸序列。此外，本發(fā)明人證明在W02010/018223中描述的所有制劑，尤其是實(shí)施例中描 述的那些，甚至是含有完整的陽(yáng)離子表面活性劑的那些也不適用于本申請(qǐng)，因?yàn)閺?fù)合率太 低，轉(zhuǎn)染不夠有效。如下所述，只有含有特定組分比例的制劑才能遞送可調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源 性機(jī)制的核苷酸序列。
[0012] 同樣的，包含了水包油乳劑或脂質(zhì)液滴的用于遞送脫氧核糖核酸（DNA)的體系已 為人所知。在這些體系中，脂質(zhì)液滴含有陽(yáng)離子表面活性劑并由此使DNA和液滴之間通過(guò) 靜電相互作用而結(jié)合。
[0013] 例如 Del Pozo-Rodriguez 等(International Journal of Pharmaceutics，385, 2010, 157-162)觀察了在靜脈內(nèi)注射脂質(zhì)納米顆粒后小鼠肝臟和腎臟 中出現(xiàn)的熒光，所述脂質(zhì)納米顆粒含有表達(dá)熒光蛋白EFGP的裸質(zhì)粒DNA(pDNA)、:p recir〇r ΑΤΟ 5、吐溫（Tween)80和1，2-二油酰-3-三甲基丙基氯化銨（DOTAP)(陽(yáng)離子表面活性 劑），以便用于HEK293細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染和在施用于小鼠后的體內(nèi)（轉(zhuǎn)染）。
[0014] Tabatt 等(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57,2004，155)描述了固體脂質(zhì)納米顆粒的應(yīng)用，其含有Compritol ATO 888或十六烷 酸鯨蠟醇酯、吐溫80、Span85、選自烷基二甲基苯氯化銨（BA)、十四烷基三甲基溴化銨 (CTAB)、十六烷基氯吡啶（CPC)、二甲基二油?；寤@（DDAB)、N，N-雙_(b_硬脂酰乙 基）_N, N-二甲基氯化按（醋季按鹽（Esterquat) 1，EQ1)和8_Ν-[1-(2, 3,-二油酰氧基） 丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨（DOTPA)的表面活性劑以供C0S-1細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。
[0015] 這兩個(gè)文獻(xiàn)中都使用了吐溫80。然而其對(duì)細(xì)胞具有某些毒性。此外，吐溫80含有 包含了 20個(gè)環(huán)氧乙烷單元的聚（環(huán)氧乙烷）鏈。如下所述，本發(fā)明人證實(shí)具有更長(zhǎng)聚（環(huán) 氧乙烷）鏈（至少25個(gè)環(huán)氧乙烷單元）的表面活性劑更易成劑、更穩(wěn)定，更有效地保護(hù)制 劑中所含核苷酸序列以抵抗外界介質(zhì)。
[0016] 最后，所述能調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列，尤其是siRNA，通常不如DNA 穩(wěn)定。此外，DNA和SiRNA的生物學(xué)活性非常不同，這意味著適于遞送DNA的體系并不一定 也同樣適用于遞送siRNA。特別是，即使在任一情況中，一前提是遞送體系能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染， 這對(duì)于遞送siRNA的體系也是不充分的，該系統(tǒng)僅在能進(jìn)行基因沉默下是有利的。
[0017] 因此，需要開(kāi)發(fā)新的制劑，其能夠體內(nèi)和體外遞送可調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制的 核苷酸序列。
[0018] [制劑]
[0019] 為此目的并根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供了一種納米乳劑形式的制劑，其包含一連 續(xù)水相和至少一分散相。
[0020] 本發(fā)明提供了一種包含可調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列的制劑，其可遞 送所述的序列。
[0021] 還提供了所謂的"預(yù)混物"制劑，其不含可調(diào)節(jié)干擾RNA內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序 列，其可以通過(guò)將可調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列和該"預(yù)混物"制劑混合，從而 制備含有可調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列的制劑。因此，該"預(yù)混物"制劑可方便 地與根據(jù)最終制劑所需的應(yīng)用作改進(jìn)的可調(diào)節(jié)RNA干擾內(nèi)源性機(jī)制的核苷酸序列形成復(fù) 合物。
[0022] [預(yù)混物類(lèi)型制劑]
[0023] 本發(fā)明的第一目的是在于提供一種納米乳劑形式的制劑，其包含一連續(xù)水相和至 少一分散相，且含有：
[0024] -至少5mol %的兩性脂質(zhì)；
[0025] -15_70mol%的至少一種陽(yáng)離子表面活性劑，其含有：
[0026] -至少一個(gè)親脂性基團(tuán)，選自：
[0027] -R或R_(C = 0)-基，其中R為具有11-23個(gè)碳原子的線形烴鏈，