一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 胰腺癌起病隱匿，進(jìn)展快速，治療難度和死亡率都很高，被醫(yī)學(xué)界列為"21世紀(jì)的 頑固堡皇"，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外胰腺癌的發(fā)病率明顯上升。胰腺癌治療手段中最有效的是早期根 治性手術(shù)切除，胰腺癌長(zhǎng)徑小于Icm時(shí)，病變限于胰腺導(dǎo)管內(nèi)皮，根治術(shù)后5年生存率接近 100% ;而長(zhǎng)徑超過(guò)Icm時(shí)，多伴有淋巴結(jié)、血管和胰腺包膜等周?chē)M織的侵犯，術(shù)后5年生 存率為17%左右，且有85%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移，平均生存期15-19個(gè)月。受診斷 條件所限，目前胰腺癌的手術(shù)切除率僅為10%-20%，5年生存率僅為0.4%-3. 4%。因此， 早期診斷和早期治療是改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵。
[0003] 超聲造影增強(qiáng)（contrast-enhanced endoscopic ultrasound，CE-EUS)技術(shù)是近 年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種能夠?qū)Σ≡钸M(jìn)行"血池成像"的新技術(shù)，相比較其他影像學(xué)方法（如 CT、MRI等），具有價(jià)格低廉、安全、易操作、觀察實(shí)時(shí)、無(wú)輻射等優(yōu)勢(shì)。CE-EUS主要通過(guò)靜脈 注射微泡態(tài)造影劑，掃查對(duì)象界面回聲聲阻抗差，將腫瘤病灶從周?chē)M織中凸顯出來(lái)，在胰 腺癌診斷中，可以作為胰腺癌篩查的常規(guī)手段，已成為胰腺疾病診斷研宄的熱點(diǎn)之一。由于 普通的造影劑在胰腺組織中濃度整體偏低，半衰期短，較小的病灶會(huì)出現(xiàn)漏診等，使得這項(xiàng) 技術(shù)具有一定的局限性。
[0004] 近年來(lái)，分子影像學(xué)高度發(fā)展，靶向分子技術(shù)越來(lái)越受到研宄者的重視。Hedgehog 蛋白幾乎在所有胰腺癌中高度表達(dá)，且高度表達(dá)狀態(tài)在腫瘤病變?cè)缙谝殉霈F(xiàn)，而Hedgehog 蛋白在正常組織中分布有限，目前尚無(wú)革巴向Hedgehog蛋白的超聲造影劑，故制備一種能夠 靶向Hedgehog蛋白的超聲造影劑對(duì)胰腺癌早期診斷具有非常重要的意義。
[0005] PLGA(聚乳酸聚乙醇酸嵌段共聚物）是經(jīng)過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證可用于人體的可生物降 解材料，具有良好的親水性和生物相容性，可制備成多種藥物的納米級(jí)微粒載體。其中，使 用PEG(聚乙二醇）的技術(shù)修飾PLGA納米載體較為成熟和穩(wěn)定。研宄證實(shí)，利用PLGA與 NH2-PEg-COOH制備新的PLGA衍生物后，靶向性抗體可以與納米微粒表面的-PEG-COOH末端 反應(yīng)并銷(xiāo)定在納米微粒上，形成具有祀向性的納米微粒。此外，納米微粒表面經(jīng)PEG修飾后 會(huì)進(jìn)一步減少納米粒受到RES(網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)）的非特異性吞噬，從而達(dá)到"隱形"的效果， 在體循環(huán)中可以達(dá)到更長(zhǎng)的半衰期。
[0006] 目前主要用于超聲造影增強(qiáng)（CE-EUS)的造影劑主要為微泡造影劑。微泡造影 劑可以清晰顯示由于血管問(wèn)題或組織病變而造成的異常灌注區(qū)域，從而為臨床提供精確、 動(dòng)態(tài)的組織灌注信息，但是，這種微泡造影劑仍存在很多問(wèn)題，如：①對(duì)病變組織沒(méi)有親和 力，只能對(duì)病變組織進(jìn)行非特異性顯影，無(wú)法判斷病變性質(zhì)；②微泡直徑相對(duì)較大（多為 2-6 μ m級(jí)），雖然可以自由通過(guò)肺循環(huán)，但無(wú)法穿透血管壁到達(dá)靶細(xì)胞；③微泡內(nèi)包含的氣 體本身具有先天性反射和背向散射的特征，常常使得觀測(cè)目標(biāo)與背景的對(duì)比度不強(qiáng)；④半 衰期短，有效增強(qiáng)時(shí)間僅數(shù)十秒或數(shù)分鐘，對(duì)需要較長(zhǎng)時(shí)間檢查的病變，只能通過(guò)反復(fù)推注 造影劑才能滿足要求。液態(tài)氟碳有別于先天性反射和背向散射特征的超聲微泡造影劑，其 產(chǎn)生超聲增強(qiáng)顯影的性能是以靶向聚集為基礎(chǔ)的：當(dāng)液態(tài)氟碳造影劑微球處于分散狀態(tài) 時(shí)，對(duì)超聲敏感性非常弱，只有當(dāng)微粒聚集到靶組織或細(xì)胞膜時(shí)，才在超聲下顯影。這種聚 集顯影沒(méi)有微泡超聲造影劑的聲影現(xiàn)象與背景噪聲，從而可以大大提高分辨準(zhǔn)確性，全氟 溴辛烷（PFOB)是液態(tài)氟碳造影劑中的代表性化合物。
[0007] 目前尚無(wú)革巴向Hedgehog蛋白的納米級(jí)超聲造影劑的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的在于解決目前胰腺癌超聲造影增強(qiáng)（CE-EUS)技術(shù)中特異性顯像能 力差等局限性，提供一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供該胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的第三目的，是提供該胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑在制備胰腺癌早期 診斷制劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] 本發(fā)明利用PEG修飾的PLGA作為液態(tài)全氟溴辛烷的納米級(jí)微粒載體，并連接能夠 革巴向早期胰腺癌細(xì)胞膜表面Hedgehog蛋白的單抗，最終制備成胰腺癌祀向的納米級(jí)超聲 造影劑，并評(píng)價(jià)了其體外細(xì)胞靶向能力。
[0013] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑。
[0014] 本發(fā)明的一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑，如圖1所示，從里到外依次為：
[0015] 全氟溴辛烷（PFOB);
[0016] 聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA);
[0017] Hedgehog單克隆抗體；
[0018] 具體是以聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)作為高分子載 體材料，包裹全氟溴辛烷（PFOB)，并在其表面通過(guò)聚乙二醇（PEG)連接Hedgehog單克隆抗 體。
[0019] 本發(fā)明所述的納米級(jí)超聲造影劑，其粒徑為100~500nm，該粒徑范圍以外的納米 不適宜，粒徑過(guò)小會(huì)減弱成像效果，粒徑過(guò)大會(huì)降低造影劑在血管中的通透性，并影響其靶 向效果。
[0020] 本發(fā)明所述的Hedgehog單克隆抗體，可市售，例如英國(guó)Abcam公司等。
[0021] 本發(fā)明以聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)包裹全氟溴辛 烷（PFOB)，所用的方法為乳化揮發(fā)法，可參見(jiàn)文獻(xiàn)：Cheng J J，T印Iy B A，Sherifi，Sung J，Luther G，Gu F X，et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery[J]· Biomaterials，2007,28:869-876.
[0022] 本發(fā)明的第二方面，是提供上述的胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑的制備方法。
[0023] 本發(fā)明的一種胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑的制備方法，該方法包括以下步 驟：
[0024] A、PLGA-PEG-NHS 的合成
[0025] PLGA-C00H和1-3(-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC . HC1)及 N-羥基硫化琥珀酰亞胺（NHS)反應(yīng)預(yù)活化成琥珀酰亞胺，然后與NH2-PEg-COOH反應(yīng)生成 PLGA - PEG-COOH ;所得的 PLGA - PEG-COOH 再與 NHS 和 EDC . HCl 反應(yīng)生成 PLGA-PEG-NHS ;
[0026] B、納米級(jí)超聲造影劑的制備
[0027] 將10~IOOmg PLGA - PEG-NHS溶于ImL二氯甲烷溶液中，加入全氟溴辛烷 (PFOB) 5~50 μ L和Img焚光染料香豆素 -6 (加入焚光物質(zhì)香豆素 -6可用于評(píng)價(jià)超聲造影 劑的靶向性能，因此可不加入），充分混勻后倒入1 %的膽酸鈉溶液中，冰水浴400W超聲乳 化30- 100秒，揮干二氯甲燒；
[0028] C、抗體和納米級(jí)超聲造影劑表面的連接
[0029] 將步驟B制得的納米級(jí)超聲造影劑分散于PBS溶液（ρΗ7. 4)中，加入Hedgehog單 克隆抗體，混合反應(yīng)，分離得到經(jīng)標(biāo)記的抗體修飾的祀向納米級(jí)超聲造影劑；避光攪拌反應(yīng) 4小時(shí)以上（較佳為6小時(shí)），高速離心（1000 Orpm最佳）收集納米級(jí)超聲造影劑，凍干。
[0030] 所述的納米級(jí)超聲造影劑和Hedgehog單克隆抗體的重量比以50-100 :1為佳。
[0031] 本發(fā)明步驟A中，較佳地，PLGA-C00H和1-3(-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽（EDC . HC1)的重量比為1 :8。
[0032] 使用8倍量EDC活化PLGA-C00H的羧基，增強(qiáng)與NHS反應(yīng)的活性。同時(shí)，使用PEG 的技術(shù)修飾可使PLGA納米載體較為成熟和穩(wěn)定，并可進(jìn)一步減少納米級(jí)超聲造影劑受到 網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)的非特異性吞噬。
[0033] 本發(fā)明步驟B中，將全氟溴辛烷（PFOB)包裹于PEG修飾的PLGA載體中，PFOB與 PLGA-PEG-NHS在冰水浴超聲混合，以保證高分子載體包裹PFOB的均一性。較佳地，冰水浴 400W超聲乳化30秒，間隔10秒，重復(fù)3次。
[0034] 本發(fā)明步驟B中，較佳地，PLGA - PEG-NHS 20mg、二氯甲烷ImL全氟溴辛烷 (PFOB)10 μL。
[0035] 本發(fā)明步驟C中，較佳地，納米級(jí)超聲造影劑10mg，Hedgehog單克隆抗體200 μ g。
[0036] 本發(fā)明的第三方面，是提供上述的胰腺癌靶向的納米級(jí)超聲造影劑在制備胰腺癌 早期診斷制劑中的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的納米級(jí)超聲造影劑在胰腺癌靶向性診斷中的應(yīng)用，所 述應(yīng)用包括以下內(nèi)容：
[0038] 將納米級(jí)超聲造影劑分別加入到Hedgehog高表達(dá)的人胰腺癌SW1990細(xì)胞株和 Hedgehog低表達(dá)的人胰腺癌CFPAC-I細(xì)胞株中，觀察和檢測(cè)