一種c型凝集素的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種魚類C型凝集素的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝集素（lectin)是一類糖結(jié)合蛋白，廣泛存在于動(dòng)物和植物中。動(dòng)物凝集素分為 幾種不同亞類，其中一種為C型凝集素（C-typelectin)。所有C型凝集素都具有一個(gè)保守 的糖識(shí)別域（carbohydrate-recognitiondomain)，參與底物結(jié)合。大部分C型凝集素對(duì)底 物的識(shí)別依賴于鈣離子。C型凝集素在多種生物過程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞間相互作用和細(xì) 胞信號(hào)傳導(dǎo)等。許多C型凝集素能與病原表面的糖結(jié)合，造成病原凝集，從而誘發(fā)一系列免 疫反應(yīng)，促進(jìn)病原的清除。因此C型凝集素是一種重要的天然免疫防御因子。目前已知的 脊椎動(dòng)物C型凝集素主要是作用于細(xì)菌和酵母，抗病毒C型凝集素尚無報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種魚類（半滑舌鰨）C型凝集素的應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種C型凝集素的應(yīng)用，C型凝集素用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的抑制劑。
[0006] 所述C型凝集素用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的藥物。
[0007] 所述C型凝集素用于制備魚類抗病毒和抗細(xì)菌的藥物或抑制劑，其中魚類為半滑 舌鰨。
[0008] 所述C型凝集素為C型凝集素重組蛋白。
[0009] 所述C型凝集素在大腸桿菌中表達(dá)即得到重組蛋白。
[0010] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的C型凝集素能夠明顯提高魚類抗病毒和抗細(xì)菌感 染能力。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的C型凝集素重組蛋白。其中，泳道1，分子量標(biāo) 準(zhǔn)；泳道2,C型凝集素。
[0012] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的凝集素增強(qiáng)魚類抵抗細(xì)菌和病毒侵染。其中，A為抗 細(xì)菌侵染；B為抗病毒侵染。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] C型凝集素重組蛋白的制備
[0016] 1)表達(dá)C型凝集素重組蛋白的質(zhì)粒pCTLl的構(gòu)建：
[0017] 本發(fā)明中的C型凝集素基因序列已報(bào)道（GenBankaccessionnumber XP_008329461. 1)。以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為： 94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C40s，63°C60s，65°C60s，30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用 天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體pET259(pET259構(gòu)建過程參見HuYH，Zhengffff，Sun L.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum (Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010 ;28:678-86)用限制性內(nèi)切酶 SwaI酶切后與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a， 在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為 pCTLl。DNA測(cè)序表明pCTLl含有編碼C型凝集素序列的基因。
[0018] 所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1.0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%氯化 鈉，97. 5%蒸餾水。所述Fl為5' -GATATCATGITATCITTAAGCGAACCTGAGCC-3' ；R1為5'-GAT ATCAAGACAGCTCGAGGGACGGGTTGCAC-3 ' 〇
[0019] 2)重組C型凝集素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0020]將上述的質(zhì)粒pCTLl用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑 取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pCTLl。
[0021] 將BL21/pCTLl于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml 過夜后的培養(yǎng)液，加入100ml新鮮的含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C 下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6,加入終濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm 搖動(dòng)培養(yǎng)4-5h，而后以5000g，4°C離心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上 緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min，回收上清。 將上清中的蛋白用親和層析柱HisTrapHPColumns(購于美國GEHealthcare公司）回 收純化，將純化的蛋白懸浮于PBS緩沖液。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)（8v/cm電 壓下電泳25 - 30min，隨后15v/cm電壓下電泳2 - 2. 5h)，測(cè)定其分子量大小（參見圖1)， 質(zhì)譜分析證實(shí)純化的蛋白具有C型凝集素蛋白的序列和保守的糖識(shí)別域。
[0022] 所述裂解液為終濃度的IOmMNaH2P04、IOmMTris和8M尿素，pH8. 0。
[0023] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8%NaCl, 0. 02%KC1, 0. 358% Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量為水。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 重組C型凝集素的免疫應(yīng)用
[0026] 步驟1)凝集素的注射
[0027] 將上述實(shí)施例1獲得的C型凝集素在PBS中稀釋至20ug/ml，即為凝集素稀釋液。 將20條半滑舌鰨（重約10.Ig)隨機(jī)分為4組，每組5條。將這4組分別命名為A、B、C和 D。將A和C組的每條魚分別注射50ul凝集素稀釋液，將B和D組（對(duì)照組）的每條魚分 別注射50ulPBS。
[0028] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8%NaCl, 0. 02%KC1, 0. 358% Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量為水。
[0029] 步驟2)細(xì)菌和病毒懸液制備
[0030] 在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)鰻弧菌C312至OD6tltl為0. 8,然后離心（5000g， 4 °C，IOmin)，收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為106cfu/ml，即為鰻弧菌 懸液。將細(xì)胞腫大病毒RBIV-Cl(具體制備方法見ZhangM，XiaoZ，HuY，Sun L.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes. 2012 ;43:556 - 64)于PBS中稀釋至 105copies/ml，即為病毒懸液。
[0031] 所所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 6250,保 藏日期2012.6.21，分類命名為饅弧菌（/1131'；[03叩11；[113；101111)。
[0032] 步驟3)攻毒感染
[0033] 在上述步驟2)注射后lh，將A和B組的每條魚注射IOOul上述步驟2)的鰻弧菌 懸液，將C和D組的每條魚注射IOOul上述步驟2)的病毒懸液。在細(xì)菌感染后第2天，取 A和B組魚腎臟和脾臟組織，在2mlPBS中勻漿，將IOOul勻漿液涂布于LB平板。將平板置 于30°C培養(yǎng)48h，計(jì)算出現(xiàn)的菌落數(shù)。在病毒感染后第7天，利用DNA提取試劑盒（購于 天根生化科技（北京）有限公司"）從C和D組魚腎臟和脾臟組織中提取DNA，用絕對(duì)定量 PCR法檢測(cè)組織中病毒含量（具體方法見上述參考文獻(xiàn)）。結(jié)果表明A組魚腎臟和脾臟的 細(xì)菌數(shù)（分別為323和327)顯著（P〈0. 01)低于B組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)（分別為460 和495) ;C組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)（分別為6. 8XIO3和10. 8X10 5)顯著（P〈0. 05)低于 D組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)（分別為9. 3XIO5和13. 8X10 5)。（參見圖2)。
[0034] 這些結(jié)果表明，本發(fā)明的C型凝集素能夠顯著增強(qiáng)魚類抵抗細(xì)菌和病毒的侵染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種C型凝集素的應(yīng)用，其特征在于：c型凝集素用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的抑制 劑。
2. 按權(quán)利要求1所述的C型凝集素的應(yīng)用，其特征在于：C型凝集素用于制備抗細(xì)菌或 病毒感染的藥物。
3. 按權(quán)利要求1或2所述的C型凝集素的應(yīng)用，其特征在于：所述C型凝集素為C型 凝集素重組蛋白。
4. 按權(quán)利要求3所述的C型凝集素的應(yīng)用，其特征在于：所述C型凝集素在大腸桿菌 中表達(dá)即得到重組蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種魚類C型凝集素的應(yīng)用。C型凝集素用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的抑制劑。本發(fā)明重組C型凝集素用于制備魚類預(yù)防細(xì)菌或病毒感染的制劑，即能顯著增強(qiáng)魚類的抗細(xì)菌和抗病毒能力。CGMCC No.625020120621
【IPC分類】A61P31-12, A61P31-04, A61K38-17
【公開號(hào)】CN104623631
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510010426
【發(fā)明人】孫黎, 周澤軍
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日