一種寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型的造模方法，具體涉及一種寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物 模型的造模方法及其該模型在篩選抗寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 痛經(jīng)發(fā)病有情志所傷，起居不慎或六淫為害等不同病因，并與素體及經(jīng)期、經(jīng)期前 后特殊的生理環(huán)境有關(guān)。其發(fā)病機(jī)理主要是在這個(gè)期間受到致病因素的影響，導(dǎo)致沖任瘀 阻或寒凝經(jīng)脈，使氣血運(yùn)行不暢，胞宮經(jīng)血流通受礙，以致"不通則痛";或沖任、胞宮失于濡 養(yǎng)，不榮而痛。其病位在沖任、胞宮，變化在氣血，表現(xiàn)為痛證。其所以隨月經(jīng)周期發(fā)作，是 與經(jīng)期沖任氣血變化有關(guān)。非行經(jīng)期間，沖任氣血平和，致病因素尚未能引起沖任、胞宮氣 血瘀滯或不足，故不發(fā)生疼痛；而在經(jīng)期或經(jīng)期前后，由于血海由滿(mǎn)盈而瀉溢，氣血變化急 驟，致病因素乘時(shí)而作，便可發(fā)生痛經(jīng)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)將痛經(jīng)分為兩大類(lèi)：原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性 痛經(jīng)，原發(fā)性痛經(jīng)是指無(wú)生殖系統(tǒng)明顯病變的一般初潮開(kāi)始就會(huì)發(fā)生。
[0003] 原發(fā)性痛經(jīng)臨床床上常見(jiàn)證候?qū)嵶C多于虛證，而實(shí)證中以寒凝血瘀證最為常見(jiàn)。
[0004] 近年有研究表明，痛經(jīng)患者的免疫細(xì)胞和免疫反應(yīng)發(fā)生改變，血中單核細(xì)胞， 內(nèi)啡肽含量明顯高于對(duì)照組。其他肽類(lèi)及自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮素、去甲腎上腺素增高也 可造成子宮肌肉及子宮血管收縮而導(dǎo)致痛經(jīng)。
[0005] 近年來(lái)，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。其核心思想在于運(yùn)用現(xiàn) 代分析技術(shù)定量地測(cè)定生物體在不同狀態(tài)下（生理病理狀態(tài)、藥物干預(yù)前后等）參與物質(zhì) 傳遞、能量代謝和信息傳導(dǎo)等代謝調(diào)控的小分子代謝物質(zhì)即代謝物組的變化，并利用模式 識(shí)別將這種應(yīng)答與體內(nèi)生物學(xué)事件相關(guān)聯(lián)，定位事件發(fā)生的靶器官，從而確定生物標(biāo)記物， 表征或揭示生物體在特定時(shí)間、環(huán)境下整體的功能狀態(tài)。生物體受刺激后而發(fā)生的病理變 化過(guò)程中，必然影響其生物代謝網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生相應(yīng)的變化，生物功能狀態(tài)的最終改變是通過(guò) 代謝表現(xiàn)出來(lái)的，代謝組學(xué)對(duì)證候模型的評(píng)價(jià)起到客觀化作用，羅和古等以慢性束縛法建 立肝郁脾虛大鼠模型，采用NMR技術(shù)分析表明，正常組、模型組代謝產(chǎn)物具有明顯差異，涉 及能量、脂肪及蛋白質(zhì)代謝異常。
[0006] 目前，尚未有寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)的病證結(jié)合的動(dòng)物模型的報(bào)道。臨床上評(píng)價(jià)、 篩選抗寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)的藥物受到一定的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從病證結(jié)合的角 度，采用冰浴和注射腎上腺素制造大鼠寒凝血瘀，以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備大鼠原發(fā)性 痛經(jīng)。最后，通過(guò)測(cè)定內(nèi)啡肽、內(nèi)皮素、孕酮等相關(guān)生化指標(biāo)，并聯(lián)合代謝組學(xué)方法觀察 造模前后大鼠血漿、尿液中內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化來(lái)優(yōu)選得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛 經(jīng)動(dòng)物模型。
[0008] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0009] -種寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，它包括以下步驟：
[0010] (1)選擇雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴5?7天，然后取出注射鹽酸腎上腺素，間 隔3?4小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，以制得寒凝血瘀型大鼠；
[0011] (2)然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大 鼠連續(xù)5?7天皮下注射苯甲酸雌二醇，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感性提高， 最后給大鼠腹腔注射縮宮素，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模型。
[0012] 0? 16ml/只/次，間隔四小時(shí)
[0013] 作為優(yōu)選方案，以上所述的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，它包括 以下步驟：
[0014] (1)選擇雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴7天，然后取出注射鹽酸腎上腺素， 0. 16ml/只/次，間隔4小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，0. 16ml/只/次，以制得寒凝血 瘀型大鼠；
[0015] (2)然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大 鼠連續(xù)7天皮下注射苯甲酸雌二醇，lmL/kg/天，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感 性提高，第8天給大鼠腹腔注射縮宮素，lmL/kg，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模 型。
[0016] 作為優(yōu)選方案，以上所述的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，所述的 雌性大鼠為SD雌性大鼠。
[0017] 本發(fā)明制備得到的的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型在篩選抗痛經(jīng)藥物中的應(yīng) 用。
[0018] 本發(fā)明制備得到的的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型在篩選抗寒凝血瘀型原發(fā) 性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
[0019] 有益效果：本發(fā)明提供的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法和現(xiàn)有技術(shù) 相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論和婦科疾病的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，以冰浴聯(lián)合 注射腎上腺素制造大鼠寒凝血瘀；以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿生化指標(biāo)檢測(cè)與對(duì)照組有顯著性差異，且代謝組學(xué)分析結(jié)果表 明，模型大鼠尿液與血漿代謝輪廓在PLS-DA圖上完全分開(kāi)，偏離正常狀態(tài)，故寒凝血瘀型 原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型造模成功，該模型可以很好的用于篩選抗寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)的藥 物，具有重要的用于價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 1、寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，其它包括以下步驟：
[0024] (1)選擇SD雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴5天，然后取出注射鹽酸腎上腺素， 0. 16ml/只/次，間隔3小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，0. 16ml/只/次，以制得寒凝血 瘀型大鼠；
[0025] (2)然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大 鼠連續(xù)5天皮下注射苯甲酸雌二醇，lmL/kg/天，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感 性提高，第6天給大鼠腹腔注射縮宮素，lmL/kg，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模 型。
[0026] 實(shí)施例2
[0027] 1、寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，其它包括以下步驟：
[0028] (1)選擇SD雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴7天，然后取出注射鹽酸腎上腺素， 0. 16ml/只/次，間隔4小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，0. 16ml/只/次，以制得寒凝血 瘀型大鼠；
[0029] (2)然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大 鼠連續(xù)7天皮下注射苯甲酸雌二醇，lmL/kg/天，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感 性提高，第8天給大鼠腹腔注射縮宮素，lmL/kg，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模 型。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 1、實(shí)驗(yàn)分組：選擇按以上實(shí)施例2方法造模得到的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠16 只，體重220g左右，分為模型組8只和給藥組（少腹逐瘀湯）8只，同時(shí)選擇8只未造模的 大鼠作為正常對(duì)照組，體重220g左右。
[0032] 2、生化指標(biāo)的測(cè)定
[0033] 前列腺素（prostaglandins,PGs)與原發(fā)性痛經(jīng)密切相關(guān)，PGF2a可刺激子宮收縮， 使子宮張力升高，有研究表明，痛經(jīng)越嚴(yán)重著，血液中PGF2a含量越高；催產(chǎn)素（oxytocin) 催產(chǎn)素可作用于子宮肌細(xì)胞引起子宮收縮，同時(shí)刺激內(nèi)膜細(xì)胞釋放前列腺素；神經(jīng)內(nèi)分泌 激素0 -endorphin是一種與疼痛有關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素；孕酮（progesterone)、雌二醇 (estradiol)和內(nèi)皮素（endothelin)也均是與痛經(jīng)相關(guān)。
[0034] 分別對(duì)本發(fā)明上述實(shí)施例2造模得到的模型大鼠，給藥組（少腹逐瘀湯）和正常 對(duì)照組進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，具體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示：
[0035] 表1寒凝血瘀原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠體內(nèi)的相關(guān)生化因子及少腹逐瘀湯的干預(yù)效 應(yīng)（n= 8)
[0036]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，其特征在于，它包括以下步驟： (1) 選擇雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴5~7天，然后取出注射鹽酸腎上腺素，間隔3~4 小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，以制得寒凝血瘀型大鼠； (2) 然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大鼠連續(xù) 5~7天皮下注射苯甲酸雌二醇，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感性提高，最后給大 鼠腹腔注射縮宮素，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，其特征在于， 它包括以下步驟： (1) 選擇雌性大鼠連續(xù)放在冰水中冰浴7天，然后取出注射鹽酸腎上腺素，0. 16ml/只 /次，間隔4小時(shí)后，再注射一次鹽酸腎上腺素，0. 16ml/只/次，以制得寒凝血瘀型大鼠； (2) 然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，給以上步驟（1)的大鼠連續(xù) 7天皮下注射苯甲酸雌二醇，lmL/kg/天，以同步化子宮，并使子宮對(duì)縮宮素的敏感性提高， 第8天給大鼠腹腔注射縮宮素，lmL/kg，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)大鼠動(dòng)物模型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，其特征在 于，所述的雌性大鼠為SD雌性大鼠。
4. 權(quán)利要求1或2制備得到的的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型在篩選抗痛經(jīng)藥物中 的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1或2制備得到的的寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型在篩選抗寒凝血瘀型 原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的造模方法，本發(fā)明以冰浴聯(lián)合注射腎上腺素制造大鼠寒凝血瘀，然后以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，得到寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型。本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論和痛經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，以冰浴聯(lián)合注射腎上腺素制造大鼠寒凝血瘀；以雌激素和縮宮素聯(lián)合制備原發(fā)性痛經(jīng)大鼠模型，整個(gè)方法操作簡(jiǎn)單，造模成功率高，易于推廣應(yīng)用，可解決目前沒(méi)有寒凝血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型的不足，為規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、科學(xué)的評(píng)價(jià)中醫(yī)藥提供一種新方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】A61K38-12, A61K49-00, A61K31-137
【公開(kāi)號(hào)】CN104524545
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410763865
【發(fā)明人】宿樹(shù)蘭, 段金廒, 黃曉晨, 郭建明, 劉培, 錢(qián)大瑋
【申請(qǐng)人】南京中醫(yī)藥大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日