專利名稱：多價(jià)人一牛輪狀病毒疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
輪狀病毒是嬰幼兒急性脫水腹瀉的一個(gè)主要原因。在發(fā)展中國家，輪狀病毒疾病導(dǎo)致嬰幼兒胃腸炎死亡的25％至30％和在美國大約50000至100000的小于5歲的住院兒童。因?yàn)檫@個(gè)原因，需要安全有效的疫苗來預(yù)防嬰幼兒嚴(yán)重的輪狀病毒疾病。
開發(fā)輪狀病毒疫苗的主要策略以“Jennerian”方法為基礎(chǔ)，其具利用人和動(dòng)物輪狀病毒的抗原相關(guān)性和動(dòng)物輪狀病毒株在人中的減小的毒性。Kapikian等，疫苗，Chanock等編著，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約，pp.151-159(1987)。使用該方法已經(jīng)開發(fā)出了幾種候選的活口服輪狀病毒疫苗，其中從非人宿主得到的抗原相關(guān)的活病毒被用作抗其人病毒對(duì)應(yīng)物的免疫接種疫苗。已經(jīng)用來對(duì)人接種的動(dòng)物輪狀病毒的例子包括牛輪狀病毒株NCDV(RIT4237,Vesikari等，Lancet,2:870-811(1983)),牛輪狀病毒株WC3(Clark等，美國兒童疾病雜志(Am.J.Dis.Child.),140:350-356(1986))和獼猴輪狀病毒(RRV)株MMU 18006(美國專利4571385,Kapikian等，疫苗85,Lerner等，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約，pp.357-367(1985))。
證明了不同一價(jià)牛和一價(jià)猿猴輪狀病毒疫苗之間的保護(hù)效力是不同的(Vesikari，腸胃道病毒感染(Kapikian編著，Marel Dekker,Inc.,pp.419-442(1994)；Kapikian，出處同上，pp.443-470(1994))。而且，在人中產(chǎn)生令人滿意的免疫應(yīng)答要求高濃度的牛輪狀病毒(107-108噬斑形成單位(pfu))(Yesikari等，兒科傳染病(Ped.Inf.Dis.)4:622-625(1985)；Bernstein等，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)162:1055-1062(1990))。這些組合物的不同效應(yīng)可能部分歸因于2至5個(gè)月大的嬰兒的目標(biāo)人群在接種之后特征性產(chǎn)生同型免疫應(yīng)答的事實(shí)(Kapikian等，藥物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展(Adv.Exp.Med.Biol.),327:59-69(1992)；Bernstein等，感染病雜志(J.Infect.Dis.),162:1055-1062(1990)；Green等，感染病雜志(J.Infect.Dis.),161:667-679(1990)；和Vesikari，疫苗11:255-261(1993))。
臨床相關(guān)人輪狀病毒是A群輪狀病毒的成員。這些病毒都有共同的VP6介導(dǎo)的群抗原，一種位于病毒中間殼上的蛋白。而且，血清型特異性取決于位于病毒外殼(通常也稱之為病毒殼體)上的VP4(蛋白酶敏感的或P型)和VP7(糖蛋白或G型)蛋白質(zhì)的存在，這兩種蛋白質(zhì)獨(dú)立地誘導(dǎo)中和抗體，Kapikian等，病毒學(xué)，F(xiàn)ields,ed.pps.1353-1404(1995)。
通過中和試驗(yàn)將感染人的A群輪狀病毒分類為10種不同的VP7血清型。氨基酸序列分析表明每一種血清型中兩個(gè)主要可變區(qū)中氨基酸同一性很高(85-100％)；但是不同血清型的病毒株之間的氨基酸同一性顯著降低(Green等，病毒學(xué)(Virol.),168:429-433(1989)；Green等，Virol.,161:153-l59(1987)；和Green等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.),62:1819-1823(1988))。證實(shí)了通過病毒中和試驗(yàn)或VP7的序列分析測定的輪狀病毒相關(guān)性之間的一致性。因此，參考病毒株通?？梢栽谂R床研究中用作其血清型中的輪狀病毒株的代表。
為了實(shí)現(xiàn)抗每一流行病學(xué)和臨床上重要的4種G血清型(VP7)(標(biāo)記為1,2,3和4)的保護(hù)，通過產(chǎn)生重排列輪狀病毒來改進(jìn)Jennerian方法。通過用動(dòng)物源的輪狀病毒(即獼猴或牛輪狀病毒)和人輪狀病毒株共感染組織培養(yǎng)細(xì)胞來構(gòu)建重排列的輪狀病毒株。通過使共感染的子代與一組抗動(dòng)物病毒株的VP7的單克隆抗體接觸來選擇共感染期間產(chǎn)生的包含編碼來自人病毒株的VP7的單一人輪狀病毒基因和10個(gè)保留的來自動(dòng)物病毒株的輪狀病毒基因的重排列病毒(參見，例如，美國專利4571385；Midthun等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)24:822-826(1986)；和Midthun等，J.Virol,53:949-954(1985))。
對(duì)包含來自人病毒株的VP7基因的人x獼猴輪狀病毒重排列和人×牛重排列的研究證明動(dòng)物輪狀病毒親本的VP4中和蛋白在用這些人×動(dòng)物輪狀病毒重排列接種的嬰兒中免疫應(yīng)答占優(yōu)勢。這可能反映出在子宮內(nèi)從母體轉(zhuǎn)移給嬰兒的抗體中沒有動(dòng)物輪狀病毒VP4抗體。不過，對(duì)通過母體產(chǎn)生的VP7抗體部分減弱的人輪狀病毒VP7的免疫應(yīng)答足以提供保護(hù)作用，因此，VP7抗體形成改進(jìn)的Jennerian方法的基礎(chǔ)(Flores等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)27:512-518(1989)；Perez-Schzel等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)28:553-558(1990)；Flores等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)31:2439-2445(1993)；Christy等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)168:1598-1599(1993)；Clark等，疫苗(Vaccine)8:327-332(1990)；Treanor等，Pediatr.Infect.Dis.J.14:301-307(1995)；Madore等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)166:235-243(1992)；和Clark等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)161:1099-1104(1990))。
用攜帶單一人輪狀病毒基因，即編碼VP7的基因，的單一獼猴輪狀病毒重排列的研究中，發(fā)現(xiàn)這樣一種重排列的保護(hù)性免疫應(yīng)答在小于6個(gè)月的嬰兒中特征性同型(Green等，流行病學(xué)雜志(J.Inf.Dis.)161:667-679(1990))。該發(fā)現(xiàn)為抗輪狀病毒疾病的免疫中VP7-相關(guān)的免疫性的重要性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。
使用一價(jià)和四價(jià)人×獼猴輪狀病毒重排列疫苗的一般性實(shí)驗(yàn)證明在接種后3-4天大約1/3的嬰幼兒發(fā)生暫時(shí)低水平發(fā)熱事件。Bernstein等，JAMA 273:1191-1196(1995)；Flores等，Lancet336:330-334(1995)；Perez-Schael等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)28:553-558(1990)；Flores等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.),31:2439-2445(1993)；Halsey等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)158:1261-1267(1988)；Taniguichi等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)29:483-487(1991)；Simasathien等，兒科傳染病(Pediatr.Infect.Dis.)J.13:590-596(1994)；Madore等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)166:235-243(1992)；和Joensuu等，Lancet 350:1205-1209(1997)。
用牛輪狀病毒株NCDV和WC3(VP7血清型6)對(duì)人的研究結(jié)果表明這些特殊的牛輪狀病毒株似乎不引起發(fā)燒或其它反應(yīng)。應(yīng)該注意血清型6VP7存在于在人輪狀病毒疾病中重要的人輪狀病毒上這一點(diǎn)是未知的。并且也沒有發(fā)現(xiàn)牛輪狀病毒當(dāng)對(duì)人施用時(shí)和獼猴輪狀病毒一樣是免疫原性的。牛輪狀病毒株NCDV(RIT4237疫苗)對(duì)嬰兒和幼兒評(píng)價(jià)不少于5次效力試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，以107.8至108.3組織培養(yǎng)感染劑量50(TCID50)的劑量范圍施用牛RIT4237疫苗，通常劑量超過108.0TCID50。在劑量-反應(yīng)研究中，Vesikari等，Ped.Infect.Dis.,4:622-625(1995)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以106.3TCID50的劑量施用疫苗時(shí)4至6月齡的嬰兒中15％(2/13)產(chǎn)生了同型抗體應(yīng)答；當(dāng)以107.2TCID50的劑量施用時(shí)是71％(10/14)，和當(dāng)以108.3TCID50的劑量施用時(shí)是100％。因此，測得了產(chǎn)生最佳免疫原性的牛輪狀病毒株的劑量是108.0TCID50范圍。
在獼猴輪狀病毒和牛輪狀病毒在人中的感染性和免疫原性的直接比較中，給6-8月齡的兒童施用105噬斑形成單位(pfu)獼猴輪狀病毒(RRV疫苗)或108.3pfu的RIT4237(Vesikari等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)153:832-839(1986))。RRV疫苗在81％接種者中誘導(dǎo)了同型中和抗體反應(yīng)，而劑量大2000倍的牛RIT4237疫苗只在45％接種者中誘導(dǎo)了同型中和抗體，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯。
用WC3牛輪狀病毒株也進(jìn)行了效力試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，以107.0至107.3pfu劑量范圍對(duì)嬰兒和幼兒施用WC3病毒株(Clark等，美國兒童疾病雜志(Am.J.Dis.Child)140:350-356(1986))。盡管沒有供顯著免疫原性需要的劑量數(shù)據(jù)，但是Clark等注意到WC3株似乎具有類似于RIT4237那些的安全特性，但是比使用牛RIT4237的劑量小至少5倍的劑量是有免疫原性的，盡管這種免疫原性仍然需要比獼猴輪狀病毒疫苗的劑量大得多的劑量。
已使用WC3輪狀病毒株作為產(chǎn)生攜帶各種人輪狀病毒株的重排列的親本株之一(Clark等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)(增刊)174:73-80(1996))。在一個(gè)效力試驗(yàn)中，以三次劑量方案對(duì)嬰兒和嬰幼兒施用107.3pfu的WC3和人輪狀病毒VP7血清型1的一價(jià)重排列(Treanor等，Ped.Inf.Dis.J.14:301-307(1995))。關(guān)于這項(xiàng)試驗(yàn)沒有報(bào)道免疫原性數(shù)據(jù)。在另一項(xiàng)效力研究中，使用了一種四價(jià)制劑，其含有牛輪狀病毒W(wǎng)C3和人輪狀病毒VP7血清型1,2或3的三種人VP7重排列，以及作為第四種成分的攜帶帶有從牛輪狀病毒W(wǎng)C3衍生的保留基因的人輪狀病毒VP4蛋白質(zhì)的人×牛重排列。以107.0pfu的劑量使用三種VP7重排列的每一種，同時(shí)以5×106.0pfu的劑量施用VP4重排列(Clark等，Arch,Virol(增刊)12:187-198(1996)；Clark等，傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)(增刊)174:73-80(1996)；Vesikari等，Arch.Virol(增刊)12:177-186(1996))。也沒有報(bào)道該項(xiàng)試驗(yàn)的免疫原性數(shù)據(jù)，但是這些研究表明為了特征性產(chǎn)生和用獼猴輪狀病毒或人×獼猴重排列獲得的保護(hù)應(yīng)答相似的保護(hù)應(yīng)答需要107至108.3pfu的劑量(Clark等，Arch.Virol(增刊)12:187-198(1996)；Vesikari等，Arch.Virol(增刊)12:177-186(1996))。該劑量比獼猴輪狀病毒和人×獼猴輪狀病毒重排列疫苗組合物需要的劑量高10-100倍。
已經(jīng)開發(fā)出了多價(jià)輪狀病毒疫苗組合物。特別地，將代表人血清型1,2和4的三種人×獼猴輪狀病毒重排列與獼猴輪狀病毒株(RRV)組合(后者具有人血清型3的中和特異性)，形成四價(jià)疫苗組合物(Perez-Schael等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)28:553-558(1990)；Flores等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.),31:2439-2445(1993))。和使用一價(jià)獼猴輪狀病毒一樣，發(fā)現(xiàn)接種的嬰兒中15％至33％對(duì)人×獼猴重排列輪狀病毒疫苗組合物產(chǎn)生暫時(shí)低水平發(fā)熱癥狀(Perez-Schael等，出處同上文)。這種暫時(shí)發(fā)熱事件或癥狀盡管一般情況下父母和臨床試驗(yàn)健康護(hù)理人員認(rèn)為是可接受的，但是在某些情況下可能是不允許的，例如可能具有低水平的被動(dòng)獲得的對(duì)輪狀病毒的母體抗體的早產(chǎn)兒等等。
盡管美國食品和藥品管理局最近批準(zhǔn)的以動(dòng)物輪狀病毒為基礎(chǔ)的輪狀病毒疫苗組合物提供了人抗輪狀病毒感染的重要水平的保護(hù)作用，但是期望具有高感染性并且產(chǎn)生極低的或者不產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)的多價(jià)疫苗組合物，尤其是對(duì)于某些臨床情況尤其如此。本發(fā)明出人意料地滿足這些和其它相關(guān)的需要。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以包括另外的相應(yīng)于人輪狀病毒VP7血清型5和/或9的人×牛輪狀病毒重排列，或者與人輪狀病毒VP7血清型10起交叉反應(yīng)的?！僚Ｖ嘏帕?，或者包含人輪狀病毒VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒來提供具有更寬使用范圍的免疫原性組合物。特別令人感興趣的是包括輪狀病毒重排列D×UK,DS-1×UK,P×UK,ST-3×UK和Wa(VP4)×UK株的五價(jià)組合物；包括上述五價(jià)組合物加VP7，血清型9×UK株的六價(jià)組合物，和包括上述六價(jià)組合物加VP7血清型5×UK株的七價(jià)組合物或者上述七價(jià)組合物加VP7血清型10×UK株。另外的輪狀病毒株當(dāng)它們被識(shí)別在人體內(nèi)產(chǎn)生明顯的疾病時(shí)則也可以制備成牛輪狀病毒重排列并且加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的免疫原性組合物一般以小于大約106.0噬斑形成單位的各輪狀病毒VP7或VP4血清型重排列的劑量配制。特別優(yōu)選的是該劑量在大約105至小于大約106噬斑形成單位之間。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)于人輪狀病毒抗原的免疫原性應(yīng)答并且很少或不伴隨暫時(shí)低水平發(fā)燒的方法。這些方法包括對(duì)個(gè)體施用免疫原性足夠量的多價(jià)人×牛重排列輪狀病毒組合物，其包括至少4種VP7血清型的人輪狀病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含該組合物的人×牛重排列輪狀病毒包括人輪狀病毒血清型1×牛輪狀病毒株UK，人輪狀病毒血清型2×牛輪狀病毒株UK，人輪狀病毒血清型3×牛輪狀病毒株UK和人輪狀病毒血清型4×牛輪狀病毒株UK。所述多價(jià)組合物還可以包括但不限于，即血清型5和/或血清型9的人×牛重排列輪狀病毒，或者具有人輪狀病毒VP7血清型10特異性的?！僚Ｖ嘏帕休啝畈《荆蛘呷溯啝畈《狙逍蚔P4A×牛輪狀病毒UK重排列等等。此外，當(dāng)另外的輪狀病毒血清型被認(rèn)識(shí)在人疾病中重要時(shí)，它們也可以被加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中并且在刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)目前認(rèn)識(shí)的和新認(rèn)識(shí)的臨床上重要的輪狀病毒的免疫原性應(yīng)答的方法中使用。
因此本發(fā)明的免疫原性組合物具體包括重排列人×牛輪狀病毒和生理可接受載體的組合以形成多價(jià)組合物。在具體的實(shí)施方案中，所述多價(jià)免疫原性組合物包括在世界上最普遍的臨床上相關(guān)的血清型的人輪狀病毒的四種重排列人×牛輪狀病毒的組合以形成四價(jià)組合物。以免疫原性足夠量對(duì)需要抗輪狀病毒的免疫保護(hù)的個(gè)體，例如嬰兒，兒童或成人施用所述免疫原性組合物。當(dāng)這樣的個(gè)體接著用野生型人輪狀病毒株感染時(shí)，所述組合物誘發(fā)至少部分保護(hù)抗嚴(yán)重的輪狀病毒疾病癥狀，例如嚴(yán)重腹瀉和脫水免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。因?yàn)樗雒庖咴越M合物的重排列病毒感染宿主的消化道，一些輕度的疾病可能會(huì)作為接種結(jié)果發(fā)生，但是本發(fā)明的免疫原性組合物一般不引起接種者臨床上相關(guān)的發(fā)燒或反應(yīng)。接種后，有可檢測水平的宿主產(chǎn)生的血清抗體，其能中和組成所述免疫原性組合物的輪狀病毒的血清型。特別地，本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物對(duì)大多數(shù)以不同方式流行的臨床上相關(guān)的A組人輪狀病毒產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明的教導(dǎo)不限于目前，如果不是全部的，識(shí)別的臨床上相關(guān)的那些人輪狀病毒血清型，而是還包括將來顯出臨床相關(guān)性的那些人輪狀病毒血清型。
是本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物的一個(gè)成分的重排列輪狀病毒是分離的形式并且一般是純化的形式。分離是指從其制備的其它細(xì)胞或病毒產(chǎn)物例如野生型病毒和細(xì)胞培養(yǎng)物或其它體系的其它異源成分分離的重排列輪狀病毒。
一般情況下，通過用適應(yīng)組織培養(yǎng)的動(dòng)物例如牛，獼猴等輪狀病毒和適應(yīng)組織培養(yǎng)的人輪狀病毒在培養(yǎng)物中共傳染哺乳動(dòng)物細(xì)胞來制備輪狀病毒重排列。一般情況下，非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞被用作共感染的宿主細(xì)胞。用動(dòng)物和人輪狀病毒共感染后，一般通過將共感染培養(yǎng)物的生長產(chǎn)物暴露給對(duì)要被人輪狀病毒基因置換的動(dòng)物輪狀病毒基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物特異性的中和抗體來實(shí)現(xiàn)期望的重排列的選擇(參見U.S.4571385，這里引作參考)。特別地，可以使用多克隆血清或?qū)ε］啝畈《綱P7和/或VP4蛋白質(zhì)特異性的單克隆抗體。幾輪噬斑純化和傳代后，表征選擇的重排列的血清型和基因型。一般通過噬斑減少中和試驗(yàn)(PRN)或酶免疫測定確定血清型。一般通過病毒基因組的電泳和RNA-RNA雜交來確定基因型。對(duì)于多價(jià)免疫原性組合物一般選擇只具有人VP7或VP4基因的輪狀病毒重排列。也可以使用包括多人輪狀病毒基因的重排列。就這一點(diǎn)來說，感興趣的重排列輪狀病毒特別是那些編碼人輪狀病毒VP7和/或人輪狀病毒VP4基因產(chǎn)物的。
在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的輪狀病毒重排列是包括編碼VP7的人輪狀病毒基因和牛輪狀病毒源的保留的10個(gè)輪狀病毒基因的人輪狀病毒和牛輪狀病毒重排列。牛輪狀病毒株UK(Woode等，獸醫(yī)科學(xué)研究(Res.Vet.Sci.)16:102-105(1974)；Bridger和Woode，英格蘭獸醫(yī)雜志(Br.Vet.J.),131:528-535(1975))是特別優(yōu)選的，因?yàn)槠湎底V和根據(jù)本發(fā)明證明的其對(duì)人的更高水平的感染性。這里證明的UK牛輪狀病毒重排列的高感染性水平指需要更低的劑量，因而每劑量的制備成本應(yīng)該比其他目前已知的牛輪狀病毒重排列疫苗低得多。其他動(dòng)物輪狀病毒株也可以用來制備重排列輪狀病毒，只要當(dāng)以小于106.0噬斑形成單位的劑量施用每一種輪狀病毒血清型時(shí)組合物能在接種者中誘導(dǎo)血清反應(yīng)并且不產(chǎn)生暫時(shí)低水平發(fā)熱反應(yīng)。例如在一些實(shí)施方案中，所述重排列輪狀病毒包括與人VP7血清型10起免疫學(xué)交叉反應(yīng)的動(dòng)物VP7抗原。這種重排列輪狀病毒可以是?！僚Ｖ嘏帕小?br> 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用事先獲得的重排列可以產(chǎn)生具體血清型的重排列輪狀病毒。例如，為了制備另外的牛UK重排列，可以使用人輪狀病毒VP7血清型1D株×牛UK重排列HD/BRV-1(ATCC VR-2069)來產(chǎn)生具有人輪狀病毒VP7血清型2,3,4,9和/或牛輪狀病毒VP7血清型10的人輪狀病毒×牛UK重排列。使用的方法類似于上述那些，除了使用多克隆和對(duì)親本人輪狀病毒重排列的VP7血清型特異性的單克隆中和抗體來選擇期望的人(和/或牛)輪狀病毒VP7血清型的新的重排列。作為本發(fā)明的一部分也涉及當(dāng)分離和鑒定了其他臨床相關(guān)的人VP4或VP7血清型，通過描述的方法可以制備新發(fā)現(xiàn)的血清型的重排列輪狀病毒。
可以在支持輪狀病毒生長的多種細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖重排列的輪狀病毒。用于增殖用于疫苗應(yīng)用的輪狀病毒重排列的優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)物包括原代或繼代猴非洲綠猴腎細(xì)胞(AGMK)，合格的的二倍體猴FehL-2細(xì)胞和合格的猴異倍體Vero細(xì)胞。一般以感染復(fù)數(shù)范圍是大約0.1-1.0/細(xì)胞或更大，用輪狀病毒重排列接種細(xì)胞并且在適合病毒復(fù)制的條件下培養(yǎng)大約3-5天，或者病毒達(dá)到適當(dāng)?shù)牡味ǘ人枰臅r(shí)間。從感染的細(xì)胞培養(yǎng)物收集輪狀病毒重排列，一般通過公知的澄清方法，例如離心，從細(xì)胞成分中分離，并且可以根據(jù)需要使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法純化。
在用作為免疫原性組合物的優(yōu)選的實(shí)施方案中，血清型1，血清型2，血清型3和血清型4的人×牛重排列輪狀病毒被用作四價(jià)疫苗。一般情況下，四種血清型的每一種的人×牛重排列輪狀病毒被混合形成同時(shí)施用的聯(lián)合的組合物。通過各輪狀病毒重排列的免疫原性確定各輪狀病毒血清型的最后比例。盡管不是優(yōu)選的，也可以以順序方式施用各人×牛重排列或者它們的組合，以提供有效的疫苗制劑。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，將血清型1，血清型2，血清型3和血清型4的人×牛重排列輪狀病毒和VP7血清型5和/或9的人×牛重排列輪狀病毒，VP7血清型10的?！僚Ｖ嘏帕休啝畈《?，和/或VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒聯(lián)合，得到多價(jià)免疫原性組合物。上面描述的另外的重排列輪狀病毒可以以任何組合的形式用作六價(jià)，七價(jià)或八價(jià)免疫原性組合物。
本發(fā)明的人×牛重排列輪狀病毒多價(jià)免疫原性組合物包含作為活性成分的免疫原有效量的至少4種這里描述的臨床上最重要的VP7血清型人輪狀病毒的每一種。特別地，以小于106.0噬斑形成單位的劑量施用各抗原性不同的人輪狀病毒重排列?？梢允褂蒙砜山邮茌d體和/或輔劑將所述免疫原性組合物引導(dǎo)到宿主特別是人中。有用的載體包括，例如檸檬酸鹽一碳酸氫鹽緩沖液，緩沖的水，一般的鹽水等等。得到的水溶液可以根據(jù)需要包裝備用或者根據(jù)需要使用技術(shù)人員公知的方法凍干。凍干的病毒一般在大約4℃下保存。當(dāng)要使用時(shí)，在施用之前將凍干的制劑與滅菌溶液混合，如上所述。
組合物可以含有對(duì)于近似的生理?xiàng)l件所要求的藥學(xué)可接受輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑等等，例如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，脫水山梨糖醇一月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯，檸檬酸鹽-碳酸氫鹽等等。當(dāng)口服施用組合物時(shí)，也可能需要提供給個(gè)體緩沖溶液以部分中和胃酸和在通過腸道時(shí)保護(hù)重排列輪狀病毒。適合該用途的緩沖溶液包括碳酸氫鈉，檸檬酸鹽碳酸氫鹽等等。用本發(fā)明的人×牛重排列輪狀病毒組合物免疫時(shí)，特別是通過口服途徑，宿主的免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生對(duì)輪狀病毒蛋白質(zhì)特異性的局部分泌和血清抗體對(duì)該組合物響應(yīng)。作為施用該組合物的一個(gè)結(jié)果，宿主變得至少部分或者完全對(duì)相應(yīng)于免疫血清型的野生病毒株引起的人輪狀病毒疾病有了免疫力。如果真發(fā)生了野生型病毒感染，宿主抵抗發(fā)生中等程度的或嚴(yán)重的輪狀病毒疾病，特別是腸胃道病毒疾病。
對(duì)易患或者以其它方式有輪狀病毒疾病危險(xiǎn)的人，特別是嬰兒，施用含有人×牛重排列輪狀病毒的本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物來誘導(dǎo)個(gè)體自身免疫應(yīng)答能力。這樣的量定義為“免疫原性有效量”。本發(fā)明中使用的免疫原性或“免疫原性有效量”指在接種者體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)疫苗組合物的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這樣的反應(yīng)由接種者產(chǎn)生特異性針對(duì)包括在本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原的血清抗體，B細(xì)胞，輔助T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞組成。認(rèn)為通過輪狀病毒群特異性或輪狀病毒血清型特異性分析測定的免疫接種后的高于接種前抗體滴定度4倍或更大的升高是顯著反應(yīng)。
在該應(yīng)用中，具體免疫原性組合物中的各人×牛重排列輪狀病毒血清型的精確量取決于患者的年齡，健康狀況和體重，給藥方式，制劑性質(zhì)等等，但是范圍一般是對(duì)于每個(gè)患者大約104至大約106噬斑形成單位，優(yōu)選大約105至小于106噬斑形成單位(pfu)的各血清型。
在所有情況下，用于免疫原性組合物的制劑應(yīng)該提供一定量的足以誘導(dǎo)個(gè)體抗輪狀病毒疾病的免疫應(yīng)答的本發(fā)明的各人×牛重排列輪狀病毒。優(yōu)選地，這種免疫應(yīng)答將有效防止個(gè)體的嚴(yán)重的或威脅生命的輪狀病毒疾病而不是“反應(yīng)原性的”。這里所使用的“反應(yīng)原性的”或反應(yīng)原性指施用免疫原性組合物之后的那個(gè)星期中發(fā)生的輕度的暫時(shí)發(fā)燒。本發(fā)明上下文中定義的發(fā)燒是成人口腔溫度大于或等于38℃，或者兒科接種者直腸溫度大于或等于38.1℃。
在一些情況下，將本發(fā)明的優(yōu)選的四價(jià)人×牛重排列輪狀病毒組合物與其他血清型的人輪狀病毒或其他感染劑，特是其他腸胃病毒聯(lián)合是有利的。例如，本發(fā)明的四價(jià)人×牛重排列輪狀病毒組合物可以進(jìn)一步包括，例如，血清型5的(Timenetsky等，普通病毒學(xué)雜志(J.General Virol.)78:1373-1378(1997))和/或血清型9的(Nakagomi等，微生物學(xué).免疫學(xué)(Microbiol.Immunol.)34:77-82(1990))人×牛重排列輪狀病毒，和/或與人輪狀病毒血清型10交叉反應(yīng)的牛×牛重排列輪狀病毒和/或VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒。可以同時(shí)(但是一般分開地)或順序地用另一種可能的胃腸病毒疫苗例如人杯狀病毒(例如Norwalk病毒)或相關(guān)疫苗給藥。
可以一次或多次施用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物。對(duì)新生兒和嬰兒，可能需要多次施用以激發(fā)足夠水平的免疫性，特別是在有高水平母體衍生的對(duì)輪狀病毒特異性的抗體的情況下。在出生頭2-4個(gè)月開始施用，并且在初次免疫后以一定時(shí)間間隔例如1-2個(gè)月或更長繼續(xù)免疫，或者根據(jù)需要誘導(dǎo)和保持足夠水平的抗人輪狀病毒感染的免疫性。類似地，特別易患反復(fù)或嚴(yán)重輪狀病毒疾病的成人，例如健康護(hù)理工作者，日常護(hù)理工作者，兒童家庭成員，老年人等等，可能需要多次免疫以建立和/或保持有效免疫應(yīng)答。通過測定血清或分泌物中輪狀病毒群特異性抗體或血清型特異性中和抗體的量可以監(jiān)測誘導(dǎo)的免疫性的水平。當(dāng)需要保持期望水平的免疫性時(shí)，用本發(fā)明的一種或多種血清型的多價(jià)重排列輪狀病毒組合物調(diào)整劑量或重復(fù)接種。
為了詳細(xì)說明而不是限制目的提供下面的實(shí)施例。
實(shí)施例Ⅰ該實(shí)施例描述了從人輪狀病毒株D(VP7:1),DS-1(VP7:2),P(VP7:3)和ST(VP7:4)和牛UK Compton(UK)輪狀病毒衍生的輪狀病毒重排列的制備，并且分別評(píng)價(jià)了各重排列對(duì)成人，兒童和嬰兒的安全性，免疫原性和反應(yīng)原性。
從牛UK Compton(UK)病毒株和從人輪狀病毒株D(VP7血清型1,ATCC VR-970),DS-1(VP7血清型2；Wyatt等，透視病毒學(xué)(Perspect.Virol.)10:121-145(1978))和P(VP7血清型3，Wyatt等，科學(xué)207:189-171(1983))和ST3(VP7血清型4；Banatvala等，美國獸醫(yī)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)173:527-530(1978))衍生代表VP7血清型1,2,3和4的人×牛重排列輪狀病毒株。從腹瀉住院兒童的大便回收人輪狀病毒株D,DS-1和P；病毒株D和DS-1在無菌小牛中增殖和傳代(Wyatt等，1978，上文；和Midthun等，1985，病毒雜志(J,Virol.)53:949-954)，然后只在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而病毒株P(guān)只在AGMK組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從無癥狀新生兒的大便中分離人輪狀病毒株ST3并且在AGMK細(xì)胞中傳代。從患有腹瀉的沒有喂初乳的牛的糞便在原代牛腎細(xì)胞中分離牛UK Compton輪狀病毒株(Woode等，Res.Vet.Sci.)16:102-105(1974))。Flewett等，在RegionalVirus Laboratory，東伯明翰醫(yī)院(East Birmingham Hospital)，伯明翰，英國進(jìn)行了該病毒在原代牛腎細(xì)胞中的進(jìn)一步傳代并且送給Nation Institutes of Health,Bethesda,MD。在NIH，病毒在原代牛胚腎細(xì)胞，原代AGMK細(xì)胞和在二倍體猴BDS-FRhL細(xì)胞中連續(xù)傳代。種子集合包含在AGMK細(xì)胞中噬斑純化的病毒并且在原代牛腎細(xì)胞培養(yǎng)物中傳代。
描述過攜帶從人輪狀病毒D,DS-1,P或ST3株衍生的一個(gè)VP7編碼基因和從牛UK株衍生的保留10個(gè)基因(lot BR-3，克隆22)的各人×牛輪狀病毒重排列(Midthund等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)24:822-826(1986)和Midthund等，病毒雜志(J,Virol.)53:949-954(1985)，美國專利號(hào)4571385，所有這些文獻(xiàn)在這里引作參考)。分別制備在這些臨床試驗(yàn)中使用的D×UK,DS-1×UK,P×UK和ST3×UK疫苗懸浮液，即lotHD BRV-1，克隆47-1-1(ACTT VR-2069和ACTT VR-2617),105.8pfu/ml；lot HDS1 BRV-1,克隆66-1-1(ACTT VR-2616),105.3pfu/ml；lot HP BRV-2，克隆22-1-1(ACTT VR-2611),105.3；和lot ST3 BRV-1,克隆52-1-1(ACTTVR-2612),105.8pfu/ml,并且成功測定了安全性證明免除了根據(jù)技術(shù)人員公知的美國食品和藥品管理局的標(biāo)準(zhǔn)的偶發(fā)因素。
以隨機(jī)的安慰劑對(duì)照的方式進(jìn)行所有的兒科研究和用D×UK人×牛重排列輪狀病毒對(duì)成人的一項(xiàng)研究來評(píng)價(jià)各候選輪狀病毒疫苗株的安全性和免疫原性。依次在18-45歲成人，6-60月齡的兒童，最后對(duì)1.5-5.9月齡的嬰兒評(píng)價(jià)各人×牛重排列輪狀病毒的安全性。在JohnHopkins大學(xué)，免疫研究中心，Baltimore,MD或者在VaccineClinic,Vanderbilt大學(xué)，Nashville,TN進(jìn)行各項(xiàng)研究。
Halsey等，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)158:1261-1267(1988)描述了對(duì)于輪狀病毒疫苗試驗(yàn)的成人和兒科受試者的選擇的標(biāo)準(zhǔn)。首先對(duì)成人評(píng)價(jià)各輪狀病毒重排列的未稀釋的劑量。接著，對(duì)6-60月齡兒童評(píng)價(jià)各重排列的1∶10稀釋液和接著的P×UK的未稀釋劑量(105.3pfu)。對(duì)這些兒童證實(shí)了各重排列的安全性之后，接著也對(duì)小于6個(gè)月的嬰兒評(píng)價(jià)了D×UK和DS-1×UK的1∶10劑量和未稀釋劑量。因?yàn)樗坪跣枰聪♂寗┝康倪@些重排列來感染大多數(shù)嬰幼兒，在未稀釋的情況下對(duì)小于6個(gè)月的嬰兒施用了P×UK或ST3×UK重排列。
最初，對(duì)血清中有低水平的VP7血清型1特異性中和抗體的5名健康成人志愿者評(píng)價(jià)了105.8pfu的D×UK重排列輪狀病毒株的安全性。用于對(duì)成人研究的臨床程序是先前Halsey等，出處同上文，描述過的那些，有幾處除外。簡要地說，在給與各輪狀病毒之前和之后所有的受試者都禁食至少1小時(shí)。各成人志愿者飲用含有2克碳酸氫鈉的120毫升蒸餾水，1分鐘后飲用懸浮于30毫升緩沖液中的1毫升未稀釋候選疫苗或31毫升安慰劑(沒有疫苗的緩沖溶液)。每天記錄兩次口腔溫度并且在20分鐘內(nèi)再次檢查升高的溫度。施用輪狀病毒后收集大便樣品7天并且記錄大便的稠度和次數(shù)并且在接種后每天也記錄癥狀，記錄7天。
兒科研究的大部分程序也和Halsey等，出處同上文，描述過的那些相同，有幾處除外。簡要地說，在施用輪狀病毒或安慰劑之前或之后至少2星期，按照時(shí)間安排給出適合兒童年齡的常規(guī)兒童期免疫。禁食1小時(shí)后，各兒科受試者隨機(jī)接受輪狀病毒或安慰劑，比例是2∶1。各兒童飲用混合有0.4克碳酸氫鈉的10毫升嬰兒制劑(Similac；RossLaboratories,Columbus,OH)，然后飲用1毫升輪狀病毒重排列或安慰劑(緩沖制劑或Eagle’s極限必需培養(yǎng)基)。為了提高免疫原性，在接受第一劑量之后4-12星期對(duì)接受了105.8pfu的D×UK輪狀病毒重排列的小于6個(gè)月的嬰兒提供第二劑量的該病毒。
在D×UK和DS-1×UK重排列的研究中，每天記錄一次兩次直腸溫度，和如果有癥狀的話，每天記錄癥狀。父母每天收集大便樣品并且記錄他們的孩子每天排泄的大便在次數(shù)和稠度。P×UK和ST-3×UK兒科研究程序類似，只是稍有改變。
口服輪狀病毒之后7天內(nèi)如果他們腹瀉，或者發(fā)生明顯的嘔吐或發(fā)燒，則認(rèn)為研究的受試者有“輪狀病毒樣病”(即可能是由輪狀病毒引起的病)。腹瀉定義為48小時(shí)內(nèi)三次或多次不成形的大便。發(fā)燒定義為在10-20分鐘內(nèi)證實(shí)成人口腔溫度大于等于37.8℃，兒科受試者直腸溫度大于等于38.1℃。
在施用輪狀病毒之前和之后4-6星期從各研究參與者收集血樣用于測定輪狀病毒特異性抗體和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平；后者用來確定疫苗是否副作用地影響肝功能。對(duì)成人，在施用輪狀病毒之后1星期還收集另外的血樣用于測定ALT水平。
根據(jù)Midthun等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)27:2799-2804(1989)和Hoshino等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)21:425-430(1985)所述，使用獼猴輪狀病毒作為群特異性抗原，通過ELISA對(duì)接種前和接種后血清測定輪狀病毒特異性IgA和IgG抗體，其中所述文獻(xiàn)在這里引作參考。根據(jù)Midthun等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)27:2799-2804(1989)所述通過噬斑減少中和(PRN)抗體試驗(yàn)也檢測了成對(duì)血清。PRN試驗(yàn)中使用的輪狀病毒包括Wa(血清型1),DS-1(血清型2),P(血清型3)和ST3或VA70(血清型4)人輪狀病毒株加；D×UK,DS-1×UK,P×UK，和ST3×UK重排列病毒株和UK(Compton)牛輪狀病毒株。通過ELISA IgA或ELISA IgG測定或PRN抗體測定測得的與接種前血清相比接種后血清中抗體滴定度升高四倍或更多被認(rèn)為是明顯應(yīng)答。
將冷凍大便樣品解凍并且在小牛肉浸漬肉湯中制備成10％的大便懸浮液。將該大便懸浮液接種到猴MA104細(xì)胞培養(yǎng)試管中并且在37℃下在滾筒中溫育7天。將來自細(xì)胞培養(yǎng)的上清液盲傳到新鮮的猴MA104細(xì)胞培養(yǎng)試管中并且在37℃下溫育7天。在-20℃下保存10％的大便懸浮液和來自各套培養(yǎng)物的上清液，直到后來將它們解凍并且用于通過ELISA的輪狀病毒測定。通過聚合酶鏈反應(yīng)來確定排泄出的輪狀病毒的血清型而將接種后收集的選擇的輪狀病毒陽性大便樣品血清分型(Gouvea等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)28:276-282(1990和Gouvea等，臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)32:1333-1337(1994)，各文獻(xiàn)在此引作參考)。
對(duì)研究受試者的腹瀉大便檢查了卵和寄生蟲，對(duì)它們檢測了沙門氏菌，志賀氏菌，彎曲桿菌，氣單胞菌，耶爾森氏菌，腸病毒，腺病毒和輪狀病毒。通過電子顯微鏡也對(duì)腹瀉大便檢查了輪狀病毒和其它病毒顆粒。為了檢查與間發(fā)性疾病相關(guān)的偶發(fā)因素，從在研究P×UK和ST3×UK重排列的7天觀察期內(nèi)發(fā)燒或有呼吸綜合癥的研究受試者收集鼻化驗(yàn)標(biāo)本或鼻沖洗出的標(biāo)本，并且在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定這些樣品的呼吸病毒。
使用two-tailed Fisher’s exact檢驗(yàn)比較各年齡組中的這些組和每一項(xiàng)研究中接種者和安慰劑受者發(fā)生疾病的比例和血清反應(yīng)的比例。
表1給出了一次口服各VP7-血清型-特異性人×UK牛輪狀病毒重排列之后大便中檢測出輪狀病毒或者血清抗體滴定度提高4倍或更大的成人，兒童和嬰兒的百分比。在來自成人接種者，喂給未稀釋的P×UK重排列的小于6個(gè)月的嬰兒，或者安慰劑受試者的大便的細(xì)胞培養(yǎng)物沒有回收到輪狀病毒。只有小比例的(ⅰ)給與D×UK,DS-1×UK,P×UK重排列的1∶10稀釋物的6-60個(gè)月齡的兒童或者(ⅱ)施用未稀釋的D×UK,DS-1×UK株的小于6個(gè)月的嬰兒排泄出輪狀病毒。在大多數(shù)情況下，在第二細(xì)胞培養(yǎng)傳代之后只有一個(gè)或兩個(gè)大便樣品檢測到輪狀病毒。相反，更經(jīng)常地且較長期地是從嬰兒和幼兒的大便中回收到ST3×UK病毒(通常經(jīng)3天或3天以上回收的大便，尤其是在接種后5-7天內(nèi))。在接種后第30天從一名23個(gè)月齡的兒童的大便分離到ST3×UK病毒并且通過PCR證實(shí)。從9名ST3×UK輪狀病毒重排列受試者的大便回收到的病毒的定量測定表明排泄出的病毒的最大量是每毫升10％大便懸浮液中有4.7×102噬斑形成單位(pfu)。
通過來自10名疫苗接受者的10％的大便懸浮液(9/9)或大便組織培養(yǎng)傳代(1/1)的PCR測定證實(shí)所有10名接種者都排泄出ST3×UK輪狀病毒重排列。但是，這些接種者中有3名還排泄出野生型輪狀病毒VP7血清型1人輪狀病毒株(一名嬰兒)或VP7血清型3株(一名兒童和一名嬰兒)。對(duì)沒有輪狀病毒樣病的三名兒科患者的數(shù)據(jù)沒有進(jìn)行血清分析。
與嬰兒相比，對(duì)成人和較大兒童(他們可能以前感染過野生型輪狀病毒)檢測對(duì)輪狀病毒的血清反應(yīng)的次數(shù)少(表1)。在分別喂有D×UK,DS-1×UK或ST3×UK重排列的成人的23％,18％和15％中檢測到血清反應(yīng)，但是在接種P×UK重排列的成人中沒有發(fā)現(xiàn)一人有血清反應(yīng)。在接受1∶10稀釋液的6-60個(gè)月齡的兒童中，對(duì)33％的D×UK受試者，40％的DS-1×UK受試者和57％的ST3×UK受試者檢測到血清反應(yīng)。104.3pfu劑量的P×UK重排列對(duì)6和60個(gè)月齡之間的兒童沒有激發(fā)任何抗體反應(yīng)，但是高10倍劑量的該組合物中中等程度免疫原性的，在口服該重排列的該年齡組中的11名兒童中有5名(45％)檢測到了抗體反應(yīng)。
表1施用單一劑量的人VP7血清型-特異性-牛UK輪狀病毒重排列疫苗之后嬰兒，兒童和成人的病毒反應(yīng)和血清反應(yīng)
注pfu-噬斑形成單位；NT=沒有測定。
感染定義為通過ELISA IgA或IgG測定或者噬斑減少中和測定測定的血清輪狀病毒特異性抗體增加4倍或更大的病毒排出的證據(jù)。
*在噬斑減少中和測定中使用的輪狀病毒疫苗和人輪狀病毒株是D×UK和Wa；DS-1×UK和DS-1；P×UK和P；和ST3×UK和ST3株。
+沒有測定來自一名嬰兒和兩名兒童的血清樣品。
**料排泄輪狀病毒重排列并且有通過PCR分析的大便中有野生型輪狀病毒的證據(jù)的一名兒童和兩名嬰兒。抗體反應(yīng)分析不包括這三名接種者的血清學(xué)結(jié)果。
在喂給輪狀病毒的小于6個(gè)月齡的嬰兒中，與接受1∶10或未稀釋劑量的衍生自D(50-63％)，DS-1(82％)或P(63-80％)人輪狀病毒株的人×牛UK重排列的那些受試者相比，接受未稀釋劑量的衍生自ST3人輪狀病毒株的人×牛UK重排列的受試者更經(jīng)常(93％)檢查到血清學(xué)反應(yīng)(免疫原性的一個(gè)量度)。這些對(duì)于劑量來說的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上不明顯的?？傊?，在除了其中通過IgA ELISA最經(jīng)常地檢測到抗體反應(yīng)的D×UK疫苗組之外的所有疫苗組中，與通過ELISA IgA或IgG測定(使用獼猴輪狀病毒作為群特異性抗原)相比，通過噬斑減少中和(PRN)測定(使用同源重排列病毒作為抗原)更經(jīng)常地檢測到抗體反應(yīng)。對(duì)于這些重排列中的三個(gè)，接種嬰兒的接種后血清中的中和抗體比抗人輪狀病毒親代株更經(jīng)常地針對(duì)抗重排列輪狀病毒，提示牛輪狀病毒的VP4中和作用抗原是優(yōu)勢免疫的。對(duì)喂給105.3pfu的DS-1×UK并且產(chǎn)生抗UK牛輪狀病毒親代株(沒有給出數(shù)據(jù))或DS-1×UK重排列的中和抗體分別顯著增加55％和82％比例而他們中沒有一人產(chǎn)生抗DS-1人輪狀病毒親代株中和抗體的顯著增加的11名嬰兒的接種后血清的PRN試驗(yàn)的結(jié)果中這一點(diǎn)尤其明顯。
但是，VP7和VP4反應(yīng)的絕對(duì)解離不是通例，因?yàn)榻邮軉我粍┝康?型(D)人×牛輪狀病毒重排列的嬰兒接種者在50％的情況下對(duì)人輪狀病毒血清學(xué)1親代產(chǎn)生了VP7-特異性中和抗體應(yīng)答。另外，對(duì)于人輪狀病毒3型(10％)和4型(8％)也觀察到同型VP7中和抗體反應(yīng)，以較低的頻率。應(yīng)該注意，和在對(duì)于下文四價(jià)制劑的實(shí)施例Ⅱ一樣，當(dāng)以兩個(gè)月的時(shí)間間隔施用三個(gè)依次劑量的重排列時(shí)，人×牛輪狀病毒重排列的免疫原性要大得多。因此，該擴(kuò)大的免疫方案誘導(dǎo)了對(duì)于各重排列的人輪狀病毒親代株的VP7-特異性中和抗體反應(yīng)，在血清型2,3和4的情況下，明顯超過單一劑量重排列之后觀察到的反應(yīng)。具體地說，32％的嬰兒接種者對(duì)血清型2反應(yīng)，33％的嬰兒接種者對(duì)血清型3反應(yīng)，42％的嬰兒接種者對(duì)血清型4反應(yīng)。對(duì)于血清型1沒有注意到改進(jìn)，在這種情況下給予單一劑量的該重排列之后免疫原性已經(jīng)很高了。
沒有證據(jù)證明安慰劑受試者的大便中排泄輪狀病毒，也沒有證據(jù)證明該組中有輪狀病毒血清反應(yīng)，除了一名6個(gè)月齡的安慰劑受試者ELISA IgG抗體的滴定度增大了4倍，但是在其他測定中沒有其他血清學(xué)反應(yīng)。
每一種輪狀病毒重排列表現(xiàn)出安全性和好的耐受性，這一點(diǎn)通過成人不存在腸胃疾病來證明，每一個(gè)疫苗組和年齡組中的兒科接種者和安慰劑受試者之間“輪狀病毒樣病”的比例沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯的增加也證明這一點(diǎn)(表2)。只有三名成人志愿者(接受P×UK或ST3×UK疫苗)有一些符合“輪狀病毒樣病”標(biāo)準(zhǔn)的癥狀(發(fā)燒)，但是這些有病的接種者中沒有一人有輪狀病毒感染的證據(jù)。施用輪狀病毒之后發(fā)燒的所有三個(gè)成人伴隨有呼吸疾病并且排泄出呼吸病毒，這通過鼻化驗(yàn)樣品的組織培養(yǎng)分析來檢測。一名患有竇炎，咳嗽和鼻溢的P×UK受試者有對(duì)流感A病毒陽性培養(yǎng)物；另一名P×UK受試者有對(duì)呼吸合胞體病毒(RSV)的陽性培養(yǎng)物；一名ST3×UK受試者有咳嗽，鼻溢和嘶啞聲。這些志愿者的伴隨呼吸疾病，回收到呼吸病原體以及沒有輪狀病毒感染的證據(jù)表明這些發(fā)燒可能是由于間發(fā)性呼吸道感染。
對(duì)兒科患者的四種輪狀病毒疫苗候選物的大多數(shù)研究中也發(fā)生間發(fā)性疾病。與咳嗽相關(guān)的嘔吐和與中耳炎相關(guān)的發(fā)燒或呼吸癥狀是常見的。盡管間發(fā)性疾病的背景很高，但是每一個(gè)疫苗組中6-60個(gè)月齡兒童和小于6個(gè)月齡的兒童中“輪狀病毒樣病”(發(fā)燒，腹瀉或嘔吐)的比例在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯不同于安慰劑受試者(表2)?？傊?，接種后7天內(nèi)48名接受重排列輪狀病毒的6-60個(gè)月齡兒童中有8名，27名接受安慰劑的人中有3名有“輪狀病毒樣病”。這些輪狀病毒樣病人中只有兩名與輪狀病毒感染相關(guān)。口服DS-1×UK重排列之后發(fā)病的兩名病人都是病狀溫和并且自限的在第2天一名兒童發(fā)燒(最高38.5℃)；另一名兒童在第2天和第3天嘔吐三次。
表2．口服人VP7血清型-特異性牛UK輪狀病毒重排列疫苗或安慰劑之后成人和嬰兒的發(fā)病率
注輪狀病毒樣病定義為如分中定義的存在發(fā)燒，腹瀉或嘔吐。
*結(jié)果以接種后4-6天收集的血樣中測定的ALT水平為基礎(chǔ)。
從喂給ST3×UK的兩名6-60個(gè)月齡的兒童分離到柯薩奇病毒B5或艾柯病毒和巨細(xì)胞病毒。還從相同研究中三名安慰劑受試者分離到腺病毒或副流感3型病毒。
在小于6月齡的研究受試者中，在口服第一劑量的輪狀病毒重排列之后7天內(nèi)71名疫苗受試者中有23人，36名安慰劑受試者中有8人經(jīng)歷“輪狀病毒樣病”。沒有呼吸綜合癥或中耳炎的嬰兒發(fā)燒(范圍38.2℃-38.3℃)比有呼吸綜合癥或中耳炎的嬰兒發(fā)燒(范圍38.4℃-40℃)低。大多數(shù)(8/12)嘔吐嬰兒只嘔吐一次或兩次；沒有人因?yàn)閲I吐而影響進(jìn)食或者導(dǎo)致脫水。表3給出了嬰兒(分類為感染的接種者，未感染的接種者或安慰劑受試者)中“輪狀病毒樣病”和呼吸道疾病或中耳炎嬰兒的比例。感染的接種者是接種后有輪狀病毒感染證據(jù)的疫苗受試者；未感染的接種者是接種后沒有輪狀病毒感染證據(jù)的疫苗受試者。對(duì)于每一疫苗組感染的接種者之中沒有一致模式的癥狀，感染的接種者和未感染的接種者或安慰劑受試者發(fā)病比例之間沒有明顯差異。提示觀察到的癥狀是間發(fā)性疾病的表現(xiàn)，如下所詳述。
在有輪狀病毒樣病的小于6個(gè)月齡的接種者當(dāng)中，14名是疫苗反應(yīng)者。其中三名疫苗反應(yīng)者具有輕度的有一個(gè)或兩個(gè)癥狀的輪狀病毒樣??；兩名只是發(fā)燒；三名發(fā)燒并伴隨呼吸疾病或中耳炎；9名嘔吐一次或多次(最多6次)并且其中三名咳嗽后嘔吐。三名疫苗反應(yīng)者在喂給105.8pfu的ST3×UK之后有中等至嚴(yán)重的“輪狀病毒樣病”，但是他們也有間發(fā)性呼吸病毒感染。從洗鼻標(biāo)本分離到了腺病毒和巨細(xì)胞病毒。另外，從高燒3天(最高40℃)的一個(gè)兒童的大便回收到合適的輪狀病毒重排列，但是該兒童也有鼻溢，咳嗽和中耳炎5天。該兒童住院并且用萬古霉素和頭孢菌素根據(jù)經(jīng)驗(yàn)治療直到?jīng)]有膿毒?。凰届o地恢復(fù)健康。從持續(xù)2天發(fā)燒(最高39.3℃)和中耳炎的一名嬰兒的鼻標(biāo)本培養(yǎng)副流感病毒和腺病毒；該兒童大便中也排泄出合適的輪狀病毒重排列。從持續(xù)超過3天發(fā)燒(最高38.6℃)，腹瀉(9次水樣大便)和持續(xù)3-4天喘息，咳嗽和鼻溢的另一名嬰兒的分離到流感A病毒(但不是輪狀病毒)。
表3．對(duì)感染或沒有感染有人-牛UK重排列輪狀病毒疫苗或接受安慰劑的小于6月齡的嬰兒鑒定的疾病和偶發(fā)因素。
注如果他們排泄出輪狀病毒和/或血清輪狀病毒-特異性抗體滴定度增加4倍或更大，則認(rèn)為嬰兒感染了施用的輪狀病毒重排列病毒。輪狀病毒樣病定義為發(fā)燒，嘔吐或腹瀉。RSV=呼吸合胞體病毒；CMV=巨細(xì)胞病毒。
如表3所示，沒有輪狀病毒感染證據(jù)的22名小于6月齡接種者中9名經(jīng)歷“輪狀病毒樣病”。從接受105.3pfu的DS-1×UK之后發(fā)燒并且34次拉痢疾性大便的一名嬰兒分離到空腸彎曲桿菌。從接受105.8pfu的D×UK之后也發(fā)燒并且有中耳炎的另一名嬰兒的腹瀉大便分離到嗜水氣單胞菌。并且還從接受D×UK重排列的兩名嬰兒和一名安慰劑受試者分離到呼吸合胞體病毒，他們都鼻溢，有或沒有喘息。
沒有由于用輪狀病毒重排列感染導(dǎo)致的肝損傷的證據(jù)。接種后4-6周ALT升高的兒科受試者的比例接種者的比例不比安慰劑受試者更大。只有兩名兒科接種者(一名嬰兒接種一次ST3×UK，另一名接受第二劑量的D×UK)具有升高的ALT值。該值小于兩倍正常值并且當(dāng)一星期內(nèi)重復(fù)時(shí)該值是正常的。接種后4-6周兩名安慰劑受試者也有輕度升高的ALT值。喂給D×UK或ST3×UK重排列后，成人志愿者(其中一些報(bào)道是酒消費(fèi)者)偶爾檢測到暫時(shí)的輕度的ALT值升高。這些志愿者中沒有一人有輪狀病毒感染證據(jù)。四名成人在施用D×UK后一周ALT升高；當(dāng)三星期后重復(fù)時(shí)，他們的ALT水平是正常的或者小于兩倍正常值(兩名志愿者)。兩名其他成人在接受ST3×UK重排列后一周ALT升高；施用輪狀病毒之后4星期他們的ALT水平是正常的。
盡管接受105.8pfu的D×UK重排列輪狀病毒的20名嬰兒中只有10名(50％)在一劑量之后產(chǎn)生了輪狀病毒特異性抗體，在之后4-12周用該重排列對(duì)14名嬰兒加強(qiáng)免疫在14名嬰兒中的12名(86％)激發(fā)抗體滴度增大4倍或更大，包括第一劑量之后產(chǎn)生抗體反應(yīng)的7名嬰兒。在接受兩個(gè)劑量的14名嬰兒中，第二劑量的凈效果在所有14名接種者中激發(fā)抗體并且加強(qiáng)抗輪狀病毒重排列中和抗體的水平，使幾何平均滴定度從第一劑量后1∶66變成第二劑量后的1∶336。
用D×UK加強(qiáng)免疫后，只有一名輪狀病毒重排列受試者排泄出輪狀病毒，且這只有一天，之后從該兒童沒能收到病毒。14名嬰兒(其中5名在第一劑量后沒有感染)中只有兩名在第二劑量后經(jīng)歷輪狀病毒樣病。一名在第一劑量后沒有感染輪狀病毒重排列的兒童在第二劑量后輕度發(fā)燒(最高38.1℃)伴隨有鼻溢。另一名兒童在第一劑量后感染重排列病毒，接受第二劑量后嘔吐4次。在該組中有一名接種者在加強(qiáng)劑量后具有升高的ALT值，當(dāng)重復(fù)時(shí)該值變?yōu)檎！?br> 實(shí)施例Ⅱ該實(shí)施例描述了四價(jià)人×牛重排列輪狀病毒免疫原性組合物，評(píng)價(jià)了其對(duì)成人，兒童和嬰兒的臨床安全性和免疫原性。
以相等體積混合實(shí)施例Ⅰ中描述的四種人×牛重排列輪狀病毒，形成單一的四價(jià)疫苗組合物。以安慰劑對(duì)照方式進(jìn)行所有的研究來評(píng)價(jià)混合的組合物的安全性和免疫原性。根據(jù)實(shí)施例Ⅰ的描述進(jìn)行所有的血清型和微生物學(xué)測定。
在Johns Hopkins大學(xué)免疫研究中心對(duì)17名成人(11名疫苗受試者和6名安慰劑受者)評(píng)價(jià)單一劑量的未稀釋的含有105.3-105.8PFU每一種重排列的四價(jià)人(VP7血清型1,2,3和4)-牛UK輪狀病毒疫苗。在給予疫苗或安慰劑之前或之后研究受試者禁食至少1小時(shí)。對(duì)他們喂給中和胃酸的120毫升緩沖液(碳酸氫鈉)，一分鐘后給予混合有緩沖液的四價(jià)免疫原性組合物或安慰劑。11名成人接種者中有一人報(bào)告在接種后2和3天間嘔吐一次和腹瀉大便三次，4和5天之間發(fā)生咽炎和鼻溢。這名志愿者沒有輪狀病毒感染的證據(jù)，通過培養(yǎng)物和電子顯微鏡檢查，他的大便是輪狀病毒陰性，并且沒有檢查到對(duì)輪狀病毒的血清學(xué)反應(yīng)。腹瀉大便的細(xì)菌培養(yǎng)物也是陰性。另外10名接種者和6名安慰劑受試者在接種后無癥狀。疫苗或安慰劑受試者中沒有一人在接種后ALT升高，在他們的大便中也沒有檢查到輪狀病毒。對(duì)11名接種者(5名通過ELISA IgA測定，4名通過ELISA IgG測定)中的6名(55％)的血清檢測了輪狀病毒抗體反應(yīng)。因此，四價(jià)疫苗表現(xiàn)出是安全的并且免疫原性的，使得可以在6-60月齡的兒童中進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。
在下面的研究中，對(duì)20名6-60月齡的嬰兒和兒童喂給緩沖制劑后，在接受個(gè)體年齡適宜的常規(guī)兒童期免疫之前或之后至少2星期，施用單一劑量的未稀釋四價(jià)人VP7血清型1×UK，人VP7血清型2×UK，人VP7血清型3×UK和人VP7血清型4×UK輪狀病毒重排列疫苗(12名兒童)或安慰劑(8名兒童)。對(duì)一名接種者(在接受病毒之后頭24小時(shí)期間發(fā)燒并且在第4天嘔吐一次)和對(duì)一名安慰劑受試者(在第2天發(fā)燒并且在第2-7天和鼻溢咳嗽)觀察到“輪狀病毒樣病”。另一名接種者在第7天鼻溢。有病的孩子沒有一人證明有輪狀病毒感染證據(jù)。只在一天從兩名無癥狀接種者收集的兩個(gè)大便標(biāo)本中檢查到輪狀病毒。通過其他接種者和安慰劑受試者的電子顯微鏡或通過大便培養(yǎng)沒有檢測到輪狀病毒，包括是疫苗受試者同胞的4名兒童。沒有一名接種者或安慰劑受試者在施用四價(jià)輪狀病毒制劑之后ALT升高。對(duì)12名接種者(4名通過ELISA IgA測定，6名通過ELISA IgG測定)中的6名檢測到了輪狀病毒抗體反應(yīng)。12名接種者中一共有7名有輪狀病毒感染的證據(jù)。因此，該候選疫苗表現(xiàn)出是安全的并且使免疫原性，使得可以靶向接受三劑量疫苗的小于6月齡的嬰兒人群。
下面對(duì)在大約2,4和6月齡時(shí)接受他們的常規(guī)的兒科免疫的30名嬰兒評(píng)價(jià)三劑量的未稀釋的四價(jià)人×牛輪狀病毒重排列疫苗或安慰劑的安全性和免疫原性。20名嬰兒隨機(jī)接受候選輪狀病毒疫苗，10名嬰兒接受安慰劑。因?yàn)獒t(yī)學(xué)原因在第二次接種之前從研究中排除了一名接種者和一名安慰劑受試者。第一劑量后施用第二或第三劑量疫苗或安慰劑，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)的兒童期免疫(包括全細(xì)胞百日咳接種)，20名接種者中有一名，19名接種者中有6名和19名接種者中有6名，和10名安慰劑受試者中有2名，9名安慰劑受試者中有0名，和9名安慰劑受試者中有3名分別報(bào)道有發(fā)燒。在口服施用四價(jià)輪狀病毒疫苗之后頭48小時(shí)內(nèi)發(fā)生的所有的發(fā)燒案例，這和多次常規(guī)兒科免疫相符，除了三例發(fā)熱案例，其中兩名接種者伴隨呼吸疾病，而第三件案例發(fā)生在安慰劑受試者中。一名安慰劑受試者報(bào)告有腹瀉，但是在所有的接種者中則沒有腹瀉。第二劑量后第7天，一名接種者嘔吐了兩次，并且有呼吸疾病和結(jié)膜炎。另一名孩子在接種后頭24小時(shí)內(nèi)由于咳嗽嘔吐了一次。只在一名輕度發(fā)燒(38.2℃)的接種者的大便樣品中檢測到了輪狀病毒，提示發(fā)燒與輪狀病毒感染有關(guān)。第二劑量后和第三劑量后19名接種者中有4名，第一劑量后10名安慰劑受試者中有1名，第二劑量和第三劑量后9名安慰劑受試者中有1名，有呼吸病癥或疹。所有報(bào)告的疾病都是輕度的。20名接種者中有5名和20名接種者中有2名，10名安慰劑受試者中有1名和10名安慰劑受試者中有2名在第一次接種之前和之后ALT稍有提高。第一劑量后20名接種者中有2名，第二劑量后19名接種者中有0名，以及第三劑量后19名接種者中有2名的細(xì)胞培養(yǎng)物中測定檢測到大便中有輪狀病毒。
以輪狀病毒排出和/或病毒特異性血清抗體反應(yīng)證據(jù)為基礎(chǔ)，19名接種者中有12名(63％)在接受第一劑量后，19名接種者中有19名(100％)在接受第三劑量后感染了輪狀病毒。(第二次接種后沒有收集血清)。在第一劑量后第3,5和7天和第二劑量和第三劑量后第4天只對(duì)幾名嬰兒在對(duì)他們收集的大便中檢測到了輪狀病毒。具體地說，20名中有3名(15％)在接受第一劑量疫苗后，19名中有1名(11％)在接受第三劑量后排泄出了輪狀病毒。由于在第一劑量之前和之后ALT水平升高而從研究中排除的兩名嬰兒(一名接種者和一名安慰劑受試者)中沒有一人有任何輪狀病毒感染證據(jù)。在接受了三劑量疫苗的19名接種者中，在第一和/或第三劑量疫苗之后通過下面測試檢測到抗體反應(yīng)ELISA IgA(50％)，ELISA IgG(63％)，抗UK牛株的噬斑減少中和測定(100％)或人輪狀病毒1型(Wa,32％),2型(DS-1,32％),3型(P,32％)，或4型(VA70,32％)(表4)。
表4在大約2,4和6月齡接種的嬰兒中接受三劑量大約4×105PFU四價(jià)牛(UK)輪狀病毒為基礎(chǔ)的疫苗或安慰劑的個(gè)體的血清學(xué)反應(yīng)
a第一和/或第三劑量疫苗之后*輪狀病毒群特異性反應(yīng)**VP7血清型在研究最后，對(duì)8.25-9.25月齡的7名安慰劑受試者給與單一劑量的四價(jià)輪狀病毒疫苗。該疫苗表現(xiàn)出好的耐受性。只有一名嬰兒觀察到輪狀病毒樣病，他在第3,4和7天發(fā)燒，在第3至7天腹瀉。對(duì)其它5名接種者觀察到呼吸疾病(沒有發(fā)燒或胃腸炎)。在該較大年齡組對(duì)于牛UK輪狀病毒為基礎(chǔ)的疫苗沒有產(chǎn)生明顯的發(fā)燒現(xiàn)象是相當(dāng)重要的，因?yàn)橐粌r(jià)獼猴輪狀病毒疫苗已表現(xiàn)出明顯地更傾向于對(duì)6-8月齡的嬰兒誘導(dǎo)發(fā)燒反應(yīng)，該月齡的嬰兒如果不是全部情況下，則大多數(shù)情況下，已失去了被動(dòng)獲得的對(duì)輪狀病毒的母體抗體。
當(dāng)將對(duì)牛UK為基礎(chǔ)的四價(jià)組合物的血清學(xué)反應(yīng)與在2,4和6月齡接種的以105.0pfu各成分施與獼猴輪狀病毒為基礎(chǔ)的四價(jià)疫苗的嬰兒誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)相比較時(shí)(Rennels等，兒科學(xué)(Pediatrics)97:7-13(1996))，注意到幾個(gè)重要的特征。在90％的接種嬰兒中，獼猴輪狀病毒為基礎(chǔ)的疫苗誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)包括對(duì)獼猴輪狀病毒的反應(yīng)，所述獼猴輪狀病毒是重排列的親代株之一。同時(shí)，對(duì)14％的孩子誘導(dǎo)了對(duì)人輪狀病毒血清型1的中和抗體反應(yīng)，對(duì)31％的誘導(dǎo)了對(duì)人血清型2的中和抗體反應(yīng)，對(duì)29％的誘導(dǎo)了對(duì)人血清型3的中和抗體反應(yīng)，對(duì)14％的誘導(dǎo)了對(duì)人血清型4的中和抗體反應(yīng)。因此，與獼猴輪狀病毒四價(jià)組合物相比，牛UK輪狀病毒為基礎(chǔ)的人重排列免疫原性組合物誘導(dǎo)了大得多的對(duì)血清型1的中和抗體反應(yīng)頻率(P小于0.005 Fisher exact檢驗(yàn))和對(duì)血清型4的中和抗體反應(yīng)頻率(P小于0.05 Fisher exact檢驗(yàn))。對(duì)人輪狀病毒血清型2和3病毒株和對(duì)同型動(dòng)物輪狀病毒母株的反應(yīng)沒有顯著差異。
從獼猴輪狀病毒為基礎(chǔ)的疫苗給出的高水平保護(hù)效力的因素來看，當(dāng)與人×獼猴輪狀病毒重排列疫苗相比時(shí)，認(rèn)為四價(jià)人×牛UK輪狀病毒重排列疫苗給出相同的和可能更好的免疫原性是顯著性的。
在美國進(jìn)行的多中心效價(jià)試驗(yàn)中，證明獼猴輪狀病毒疫苗具有抗非常嚴(yán)重輪狀病毒腹瀉的80％的保護(hù)效力和抗輪狀病毒引起的脫水的100％的效力(Rennel等，兒科學(xué)(Pediatrics)97:7-13(1996))。在1997年12月FDA顧問委員會(huì)同意其臨床特性，1998年8月該疫苗被食品和藥品管理局批準(zhǔn)。1997年6月美國免疫實(shí)施顧問委員會(huì)建議該疫苗用于2,4和6月齡嬰兒的常規(guī)免疫，等待批準(zhǔn)。在1999年5月，在歐洲共同體的15個(gè)國家得到批準(zhǔn)。
牛UK輪狀病毒為基礎(chǔ)的多價(jià)免疫原性組合物對(duì)人不表現(xiàn)出誘導(dǎo)暫時(shí)的低水平的發(fā)燒。在一些臨床情況下，牛UK輪狀病毒為基礎(chǔ)的組合物可能是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的牛UK輪狀病毒為基礎(chǔ)的多價(jià)免疫原性組合物提供了獨(dú)特的性質(zhì)，包括(1)類似于批準(zhǔn)的四價(jià)獼猴輪狀病毒疫苗的感染性和免疫原性；(2)減小的誘導(dǎo)暫時(shí)的低水平的發(fā)燒的能力；(3)類似于先前描述的牛輪狀病毒為基礎(chǔ)的疫苗組合物的減毒作用，但是根據(jù)要求的較低劑量判斷具有明顯更大的感染性和免疫原性；和(4)抗原覆蓋了嚴(yán)重輪狀病毒疾病中主要臨床上重要的所有人輪狀病毒血清型。
實(shí)施例Ⅲ該實(shí)施例提供了來自正在進(jìn)行的將本發(fā)明的優(yōu)選的四價(jià)人-牛重排列輪狀病毒組合物與批準(zhǔn)的四價(jià)獼猴-人輪狀病毒重排列疫苗ROTASHIELD相比較的臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)的初步的階段分析的總結(jié)。該分析檢測了兩種組合物的低水平發(fā)燒反應(yīng)的比例和抗輪狀病毒腹瀉的保護(hù)效力。
最近正在進(jìn)行階段性兩年臨床研究來比較本發(fā)明的四價(jià)人-牛重排列輪狀病毒組合物與四價(jià)獼猴-人輪狀病毒重排列疫苗(最近批準(zhǔn)在美國和歐洲共同體的15個(gè)國家使用的ROTASHIELD)的安全性和抗輪狀病毒腹瀉的效力。在Finland進(jìn)行該研究并且包括172名四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列受試者，86名相應(yīng)的安慰劑對(duì)照，161名ROTASHIELD接種者和79名相應(yīng)的安慰劑受試者。由于計(jì)算原因，在兩個(gè)鄰近的小的Finnish城市，Tampere和Lahti進(jìn)行該研究，因此需要使用兩組安慰劑組。當(dāng)兩個(gè)研究組中的個(gè)體位于相同城市時(shí)，也需要兩個(gè)安慰劑組，因?yàn)槭⒔M合物的容器外觀不同。
為了對(duì)每一個(gè)組合物招收足夠的受試者，可以以80％效率檢查到對(duì)一種組合物的發(fā)熱反應(yīng)的降低的發(fā)生率(30％-15％)，在兩個(gè)城市同時(shí)進(jìn)行該研究(假設(shè)安慰劑組之間沒有顯著的不同，以0.05顯著水平和10％信息丟失率進(jìn)行雙尾試驗(yàn)(two-tailed test))。只是在Tampere隨機(jī)進(jìn)行四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物及其相應(yīng)的安慰劑試驗(yàn)，而在Lahti和Tampere兩處隨機(jī)進(jìn)行ROTASHIELD疫苗及其相應(yīng)的安慰劑試驗(yàn)。
對(duì)于每一組合物劑量，在接種后7天對(duì)研究受試者監(jiān)測發(fā)燒，發(fā)燒定義為直腸溫度等于或大于38℃。在接種后7天內(nèi)還監(jiān)測嘔吐，疏松大便，過敏和其它全身癥狀。整個(gè)兩年研究期保持監(jiān)測胃腸炎，嚴(yán)重的副作用或住院情況。計(jì)劃該研究包括兩季節(jié)(season)的胃腸炎。
沒有非盲的研究組成員的情況下，在接受第一劑量的各四價(jià)重排列組合物或安慰劑之后以發(fā)熱反應(yīng)率為基礎(chǔ)獲得了初步數(shù)據(jù)。此外，只對(duì)各組數(shù)據(jù)作為整體分析比較了兩種組合物，即四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物和ROTASHIELD，的發(fā)燒發(fā)生率和保護(hù)效力。通過將兩種組合物配制成包含在鑒定的二倍體猴胎獼猴肺(FRhL)細(xì)胞中生長的輪狀病毒保持研究組之間的細(xì)胞培養(yǎng)底物可比性。
隨機(jī)化分布后，對(duì)健康的2月齡嬰兒口服施與四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物(每個(gè)成分105.3至105.8pfu),ROTASHIELD(每個(gè)成分105pfu)，或者安慰劑，并且兩個(gè)月之后重復(fù)一次。嬰兒的父母每天記錄一次或兩次直腸溫度，并且每天記錄癥狀。收集大便樣品并且保持記錄排泄出的大便的次數(shù)和稠度。表5和表6給出了總結(jié)第一劑量的輪狀病毒重排列組合物之后7天內(nèi)發(fā)生的發(fā)燒的累計(jì)比例的可獲得的數(shù)據(jù)和總結(jié)輪狀病毒胃腸炎的第一季期間保護(hù)效力的初步數(shù)據(jù)并且下面進(jìn)行了總結(jié)。
在ROTASHIELD受試者中，在施與第一劑量的重排列組合物之后的那個(gè)星期里46.2％發(fā)生了低水平暫時(shí)發(fā)熱反應(yīng)(大于等于38℃(100.4°F))(表5)。該頻率明顯大于其安慰劑組，安慰劑組該比例是11.4％(p小于0.0001)。相反，對(duì)于四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物受試者觀察到的發(fā)燒(大于等于38℃)的比例(15.2％)與其安慰劑組(11.0％)沒有明顯不同。ROTASHIELD接種者發(fā)燒高于38.4℃(101.1°F)的頻率仍然是相當(dāng)大的(20.3％)并且明顯大于其安慰劑組(1.3％)(p小于0.0001)。相反，四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物受試者發(fā)燒高于38.4℃的頻率是1.8％，這與其安慰劑組(0％)沒有明顯不同。因此，在這兩個(gè)比較中，ROTASHIELD以明顯高于其安慰劑組的明顯的概率誘導(dǎo)發(fā)燒，而對(duì)四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物發(fā)熱反應(yīng)與其安慰劑組沒有不同并且明顯小于對(duì)ROTASHIELD所觀察到的?？傊还馨l(fā)燒定義為大于等于38℃或者大于38.4℃，在接種后7天內(nèi)，與四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物相比，ROTASHIELD與明顯更多的發(fā)燒相關(guān)(p小于0.0001)。在Finnish試驗(yàn)中基本上都沒有對(duì)人×牛重排列組合物的發(fā)熱反應(yīng)是研究組中不存在背景疾病的反映。這與背景疾病非常頻繁的實(shí)施例Ⅰ和Ⅱ完全相反。在Finnish研究中，相對(duì)不存在背景疾病使得比在較早臨床試驗(yàn)中可能的情況更精確地評(píng)價(jià)發(fā)燒的出現(xiàn)或發(fā)熱反應(yīng)。
也獲得了有關(guān)抗四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物和ROTASHIELD的輪狀病毒腹瀉的比較保護(hù)效力的初步數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)特別重要，因?yàn)閷?duì)于前者組合物沒有觀察到發(fā)熱反應(yīng)，并且使用比先前使用的牛輪狀病毒和人-牛重排列組合物低10-100倍的病毒劑量，可以想到本發(fā)明組合物太減毒而不能誘導(dǎo)抗天然存在的輪狀病毒疾病的保護(hù)作用。另一方面，已特征性地發(fā)現(xiàn)人-獼猴輪狀病毒重排列疫苗，ROTASHIELD，具有抗嚴(yán)重輪狀病毒疾病的80％-100％的保護(hù)效力。
通過分析監(jiān)督的第一個(gè)季節(jié)研究受試者中記錄的任何嚴(yán)重程度的輪狀病毒胃腸炎總共48例的分布從本發(fā)明研究獲得對(duì)保護(hù)效力的估計(jì)。通過鑒定胃腸炎研究受試者的糞便中的輪狀病毒確定輪狀病毒胃腸炎的診斷。鑒定通過下面的方法進(jìn)行(1)標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法，ELISA技術(shù)，使用輪狀病毒群特異性和血清型特異性抗血清(Joensuu等，Lancet 350:1205-1209(1997)；和Hoshino等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)21:425-430(1985))，和(2)使用識(shí)別輪狀病毒群特異性保守序列或輪狀病毒血清型特異性保守序列的引物的PCR(Gouvea等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)28:276-282(1990))。
以一種方法在第一季節(jié)進(jìn)行保護(hù)效力的分析，使得定點(diǎn)研究小組以及臨床和研究監(jiān)視人員對(duì)研究組(即四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物，ROTASHIELD，或相應(yīng)的安慰劑組)的各受試者的安排始終未知，并且他們對(duì)研究的其它項(xiàng)目始終未知。該限制應(yīng)用于該初步分析以允許連續(xù)監(jiān)督和收集數(shù)據(jù)直到完成第二胃腸炎季節(jié)時(shí)研究結(jié)束。作為結(jié)果，通過兩年監(jiān)視完結(jié)后繼續(xù)保持通過疾病的嚴(yán)重程度對(duì)疫苗效價(jià)的分析。不管怎樣，應(yīng)該測定第一季節(jié)期間每一個(gè)研究組所有嚴(yán)重程度的輪狀病毒胃腸炎的比例并且與無非盲的試驗(yàn)的其他組相比較。
第一季節(jié)期間兩組安慰劑的所有嚴(yán)重程度的輪狀病毒胃腸炎病例的比例明顯相近，17.7％和17.4％，表明兩個(gè)研究地點(diǎn)的可比較性和這些地點(diǎn)輪狀病毒感染的流行病學(xué)的可比較性。當(dāng)與其安慰劑組比較時(shí)，ROTASHIELD對(duì)于所有嚴(yán)重程度的輪狀病毒胃腸炎表現(xiàn)出65％的保護(hù)效力。對(duì)于四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物可比較的估計(jì)是70％，保護(hù)效力與批準(zhǔn)的疫苗接近?？紤]到根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度不能分析效力的事實(shí)，該保護(hù)效力水平比令人滿意的水平更高。非?？赡艿氖侨?牛輪狀病毒重排列組合物抗嚴(yán)重疾病的保護(hù)效力明顯大于70％，這是以其中輪狀病毒疫苗效力隨著疾病的嚴(yán)重程度而增加的先前ROTASHIELD臨床試驗(yàn)獲得的經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)的。對(duì)于大多數(shù)嚴(yán)重疾病，使用ROTASHIELD特征性地觀察到80％-100％的保護(hù)效力，而對(duì)于所有嚴(yán)重程度的輪狀病毒疾病計(jì)算出的保護(hù)效力只達(dá)到48-68％。
表5第一劑量的ROTASHIELD或四價(jià)人-牛重排列組合物(TBRC)之后7天期間內(nèi)發(fā)生的發(fā)燒(直腸)的累計(jì)比例(平均和95％置信區(qū)間)(CI) 1105pfu的每一種成分的四價(jià)疫苗2105.3-105.8pfu的每一種成分的四價(jià)組合物NS=不明顯aROTASHIELD對(duì)TBRC組發(fā)燒發(fā)生率的比較表6初步報(bào)告四價(jià)人-牛輪狀病毒重排列組合物和四價(jià)獼猴輪狀病毒疫苗(ROTASHIELD)的安全性和免疫原性的Ⅱ期雙盲試驗(yàn)。研究組所有嚴(yán)重程度的第一季節(jié)輪狀病毒胃腸炎疾病的分布
就免疫原性和保護(hù)效力來說，本發(fā)明的疫苗表現(xiàn)出四價(jià)獼猴輪狀病毒制劑的所有的有利性質(zhì)。類似地，本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物共享先前描述的牛輪狀病毒制劑表現(xiàn)出的沒有明顯發(fā)熱反應(yīng)的有利性質(zhì)。但是，其不表現(xiàn)出四價(jià)獼猴輪狀病毒疫苗有關(guān)的暫時(shí)低水平發(fā)熱反應(yīng)的不利性質(zhì)或者先前描述的牛輪狀病毒制劑的有關(guān)的他們的低感染性的不利性質(zhì)。
微生物保藏信息根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在1998年6月4日，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209保藏了人輪狀病毒株，且保藏號(hào)如下重排列名稱 ATCC登記號(hào)HD×BRV，克隆47-1-1(VP7:1[D]) ATCC VR-2617HDS1×BRV-1，克隆66-1-1(VP7:2[DS-1]ATCC VR-2616HP×BRV，克隆22-1-1(VP7:3[P]) ATCC VR-2611HST3×BRV-2，克隆52-1-1(VP7:4[ST3])ATCC VR-2612IAL28×UK，克隆33-1-1(VP7:5[IAL28])ATCC VR-2613AU32×UK，克隆27-1-1(VP7:9[AU32])　TCC VR-2614KC-1×UK，克隆32-1-1(VP7:10[KC-1]) TCC VR-2615盡管為了清楚理解的目的通過詳細(xì)描述和實(shí)施例更詳細(xì)地描述了上述的本發(fā)明，但是很明顯的是在后面的權(quán)利要求書范圍內(nèi)可以進(jìn)行一些改變和修飾。因此本發(fā)明的范圍不應(yīng)該參照上面的描述確定，而應(yīng)該參照后面的權(quán)利要求書及其全部范圍的等價(jià)物來確定。
本申請(qǐng)中引用的所有公開物和專利文獻(xiàn)為了所有的目的全文引作參考，其程度就和各公開物或?qū)＠墨I(xiàn)各自被指出的一樣。
權(quán)利要求
1．一種包括至少四種人×牛株重排列輪狀病毒和生理可接受載體的多價(jià)免疫原性組合物，其中各人×牛重排列輪狀病毒包括抗原性不同的人VP7血清型，并且當(dāng)以小于106.0噬斑形成單位的劑量施用各輪狀病毒重排列成分時(shí)，其中所述組合物誘導(dǎo)對(duì)各抗原性不同的人輪狀病毒VP7血清型的免疫原性反應(yīng)而不引起暫時(shí)低水平發(fā)熱。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中由親本人輪狀病毒提供人×牛輪狀病毒的VP7血清型抗原。
3．權(quán)利要求2的組合物，其中親本人輪狀病毒選自人輪狀病毒VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,VP7血清型5和VP7血清型9。
4．權(quán)利要求2的組合物，進(jìn)一步包括VP7血清型10的牛輪狀病毒×牛輪狀病毒重排列。
5．權(quán)利要求1的組合物，其中?！僚Ｖ嘏帕休啝畈《景▉碜耘］啝畈《局闗C-1的VP7血清型10抗原。
6．權(quán)利要求1的組合物，其中除了VP7外的所有輪狀病毒蛋白質(zhì)由其中牛輪狀病毒是UK株的親本牛輪狀病毒提供。
7．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3和VP7血清型4的人×牛重排列輪狀病毒的四價(jià)免疫原性組合物。
8．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4和VP7血清型5的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
9．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,和VP7血清型9的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
10．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,VP7血清型5,和VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
11．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,VP7血清型9，和VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
12．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,VP7血清型5，和VP7血清型9的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
13．權(quán)利要求1的組合物，其是包括VP7血清型1,VP7血清型2,VP7血清型3,VP7血清型4,VP7血清型5,VP7血清型9，和VP4血清型1A的人×牛重排列輪狀病毒的多價(jià)組合物。
14．權(quán)利要求7的組合物，進(jìn)一步包括VP7血清型10的?！僚Ｖ嘏帕休啝畈《尽?br> 15．權(quán)利要求14的組合物，其中牛×牛重排列輪狀病毒包括來自牛輪狀病毒株KC-1的VP7血清型10抗原。
16．權(quán)利要求7的組合物，其中親本人輪狀病毒是D株(血清型1),DS-1株(血清型2),P株(血清型3)和ST3株(血清型4)。
17．權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理可接受載體是檸檬酸鹽緩沖液。
18．權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包括增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。
19．權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是凍干形式。
20．權(quán)利要求7的組合物，其中將各人×牛重排列配制成提供103-105噬斑形成單位的劑量。
21．權(quán)利要求7的組合物，其中將各人×牛重排列配制成提供105-106噬斑形成單位的劑量。
22．刺激免疫系統(tǒng)對(duì)人輪狀病毒VP7血清型抗原產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答而沒有明顯的暫時(shí)低水平發(fā)熱的方法，包括給藥含有各以小于106.0噬斑形成單位的劑量施用的至少四種VP7血清型人輪狀病毒和生理可接受載體的多價(jià)免疫原性組合物。
23．權(quán)利要求22的方法，其中所述組合物包括四種人×牛重排列輪狀病毒。
24．權(quán)利要求22的方法，其中所述人×牛重排列輪狀病毒包括人輪狀病毒VP7血清型1×牛輪狀病毒株UK，人輪狀病毒VP7血清型2×牛輪狀病毒株UK，人輪狀病毒VP7血清型3×牛輪狀病毒株UK和人輪狀病毒VP7血清型4×牛輪狀病毒株UK。
25．權(quán)利要求22的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。
26．權(quán)利要求22的方法，其中以103-105噬斑形成單位的劑量給藥所述組合物。
27．權(quán)利要求22的方法，其中以105-106噬斑形成單位的劑量給藥所述組合物。
28．權(quán)利要求22的方法，其中對(duì)個(gè)體順序給藥各人×牛重排列輪狀病毒。
29．權(quán)利要求22的方法，其中以聯(lián)合的混合物給藥人×牛重排列輪狀病毒。
30．權(quán)利要求22的方法，其中對(duì)個(gè)體的消化道給藥所述組合物。
31．權(quán)利要求30的方法，其中以液體懸浮劑給藥所述組合物。
32．權(quán)利要求22的方法，其中所述方法包括多次給藥所述組合物。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述方法包括給藥三次劑量。
全文摘要
本發(fā)明提供用于防止人輪狀病毒疾病而且沒有明顯的反應(yīng)原性的疫苗組合物。在多價(jià)制劑中聯(lián)合包括四種臨床上最重要的VP7血清型的人輪狀病毒的每一種的人x牛重排列輪狀病毒,該制劑提供高度感染性和免疫原性而不產(chǎn)生暫時(shí)發(fā)熱癥狀。還提供了產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答而不產(chǎn)生暫時(shí)發(fā)熱癥狀的方法。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1315872SQ9981031
公開日2001年10月3日 申請(qǐng)日期1999年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月28日
發(fā)明者A·H·卡比奇安, R·M·查諾克, 星野安孝 申請(qǐng)人:由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國