專利名稱：提高動物肉產量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及提高雄性動物肉產量的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及的方法是初次接種GnRH免疫原來免疫動物，從而降低循環(huán)中性類固醇水平，在屠宰動物前不久再次接種GnRH免疫原以顯著降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇水平。
在雄性動物中，雄性類固醇一睪酮和雄甾烯酮參與調節(jié)兩種不同的生物過程。一個作用是生理性的，增加肌肉沉積，減少脂肪合成，并且提高飼料利用效率。睪酮對性腺如精囊、前列腺和睪丸的發(fā)育具有類似的直接效應。這些作用包括該雄激素與靶組織上的受體直接相互作用。雄性激素的第二個通常作用是引起雄性的性和其它行為特點變化。這些作用是通過中樞神經系統(tǒng)來介導的。由于這些不同的作用發(fā)生在不同的組織，分子機制不同，因此，其中一些作用在低血漿濃度的雄性激素時得以保持，而其它作用則需要更高水平的雄性激素，這是可能的。
盡管通常假定在生命早期需要雄性激素來維持最適生長、肌肉沉積和飼料利用效率，但是此假定也許并非是事實，即使存在可測得的雄性激素。或者，雄激素-敏感組織如肌肉在生命早期較在青春期或青春期后對低水平的雄性激素更為敏感。Allrich等，動物科學雜志(J.Animal Sci.)(1982)55:1139-1146，豬體重增加和睪酮-敏感組織重量增加的相對速度是年齡和睪酮濃度的函數。
尤其是，不同年齡的不同組織生長相對速度顯示出對睪酮的組織敏感性，以及睪酮濃度隨著年齡而變化。舉例來說，作者證實從40天到100天，血清睪酮濃度增加3.1倍，體重增加3.2倍，睪丸重量增加3.6倍，而精囊增加4.0倍。這些數據也表明青春期前的睪酮水平是低的，但是已經能夠檢測得到，而且體重以大約與其它組織在低水平睪酮時的相同速度增加。豬大約在130到150日齡(體重65-85kg)時開始達到性成熟，同一時間血清睪酮濃度顯著增加。從100天到190天，血清濃度增加4.0倍，而體重、睪丸重量和精囊重量則分別增加2.6倍、13.5倍和9.2倍。
另外，Knudson等在動物科學雜志(J.Animal Sci.)(1985)61:789-796中指出直到90天日齡時去勢雄性豬與未去勢雄性豬的體重增加速度相同，但是，90天之后未去勢雄性豬增長快于去勢豬。該特性對于免疫絕育的群養(yǎng)動物來說特別重要，尤其是當需要免疫去勢雄性豬仔以預防“公豬異味(boar taint)”時，所述公豬異味”是由于功能正常的雄性豬睪丸中性激素的合成而產生的。參見例如Meloen等人，疫苗(Vaccine)(1994)12(8):741-746。
利用豬和牛已經進行了大量研究，來探討GnRH免疫作為改善動物生長速度和飼料利用效率的方法的用途。參見例如，Adams和Adams，動物科學雜志(J.Animal Sci.)(1992)70:1691-1698；Caraty和Bonneau，C.R.Acad.Sc.Paris(1986)303:673-676；Chaffaux等，Recueil de MedicineVeterinaire(1985)161:133-145；Finnerty等，生殖生育雜志(J.Repro.Fertil.)(1994)101:333-343。這些研究中，多數的目的是使動物象未去勢雄性動物那樣生長至肥育期末，然后將動物進行免疫去勢。為了達到在肥育期末以及恰好在屠宰前免疫去勢動物的目的，就得在生命早期對動物進行一次或多次接種來致敏免疫系統(tǒng)以便使動物對肥育期末的再次接種反應強烈。初次接種時，使用GnRH抗原來致敏免疫系統(tǒng)，但是要避免引發(fā)高的抗-GnRH抗體滴度，因為高的抗-GnRH抗體滴度將降低血清睪酮水平或者阻止睪酮水平隨著動物青春期的來臨而增加。這是因為，據信降低血清睪酮水平也將會降低年輕動物的生長速度或者飼料利用效率。
例如，Meloen等在疫苗(Vaccine)(1994)12:741-746中描述了GnRH串聯(lián)(tandem)疫苗的應用，以兩種劑量施用，來減少豬的公豬異味。并未出現睪丸減小，直至第二次免疫之后。也參見1990年10月4日公告的WO90/11298。Falvo等在動物科學雜志(J.Anim.Sci.)(1986)63:986-994中報道了使用GnRH疫苗研究豬的各種反應，包括公豬異味的出現和尸體特性。作者報道稱，首次加強注射后2周血漿睪酮水平顯著下降。類似地，5573767號美國專利涉及使用GnRH免疫改善肉的感官質量的方法。該方法限定兩次免疫，一次免疫對生殖腺類固醇分泌無影響，在屠宰前進行第二次免疫以便消除雄性和非雄性類固醇的作用。
此外，前述在免疫去勢方面的各種努力沒有產生一致的結果，這是由于GnRH肽和/或相關載體系統(tǒng)沒有足夠的免疫原性，和現有各種基于GnGH的疫苗產物不能引發(fā)足夠的針對內源性GnRH的免疫反應。參見例如，Robertson,Vet.Record(1981)108:381-382。因此，需要可靠的用于免疫去勢產肉動物的方法。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及提高肉產量的方法，包括在動物肥育期前或肥育期間用含有GnRH免疫原的第一疫苗組合物接種動物來降低循環(huán)中的睪酮水平，屠宰動物前約2～8周用含有GnRH免疫原的第二疫苗組合物接種動物來明顯降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇水平。在一特別優(yōu)選的實施方案中，第一和/或第二疫苗組合物含有免疫佐劑如含有油和二甲基二-十八烷基溴化銨的佐劑。另外，第一和第二疫苗組合物中的GnRH免疫原可以是含有通式為(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多體(multimer)，其中GnRH是GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔基團、載體分子和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數。
在一些實施方案中，施用第一疫苗組合物產生與動物內源性GnRH相互作用的抗體，在抗體水平已經降低后再施用第二疫苗組合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及提高未去勢雄性牛、羊或豬的肉產量的方法，包括在動物肥育期前或肥育期間用含有GnRH免疫原的第一疫苗組合物接種動物來降低循環(huán)中的睪酮水平，屠宰動物前約2～8周用含有GnRH免疫原的第二疫苗組合物接種動物來明顯降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇水平。第一和/或第二疫苗組合物可以進一步含有免疫佐劑。
還有一實施方案，本發(fā)明涉及提高未去勢雄性牛、羊或者豬的肉產量的方法，包括(a)用包括免疫佐劑和含有通式為(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多體的第一疫苗組合物接種動物，通式中GnRH為GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔基團、白細胞毒素多肽和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數，其中所述第一疫苗組合物在動物肥育期前或肥育期施用以降低循環(huán)中的睪酮水平；和(b)用包括免疫佐劑和含有通式為(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多體的第二疫苗組合物接種動物，通式中GnRH是GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔團、白細胞毒素多肽和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數，其中所述第二疫苗組合物在屠宰動物前約2～8周施用以明顯降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇水平。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及提高未去勢雄性牛、羊或者豬的肉產量的方法，包括(a)用包括免疫佐劑和GnRH多體的第一疫苗組合物給動物接種，所述GnRH多體含有圖3A-3F(SEQ ID號12和13)描述的氨基酸序列或者具有與其至少約75％序列同源性的氨基酸序列，其中第一疫苗組合物在動物肥育期前或肥育期施用以降低循環(huán)中的睪酮水平；和(b)用包括免疫佐劑和GnRH多體的第二疫苗組合物給動物接種，所述GnRH多體含有圖3A-3F(SEQ ID號12和13)描述的氨基酸序列或者具有與其至少約75％序列同源性的氨基酸序列，其中第二疫苗組合物在屠宰動物前約2～8周施用以明顯降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇水平。第一和/或第二疫苗組合物的佐劑可以包括輕礦物油和二甲基二-十八烷基溴化銨。
根據本文的公開，本領域技術人員將很容易地重現本發(fā)明的這些和其它實施方案。
圖2A(SEQ ID號8和9)和2B(SEQ ID號10和11)顯示本文嵌合的白細胞毒素-GnRH多肽基因融合中使用的GnRH構建體的核苷酸序列和氨基酸序列。圖2A(SEQID號8和9)描述單拷貝GnRH十肽。圖2B(SEQID號10和11)描述當n=1時的四拷貝GnRH十肽和n=2時八拷貝GnRH十肽分子等。
圖3A-3F(SEQ ID號12和13)顯示來自質粒pCB122和pCB130的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和預計的氨基酸序列。
圖4顯示與去勢雄性豬(barrows)和未去勢雄性豬(boars)相比，接受本發(fā)明GnRH疫苗處理(免疫去勢)的豬的體重是其日齡的函數。
發(fā)明詳述如未另外聲明，則本發(fā)明實踐將使用本領域分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術學和免疫學的常規(guī)技術。文獻對這些技術作了充分的解釋，參見例如Sambrook,Fritsch&Maniais，分子克隆實驗室手冊；DNA克隆，第1、Ⅱ卷(D.N.Glover編寫)；寡核苷合成(M.J.Gait編寫)；核苷酸雜交(B.D.Hames&S.J.Higgins編寫)；B.Perbal，分子克隆的實用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)；叢書，酶學方法(Methods Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan編寫，學術出版社有限公司)；及實驗免疫學手冊(Hndbook ofExperimentalImmunology)，第Ⅰ-Ⅳ卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編寫，Blackwell科學出版社)。
在詳細描述本發(fā)明之前，應當認識到本發(fā)明并不局限于特定制劑和方法參數本身，制劑和方法當然可以變化。也應當懂得本文使用的術語僅旨在為描述本發(fā)明特定實施例的目的，而不受其限制。
1．定義在描述本發(fā)明的過程中，將使用到下列術語，這些術語的定義如下術語“促性腺激素釋放激素”或“GnRH”，是指脊椎動物下丘腦分泌的控制促黃體生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)釋放的十肽(Fink,G.，英國醫(yī)學公報(British Medical Bulletin)(1979)35:155-160)。在脊椎動物尤其是哺乳動物中，GnRH的氨基酸序列高度保守。在這方面，得自大多數哺乳動物包括人、牛、豬和羊的GnRH(以前曾稱之為LHRH)的氨基酸序列為焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQID號1)(Murad等人，在第六版(1980)的治療學的藥理學基礎(ThePharmacological Basis of Therapeutics)中激素與激素拮抗劑(Hormones andHormone Antagonists)一章，和Seeburg等人，自然(Nature)(1984)311:666-668)。
這里使用的“GnRH多肽”，包括衍生自天然GnRH序列的分子，也包括重組產生的或化學合成的具有基本與天然GnRH同源的氨基酸序列并且保持如下所述免疫原性的GnRH多肽。因而，術語涵蓋任何在肽內部或者在氨基-末端或羧基-末端發(fā)生單個或多個氨基酸添加、取代和/或缺失的GnRH衍生物和類似物。相應地，本發(fā)明中“GnRH多肽”包括具有GnRH天然序列的分子，也包括GnRH類似物。
代表性的GnRH類似物包括具有N-末端Gln或Glu殘基而不是焦Glu殘基的類似物，Asp在氨基酸2位上取代His的類似物(見圖2A(SEQ ID號8和9)和2B(SEQ ID號10和11))；具有N-末端添加了諸如Cys-Gly-GnRH的GnRH類似物(參見例如，Prendiville等，動物科學雜志(J.Animal Sci.)(1995)73:3030-3037)；羧基末端含有GnRH的類似物(參見例如，Jago等，動物科學雜志(J.Animal Sci.)(1997)75:2609-2619；Brown等，生殖生育雜志(J.Reproduc.Fertil.)(1994)101:15-21)；GnRH類似物(D-Trp6-Pro9-乙基酰胺)GnRH(參見例如，Tilbrook等，激素和行為(Hormonesand Behavior)(1993)27:5-28)或者(D-Trp6)GnRH(參見例如，Chaffaux等，Recueil de Medecine Veterinaire(1985)161:133-145)；第一、第六和/或第十位正常出現的氨基酸被Cys取代和/或其N-末端是乙?；暮?或C-末端是酰胺的GnRH類似物(參見例如，美國專利4608251和4975420)；GnRH類似物焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-Z(SEQ ID號2)，其中X是Gly或D-氨基酸，Y是一個或多個相同或不相同的氨基酸殘基，優(yōu)選1-3個Gly殘基，而Z是Cys或Tyr(參見UK專利公開號GB2196969)；美國專利5688506中描述的GnRH類似物，包括GnRH類似物Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID號3)，焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID號4)，焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID號5)；可由Apeptech(澳大利亞)商購得到的稱作Deslorelin的GnRH類似物，和OvuplantTM；伴有其它氨基酸添加、取代和/或缺失而又保持引發(fā)生成與天然存在的GnRH相互作用的抗體的能力的分子。
因此，術語“GnRH多肽”包括因有一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加而與參照序列不同并且與參照分子具有至少約50％氨基酸同源性的GnRH分子，更優(yōu)選與正被討論的天然多肽序列的相關部分約75-85％同源，最優(yōu)選約90-95％或更多同源。氨基酸序列不超過約1-5個氨基酸取代，或者不超過約1-3個氨基酸取代。特別優(yōu)選的取代通常在本質上是保守的，即，取代發(fā)生在同類(family)氨基酸中。在這方面，氨基酸一般分為四類(1)酸性氨基酸一天門冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性氨基酸一賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(4)不帶電荷的極性氨基酸一甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分為芳香類氨基酸。舉例來說，可以合理預見到下列取代將不會對活性產生大的影響用異亮氨酸或纈氨酸孤立地取代亮氨酸，反之亦然；用谷氨酸取代天門冬氨酸或者相反取代；用絲氨酸取代蘇氨酸或者相反取代；或者用結構相關的氨基酸進行相似的保守取代。因此，具有與參照分子基本上相同氨基酸序列但是有少數氨基酸取代并保持所需活性的蛋白質包括在GnRH多肽的定義之內。
“GnRH多肽”也包括參照GnRH分子的肽片段，只要分子保持所需的活性即可。GnRH的抗原決定基也包括在定義之內。
這里特別考慮的是GnRH多體包括重復序列的GnRH多肽，比如包括2、4、8、16、32拷貝等的一種或多種GnRH多肽，任選地包括間隔序列，諸如在國際申請公開WO98/06848和WO96/24675中描述的以及本文圖2B(SEQ ID號10和11)所示的那些間隔序列。下面將更加詳細地描述這些多體。
為了本發(fā)明的目的，GnRH多肽可以衍生自任何已知的各種GnRH序列，如前面所述的，包括但不限于衍生自人、牛、羊、豬、犬、貓、鹿，嚙齒類如倉鼠、天竺鼠、沙土鼠、ground hogs、衣囊鼠、兔形目動物、兔、白鼬、爬蟲類和鳥類的GnRH多肽。
“GnRH肽”是GnRH多肽，如這里描述的，包括少于正在討論的參照GnRH分子全長和包括至少一種下面定義的抗原決定基。因此，含有GnRH肽的疫苗組合物將包括正在討論的GnRH肽分子全長的一部分而不是整個GnRH分子。這里使用的特定GnRH肽包括例如，具有5、6或7個氨基酸的GnRH肽，尤其是那些包括氨基末端或羧基末端的肽，比如包括天然序列的氨基酸1-5、1-6、1-7、2-8、3-8、3-10、4-10和5-10的GnRH肽(參加例如，國際申請公開WO88/05308)。
“GnRH多體”是指具有多于一個拷貝選定GnRH多肽、GnRH免疫原、GnRH肽或抗原決定基的分子，或者具有多個串聯(lián)重復的選定GnRH多肽、GnRH免疫原、GnRH肽或抗原決定基的分子。GnRH多體可以相當于具有重復單元通式(GnRH-X-GnRH)y的分子，通式中GnRH是GnRH多肽，X是一個或多個選自肽鍵、氨基酸間隔基團、載體分子和[GnRH]n的分子，其中n是大于或等于1的整數，y是大于或等于1的整數，而且其中的“GnRH”可進一步包括任何GnRH多肽。因此，y可以是限定1-40或更多個重復單元，更優(yōu)選1-30個重復單元，最優(yōu)選1-20個重復單元。此外，選定GnRH序列可以均相同，或者相當于GnRH的不同衍生物、類似物、變體或抗原決定基，只要它們仍保持引發(fā)免疫反應的能力即可。另外，如果GnRH單元化學性地或重組性地與載體相連接的話，GnRH分子既可與5’-端、3’-端連接，也可側面與正在討論的載體相接。而且，GnRH多體可以位于載體內部的位點上。下面將更加詳細地討論GnRH多體。
術語“GnRH免疫原”，指GnRH多肽，如前所述，不與免疫性載體、佐劑或免疫刺激劑聯(lián)合時引發(fā)免疫反應的多肽，以及通過與載體分子、佐劑或免疫刺激劑聯(lián)合或者通過天然序列突變和/或通過將含有至少一個GnRH分子抗原決定基的多個重復單元整合入分子中，而能夠產生免疫原性的GnRH多肽。術語可以指單個大分子，或者指衍生自GnRH的抗原大分子的同源或異源群體。
通常，GnRH免疫原釋入脊椎動物后，將引發(fā)生成與脊椎動物天然存在的內源性GnRH相互作用的抗體。術語“GnRH免疫原”也指核酸分子，如編碼GnRH多肽的DNA和RNA分子，使用下面將進一步描述的核苷酸釋放技術而將DNA和RNA分子施用時能夠在體內表達所述GnRH多肽。
“同源”指兩個多核苷酸或兩個多肽組成部分之間相同的百分比。當序列相對于分子的一規(guī)定長度顯示出至少約75-85％，優(yōu)選至少約90％和最優(yōu)選至少約95-98％序列同源時，則兩個DNA或兩個多肽序列彼此“基本同源”。這里使用的基本同源也指與特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
通過下述步驟直接比較兩分子之間的序列信息，可以測定兩個氨基酸或多核苷酸序列之間“相同”的百分比校準序列，計數兩個校準序列之間相匹配的確切數字，除以最短序列長度，和將結果乘以100。可以使用已編好的計算機程序來幫助分析，如ALIGN，Dayhoff,M.O.在蛋白質序列和結構分析(Atlas of Protein Sequence and Structure)，M.O.Dayhoff編著，5 Suppl.3:353-358上發(fā)表的，國家生物醫(yī)學研究基金會，華盛頓DC，它改編了Smith和Wisconsin(1981)在應用數學進展(Advancesin Appl.Math.)2:482-489上發(fā)表的肽分析用的局部同源性算法(localhomology algorithm)。測定核苷酸序列同源性的程序可以使用Wisconsin序列分析軟件包，第8版(可購自基因計算機組，Madison,WI)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也是建立在Smith和Waterman算法的基礎上。這些程序可方便地使用制造商推薦的和上述在Wisconsin序列分析軟件包中描述的缺省參數。舉例來說，特定分子序列相對于參照序列的相同百分比可以使用Smith和Waterman的默認記分表和6個核苷酸位的缺口補償(gap penalty)的同源性算法進行測定。
“抗原決定基”指具有引發(fā)GnRH-特異性抗體生成并且與GnRH-特異性抗體相結合的能力或潛能的分子的任何部分或區(qū)域。為了本發(fā)明的目的，多肽抗原決定基通常包括參照分子的至少約3個氨基酸，優(yōu)選至少約5個氨基酸。對于片段長度而言，沒有嚴格的上限，可以包括近乎蛋白質序列的全長，或者甚至含有正在討論的蛋白質的兩個或多個抗原決定基的融合蛋白。
由于GnRH分子非常小，因此，使用本領域眾所周知的技術可以很方便地完成其能夠引發(fā)抗體反應的抗原決定基的鑒定。例如，使用本領域熟知的許多抗原決定基測繪(map)技術中的任何一種，可以識別多肽分子的抗原決定基。參見例如分子生物學方法中抗原決定基測繪方案(Epitope Mapping Protoclos in Methods in Moleclar Biology)，第66卷(GlennE.Morris編著，1996),Humana Press,Totowa，新澤西。例如，線性抗原決定基可以通過例如如下步驟進行測定在固體載體上并行地合成大量的肽，所述肽對應于蛋白質分子的各個部分，當肽仍然附著在載體上時使肽與抗體發(fā)生反應。該技術為本領域技術人員所公知并且在例如下列文獻中作了描述美國專利4708871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8l:3998-4002；Geysen等(1986)分子免疫學(Molec.Immunol.)23:709-715。類似地，通過測定氨基酸空間構象可以很方便地識別構象抗原決定基，氨基酸空間構象可以通過例如X-線晶體照相術和2-二維核磁共振進行測定。參見例如，抗原決定基測繪方案(Epitope MappingProtocols),supra。
按照例如Kyte等在分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)(1982)157:105-132；和Hopp和Woods在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:3824-3828上所描述的，利用每20個氨基酸的親水和疏水特性而用公式表示蛋白質氨基酸序列的親水性程度的計算機程序也可以用于測定給定分子的抗原部分。例如，Hopp和Woods技術給每個氨基酸賦予親水性數值，然后沿著肽鏈重復平均這些數值。最高局部平均親水性位點表示分子的抗原部分。
“免疫載體”指當與有關GnRH免疫原聯(lián)合時賦予分子免疫性或增加分子免疫性的任何分子。適宜載體的實例包括大的、慢代謝的大分子如蛋白質；多糖，如瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等；聚合的氨基酸如聚谷氨酸、聚賴氨酸等；氨基酸共聚物；滅活病毒顆粒；細菌毒素如由白喉、破傷風、霍亂、白細胞毒素分子等提取的毒素。下面將對載體作更加詳細的描述。
當免疫原與載體化學性偶合或聯(lián)合時，或者當免疫原在編碼免疫原和有關載體的嵌合DNA分子中表達時，GnRH免疫原與特定載體相“連接”。
“免疫聯(lián)合體”是指與上述定義的載體分子相連接的GnRH免疫原如GnRH肽或多體。
術語“白細胞毒素多肽”或“LKT多肽”指衍生自以羧基末端共有氨基酸序列Gly-GIy-X-GIy-X-Asp(SEQ ID號14)為特征的一類蛋白質分子的多肽(Highlander等(1989)DNA 8:15-28)，其中X是Lys、Asp、Val或Asn。這些蛋白質包括，除了別的之外(among others)，衍生自P.Haemolytica和放線桿菌屬胸膜肺炎的白細胞毒素，以及大腸桿菌溶血素(Strathdee等，(1987)感染免疫學(Infect.Immun.)55:3233-3236；Lo(1990)Can.J.Vet.Res.54:S33-S35；Welch(1991)現代微生物學(Mol.Microbiol.)5:521-528)。此類毒素被稱為“RTX”類毒素(Lo(1990)Can.J.Vet.Res.54:S35-S35)。另外，術語“白細胞毒素多肽”指化學合成的、由表達白細胞毒素的生物體中提取的或者重組產生的白細胞多肽。而且，術語指具有與在特定白細胞毒素分子中發(fā)現的鄰接氨基酸序列基本同源的氨基酸序列的免疫原性蛋白質。由此，術語既包括全長序列也包括部分序列，以及類似物。盡管天然全長白細胞毒素顯示細胞毒活性，術語“白細胞毒素”也指保持免疫原性而缺乏天然白細胞毒素的毒性特征的分子。
數種白細胞毒素的核苷酸序列和相應氨基酸序列是已知的。參見例如，美國專利4957739和5055400；Lo等(1985)感染免疫學(Infect.Immun.)50:667-67；Lo等(1987)感染免疫學(Infect.Immun.)55:1987-1996；Strathdee等(1987)感染免疫學(Infect.Immun.)55:3233-3236；Highlander等(1989)DNA 8:15-28；和Welch(1991)現代微生物學(Mol.Microbiol.)5:521-528。
在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，白細胞毒素嵌合體具有特定的白細胞毒素多肽序列，所述序列賦予與之融合的一個或多個GnRH多體增強的免疫原性。
本發(fā)明中所用的免疫原性白細胞毒素多肽的特定實例是美國專利5476657和5837268中描述的截短了的白細胞毒素分子。這些截短的分子包括LKT 352、LKT 111和LKT 114。LKT352得自質粒pAA352(ATCC登錄號為68283)中的1kta基因。美國專利5476657對該基因的核苷酸序列和相應的氨基酸序列作了描述?；蚓幋a了一個有914個氨基酸和估計分子量約99kDa的截短的白細胞毒素。LKT 111得自質粒pCB111(ATCC登錄號為69748)中1kta基因的的白細胞毒素多肽。美國專利5837268對該基因的核苷酸序列和相應的氨基酸序列作了描述。該基因編碼了一個截短的白細胞毒素，所述白細胞毒素是由質粒pAA352(ATCC登錄號為68283)中的重組白細胞毒素基因去掉大約1300bp長度的內部DNA片段而得來的。LKT 111多肽的分子量約52 kDa(LKT352多肽的分子量為99 kDa)，但是保留了含有T-細胞抗原決定基的LKT352 N-末端部分和含有用于產生本發(fā)明所用融合蛋白的適宜限制位置的LKT 352 C-末端部分，其中T-細胞抗原決定基對于足夠的T-細胞免疫原性是必要的。LKT 114得自質粒pAA114(在美國專利5837268中描述)中的基因。LKT 114通過在分子內部有另外的氨基酸缺失而有別于LKT111。
“免疫佐劑”指以非特異方式增加對特定抗原的免疫反應從而降低任何指定疫苗所必需的抗原量和/或減少為產生對有關抗原的充分免疫反應所必需的注射頻率的試劑。參見例如A.C.Allison J.Reticuloendothel.Soc.(1979)26:619-630。
“天然”蛋白質、多肽或肽是由天然含有蛋白質的源物質中提取出來的蛋白質、多肽或肽?！爸亟M”多肽指由重組DNA技術產生的多肽；即，由編碼所需多肽的外源性DNA構建體轉化的細胞產生?！昂铣伞倍嚯氖侵竿ㄟ^化學合成而制備的那些多肽。
“多核苷酸”指核苷酸序列，包括但不限于RNA如mRNA、cDNA、基因組DNA序列和甚至合成DNA序列。術語也涵蓋包括任何已知DNA和RNA類堿基物的序列。
本文所用的術語“得自(derived from)”表示標題分子或免疫原的實際或理論來源或起源。例如，“得自”特定GnRH分子的免疫原將具有與參照分子的相關部分極為相近的序列。因此，“得自”特定GnRH分子的免疫原可以包括所有各種類型的GnRH序列，或者可以被氨基酸殘基的插入、缺失或取代而改變，只要衍生的序列提供相當于靶GnRH分子的免疫原即可。得自標志分子的免疫原將含有對所述標志分子特異的至少一個抗原決定基。
“產生食物的動物”指產生人或家養(yǎng)寵物如貓和狗食用的食物的動物。這些動物包括但不限于哺乳動物如羊、牛、豬和鹿科動物，包括羊、牛、豬和鹿。“改善肉的感官質地”是指相對于未用本發(fā)明處理的同種屬典型的未去勢動物的肉而言，改善用本發(fā)明處理過的動物的肉的氣味、味道和/或嫩感。在這方面，得自未去勢雄性豬和羊的肉常常具有令人不快的味道和氣味。舉例來說，“公豬異味”指在烹調的未去勢豬的肉中有種尿-樣的氣味。公豬異味是由具有正常功能睪丸的雄性豬的組織中儲存的類固醇所產生的。參見例如Brooks等，動物科學雜志(J.Anim.Sci.)(1986)62:1279。公豬尸體中存在的雄甾烯酮是公豬異味的一個衡量指標，并且認為是衡量生殖腺類固醇產生的指標。此外，糞臭素(skatole)也在公豬異味中起作用。參見例如，Mortensen和Sorensen，第30屆歐洲肉研究工作者會議會議論文集(Proc.30th European Meeting of Meat ResearchWorkers),Ghent，比利時(1986)，第394-396頁，脂肪中糞臭素的分析方法。類似地，未去勢公牛通過增加肌肉塊而常常產生瘦的但咬不動的肉。因此，改善了感官質地的肉是指具有更宜人氣味、嫩度和/或味道的肉。
“降低循環(huán)中睪酮”是指使用標準測定方法測得的血清睪酮水平較通常未去勢的、未處理的同齡同種雄性動物的血清睪酮水平顯著降低，所述方法例如本文描述的RIA。
“雄性”類固醇包括雄甾烯酮、雄甾烯二酮、雄甾烯二醇和睪酮?？梢杂靡阎姆椒y定雄性類固醇。例如，使用本領域熟知的ELISAs和RIAs技術測定睪酮和其它雄性類固醇。使用市售檢測試劑盒進行測定特別方便，如Coat-A-Count總睪酮KitTM(Diagnostic Products Corporation,Los Angeles,CA)。該試劑盒是基于將睪酮特異性抗體固定到聚氯乙烯管壁上而用于定量測定血清睪酮的固相RIA。也參見Schanbacher和D’Occhio，男科學雜志(J.Andrology)(1982)3:45-51，文章描述了測定睪酮水平的直接RIA。
測定雄甾烯酮水平的ELISAs在例如Abouzied等，J.Agri.FoodChem.(1990)38:331-335中作了描述。也參見Meloen等，疫苗(Vaccine)(1994)12(8):741-746；和Booth等，動物產品(Anim.Prod.)(1986)42:145-152，描述了ELISAs檢測從脂肪中提取的雄甾烯酮。檢測雄甾烯酮水平的RIAs也是已知的。參見例如Andersen,O.,Acta.Vet.Scand.(1979)20:343-350。
“非-雄性”類固醇包括16-雄甾烯衍生物，包括5α雄甾烯酮(5α雄甾-16烯-3-酮)。使用本領域熟知的技術如ELISAs和RIAs可以測定非-雄性類固醇。參見例如，Claus等，Archiv fuer Lebensmittelhygiene(1988)39:87-90。
“顯著降低”一種或多種雄性和/或非-雄性類固醇水平，是指至少一種雄性或非-雄性類固醇的水平較通常未去勢的、未處理的同齡同種屬雄性動物的理論值至少下降約50％，更優(yōu)選至少下降約80％～90％或者更低。
術語“肥育期”指從斷奶到屠宰這一段時間，因而包括青春期前、青春期附近和青春期后期。典型的肥育期將因種屬不同而異，甚至在相同種屬內也有差異，這取決于食品制造者的偏好(preference)和動物被飼養(yǎng)的國家。因此，肥育期在很大程度上只是一個選擇的問題，本領域普通技術人員可以方便地決定一個特定動物的適宜肥育期。
2．一般方法在詳述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不限于特定制劑或方法，因而參數等當然可以變化。還應當懂得本文的技術只是為了描述本發(fā)明特定實施方案的目的，而不是對所用技術的限定。
盡管大量類似或等同于本文描述的組合物和方法的組合物和方法可以用于本發(fā)明，但是優(yōu)選本文所描述的物質和方法。
本發(fā)明的關鍵是發(fā)現通過調節(jié)生殖腺類固醇分泌來改善肉質地的方法。該方法包括在動物肥育期前或肥育期用GnRH制劑進行一次或多次初次免疫，所述GnRH制劑引起循環(huán)血中睪酮水平可測得的下降，但通常不導致完全的免疫去勢。初次接種后，在屠宰之前較短時間內用相同或不同GnRH組合物加強接種，以顯著降低一種或多種雄性和非雄性類固醇水平。
盡管GnRH通常被識別為“自體”而沒有免疫原性，但是本文所述組合物令人驚奇地提供在用之免疫了的個體中產生足夠免疫反應的方法。
接種的時間選擇取決于正在討論的動物，和食品-制造者的偏愛，所述動物通常是羊、?；蜇i。然而，第一次接種在動物肥育期前或肥育期間進行。舉例來說，對于豬和羊，初次免疫一般在動物出生到約15周的期間進行，優(yōu)選出生至約10周的期間。對于牛，初次免疫一般在出生至約48周的期間進行。
屠宰之前進行一次或多次加強接種。加強接種的時間選擇也取決于正在討論的動物。例如，對于豬和羊，加強接種一般在屠宰動物前約1-約12周進行，優(yōu)選在屠宰前約2～約8周進行，最優(yōu)選屠宰前約4～約6周，甚至屠宰前約2～約3周進行。對于牛，優(yōu)選在屠宰前數月施實第二次接種。
在一些實施方案中，后續(xù)免疫在初次免疫形成的GnRH抗體下降之后進行，即檢測到抗體水平至少低于最大抗體水平約50％時，優(yōu)選下降至少低于最大抗體水平約75％時。
本發(fā)明疫苗組合物使用GnRH多肽(定義如上)，任選地與載體分子連接以增強其免疫原性。
GnRH免疫聯(lián)合體正如上面所解釋的那樣，GnRH是內源性分子，因此，需要將GnRH多肽與載體聯(lián)合形成GnRH免疫聯(lián)合體來進一步增加GnRH多肽(或下述的多體)的免疫原性。如果GnRH抗原要施用的動物與曾提取GnRH的動物屬于同一種屬的話，則這種GnRH免疫聯(lián)合體的形成尤為必要。
適宜的載體通常是多肽類，多肽包括從感染物質如病毒表面蛋白提取的蛋白質的抗原區(qū)域或者載體肽序列。這些載體起到非-特異性刺激T-輔助細胞活性的作用并且?guī)椭龑嚓P抗原到達抗原呈遞細胞(APCs)，在細胞表面進行與主要組織相容性復合體(MHC)的分子有關的加工和呈遞。
為了此目的，已經開發(fā)出數種載體系統(tǒng)。例如，小的肽半抗原常與蛋白載體如匙孔戚血藍蛋白(Bittle等(1982)自然(Nature)298:30-33)、細菌毒素如破傷風毒素(Muller等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:569-573)、卵白蛋白、白細胞毒素多肽和鯨肌紅蛋白進行聯(lián)結，產生免疫反應。這些聯(lián)結反應通常導致每摩爾載體蛋白中整合入數摩爾的肽半抗原。
本發(fā)明用的其它適宜載體包括輪狀病毒的VP6多肽或其功能片段，如在美國專利5071651中所披露的。也適用于本發(fā)明的是病毒蛋白與一種或多種GnRH的抗原決定基的融合產物，所述融合產物按照美國專利4722840所披露的方法來制備。其它還適宜的載體包括細胞，如淋巴細胞，由于這種形式的呈遞擬似在個體進行的天然呈遞模式，因此產生免疫狀態(tài)?；蛘?，GnRH免疫原可以與紅細胞聯(lián)結，優(yōu)選與個體自身的紅細胞聯(lián)結。肽與蛋白質或細胞聯(lián)結的方法為本領域人員所公知。
適用于本發(fā)明的釋放系統(tǒng)也可以使用微粒載體。例如，在形成顆粒前作為平臺，而免疫原可以聯(lián)結和整合到平臺上。基于proteosomes的系統(tǒng)(Lowell等(1988)科學(Science)240:800-802)和免疫刺激復合物(Morein等(1984)自然(Nature)308:457-460)也為本領域所公知。
本發(fā)明也使用通過重組產生的自聚集形成顆粒的嵌合蛋白質載體系統(tǒng)。例如，酵母逆轉錄轉座子，Ty，編碼一系列象顆粒樣聚集進入病毒的蛋白質(Ty-VLPs；Kingsman等(1988)疫苗(Vaccines)6:304-306)。因此，可以將編碼有關GnRH免疫原的基因或其片段插入到TyA基因中并在酵母中以融合蛋白的形式表達。該融合蛋白保持自聚集成均勻大小顆粒的能力。另一有用的病毒樣載體系統(tǒng)是基于HbsAg(Valenzuela等(1985)生物工程(Bio/Technol.)3:323-326；美國專利4722840；Delpeyroux等(1986)科學(Science)233:472-475)、乙型肝炎核心抗原(Clarke等(1988)疫苗(Vaccines)88(Ed.H.Ginsberg等)127-131)、脊髓灰質炎病毒(Burke等(1988)自然(Nature)332:81-82)和煙草花葉病病毒(Haynes等(1986)生物/工程(Bio/Technol.)4:637-641)的載體系統(tǒng)。
特別優(yōu)選的載體包括前面曾描述的血清白蛋白、匙孔戚血藍蛋白、卵白蛋白、鯨肌紅蛋白、白細胞毒素分子，以及本領域公知的其它蛋白質。例如，使用白細胞毒素多肽的嵌合系統(tǒng)，定義同前，比如融合到有關抗原中的溶血性巴斯德氏菌白細胞毒素(LKT)多肽也可用于本發(fā)明。在這方面，用于數種白細胞毒素載體的核苷酸序列和相應氨基酸序列是已知的。參見例如，美國專利5422110、5708155、5723129和國際申請公開WO98/06848和WO96/24675。本文使用的免疫原性白細胞毒素多肽的特定實施例包括在前面引證的專利和出版物中描述的LKT 342、LKT352、LKT 111、LKT 326和LKT 101。特別優(yōu)選LKT 111和LKT 114。編碼LKT 111的基因是從質粒pAA352(ATCC登錄號為68283)的重組白細胞毒素基因中去掉大約1300bp長度的內DNA片段而得來的。LKT 111多肽分子量大約為52 kDa(LKT 352的分子量為99 kDa)，但是保留了LKT352 N-末端部分和LKT 352的C-末端部分，所述N-末端部分含有對于足夠的T-細胞免疫原性所必需的T-細胞抗原決定基，而C-末端則含有用于產生本發(fā)明融合蛋白的適宜限制位點。LKT 114通過從分子內部額外缺失氨基酸而有別于LKT 111。參見例如，美國專利5837268和國際申請公開WO98/06848、WO96/24675中描述的那些分子。
蛋白質載體可以使用它們的天然形式，或者它們的功能團可以被修飾，例如賴氨酸殘基琥珀?；蛘吲c半胱氨酸-硫內酯(thiolactone)反應。也可以通過例如氨基酸功能基與3-(4-二吡啶基丙酸鹽的2-亞氨基thiolane或N-羥基琥珀酰酯反應而將巰基引入載體(或抗原)中。適宜的載體也可以引入用于附著于肽免疫原的間隔臂(如亞乙基二胺或類似大小的其它雙官能團分子)而被修飾。
使用標準的聯(lián)結反應可以將載體與有關的GnRH完全偶合。或者，用重組方法制備用于本發(fā)明的嵌合分子，比如將編碼適宜多肽載體的基因與編碼特定GnRH免疫原的一個或多個拷貝的基因或基因片段融合。GnRH部分既可與載體分子的5’部分融合也可與3’部分融合，或者GnRH部分可以固定在載體分子的內部位點上。
GnRH免疫原也可以通過表達相同GnRH免疫原的載體病毒而被施用?？捎糜诒景l(fā)明的載體包括但不限于牛痘和其它痘病毒、腺病毒和肝炎病毒。舉例來說，表達蛋白質的牛痘病毒重組體可以按照下述方法構建:首先將編碼特定蛋白質的DNA插入到一個適宜載體中，使該DNA鄰接牛痘病毒啟動子和牛痘病毒旁側DNA序列，如編碼胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的序列。然后將載體用于轉染細胞，細胞同時感染上牛痘。同源重組體起到將牛痘啟動子連同編碼所需免疫原的基因插入到病毒基因組中的作用。在含有5-溴脫氧尿苷的條件下培養(yǎng)細胞，挑選抗性病毒斑塊，從而選擇出產生的TK-重組體。
GnRH多體通過產生含有多拷貝特定抗原決定基的免疫原性分子也可以顯著提高GnRH免疫原的免疫原性。以這種方式，內源性GnRH可以產生有效的自身抗原。
相應地，本發(fā)明一個方面是提供含有GnRH免疫原多體的疫苗組合物，所述GnRH免疫原是核苷酸形式或者是肽的形式。GnRH多體具有一個以上拷貝的前述特定GnRH免疫原、肽或抗原決定基，或者多個串聯(lián)重復的特定GnRH免疫原、肽或抗原決定基。因此，GnRH多體可以包括多個或串聯(lián)重復的特定GnRH序列，多個或串聯(lián)重復的特定GnRH抗原決定基，或者包括它們的任何方便組合。使用上面詳述的技術，可以識別GnRH抗原決定基。
例如，GnRH多體可以相當于具有重復單元的通式(GnRH-X-GnRH)y的分子，其中GnRH是GnRH免疫原，X選自肽鍵、氨基酸間隔基團、載體分子和[GnRH]n，其中n是大于或等于l的整數，y是大于或等于1的整數，“GnRH”可以進一步含有GnRH免疫原。因此，GnRH多體可以含有2-64或更多的GnRH免疫原，更優(yōu)選2-32或2-16GnRH免疫原。
此外，特定GnRH免疫原序列可以全部相同，或者可以是GnRH的不同衍生物、類似物、變體或抗原決定基，只要它們保持引發(fā)免疫反應的能力即可。而且，如果GnRH免疫原化學性地或重組性地與載體連接的話，GnRH免疫原可以與正在討論的載體的5’-末端、3’-末端相連接，或者與載體側連接。另外，GnRH多體可以位于載體內部的位點上。與本發(fā)明GnRH多體一起使用的一個特定載體是前面曾描述過的白細胞毒素多肽。
正如前面所解釋的那樣，GnRH分子之間可以存在間隔序列。例如，在GnRH多體中有Ser-Gly-Ser三聚體和Gly-Ser二聚體，此例證提供GnRH免疫原重復序列之間的間隔區(qū)。參見例如圖2B(SEQ ID號:10和11)。在特定GnRH免疫原之間進行各種間隔序列的策略取代，用于在個體構造上產生更強的免疫原性。相應地，本發(fā)明中，特定間隔序列可以囊括廣泛的各種分子，比如單個氨基酸連接或2～數個氨基酸序列。特定間隔基團可以優(yōu)選提供酶裂解位點，以便于表達的多體可以在體內被蛋白酶解(被APCs等)加工而產生大量的肽，每一個肽含有至少一個衍生自載體部分的T-細胞抗原決定基，肽優(yōu)選與基本上全長的GnRH多肽序列相融合。
可以構建間隔基團以使得特定GnRH分子之間的連接區(qū)含有對于被免疫個體而言的明顯的外源序列，從而在聯(lián)合的GnRH免疫原的基礎上產生增強的免疫原性。另外，可以構建間隔序列以便于提供T-細胞抗原性，如編碼兩親的和/或螺旋狀肽序列的那些序列，所述序列通常被本領域認為是提供免疫輔助T-細胞抗原決定基。由間隔序列提供的對特定T-細胞抗原決定基的選擇將依要被接種的脊椎動物的種屬而異。盡管特定GnRH部分是包括間隔序列的例示，但是本發(fā)明的又一目的是提供一種或多種含有直接鄰接GnRH序列(不插入間隔序列)的GnRH多體。
因此，本發(fā)明組合物中所用的GnRH多體序列產生高度免疫原性的GnRH抗原。
GnRH多肽、免疫聯(lián)合體和多體可以使用下述方法產生，并且用于核苷酸免疫、基因治療、基于蛋白質的免疫方法等等。
基于核酸的免疫方法通常，本發(fā)明所用的基于核酸的疫苗包括編碼GnRH免疫原的的相關區(qū)域、適宜控制序列和任選地輔助治療的核苷酸序列。該核酸分子以載體的形式制備，所述載體包括引導在受體細胞中轉錄和翻譯的必要元件。
為了增強在接受免疫的個體中的免疫反應，核酸分子可以與輔助物質如藥劑、佐劑聯(lián)合施用，或者與編碼生物反應調節(jié)劑如細胞因子等的釋放載體聯(lián)合施用。其它輔助物質包括但不限于增加體重、肌肉塊或肌肉強度的物質，如生長激素、生長促進劑、β受體拮抗劑、分塊劑(partitioning agent)和抗生素。
本發(fā)明所選用的核苷酸序列可以從已知的來源中得到，例如，使用標準技術從含有所需基因或核苷酸序列的細胞或組織中分離出來，或者使用重組或合成技術制備。
一旦制備或分離出編碼GnRH免疫原的序列。則可以將此序列克隆入適宜的載體或復制子中。本領域技術人員已知大量的克隆載體，選用適宜克隆載體只是個選擇的問題而已。使用本領域公知的標準方法完成與其它序列如輔助分子或載體分子的連接。嵌合體的一種或多種GnRH免疫原部分可以以其5’和/或3’末端與所需的輔助序列或載體分子融合?；蛘?，一種或多種GnRH免疫原部分可以位于載體分子的內部位點上，或者這些免疫原部分位于嵌合體的兩末端和內部位點。
或者，任選地與載體分子連接的編碼有關GnRH的DNA序列可以通過合成而不是克隆來制備。DNA序列可被設計成具有特定序列的適宜密碼子。然后由用標準方法制備的重疊寡核苷酸裝配免疫原全序列并且裝配成全編碼序列。參見例如，Edge(1981)自然(Nature)292:756；Nambair等(1984)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)259:6311。
然后在控制操作下將編碼序列放置于在適宜宿主組織體內表達的適宜控制元件中?？刂圃倪x擇取決于接受處理的個體和所用制劑的類型。因此，如果要使用個體的內源性轉錄和翻譯機器來表達免疫原的話，則使用與特定個體相適配的控制元件。在這方面，本領域技術人員公知數種用于哺乳動物系統(tǒng)的啟動子。例如，用于哺乳動物細胞表達的代表性啟動子包括SV40早期啟動子(一種CMV啟動子如CMV立即早期啟動子)、小鼠乳腺癌病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)和單純皰疹病毒啟動子，等等。其它非病毒性啟動子如來自小鼠金屬硫蛋白基因的啟動子也可用于哺乳動物表達。
通常，也存在3’末端連于轉錄終止密碼子的轉錄終止和聚腺苷酸序列。優(yōu)選地，也存在5’末端與密碼子序列相連的最適轉錄起始序列。轉錄終止子/聚腺苷酸信號的實例包括那些衍生自SV40(如Sambrook等，Supra所描述的)以及牛生長激素終止子序列的信號。將本發(fā)明所用的構建體也可以設計成含有剪接供體和受體位點的內含子。
增強子元件也可用于本發(fā)明以增加構建體的表達水平。實例包括SV40早期基因增強在(Dijkema等(1985)EMBO J.4:761)、衍生自魯斯氏肉瘤病毒長末端重復序列(LTR)增強子/啟動子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)和衍生自人CMV(Boshart等(1985)細胞(Cell)41:521)的元件，如包括在CMV內含子A序列中的元件。
一旦制備好核酸疫苗組合物，則可以使用已知方法將該核酸疫苗釋放給個體。在這方面，對于使用編碼DNAs抗原進行免疫的各種技術已有描述。參見例如，授予Felgner等的U.S.專利5589466；Tang等(1992)自然(Namre)358:152；Davis等(1993)人類分子遺傳學(Hum.Molec.Genet)2:1847；Ulmer等(1993)科學(Science)258:1745；Wang等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4156；Eisenbraun等(1993)DNA細胞生物學(DNA CellBiol.)12:791；Fynan等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:12476；Fuller等(1994)AIDS Res.Human Retrovir.10:1433；和Taz等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9519。也可以使用將核酸分子釋放給在體外細胞，接下來再引入宿主的常規(guī)方法，比如脂質體介導的基因轉移。參見例如，Hazinski等(1991)美國呼吸細胞分子生物學(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)4:206-209；Brigham等(1989)美國醫(yī)學科學雜志(Am.J.Med.Sci.)298:278-281；Canonico等(1991)臨床研究(Clin.Res.)39:219A；和Nabel等(1990)科學(Science)249:1285-1288。因此，使用已知技術可以將核酸疫苗組合物以液體或顆粒形式釋放。下面將更加全面地描述代表性的疫苗組合物。
基于蛋白質的釋放方法使用本領域技術人員熟知的各種方法也可以制備基于蛋白質的組合物。特別是，使用標準純化技術可以從天然來源的物質中直接分離GnRH多肽?；蛘撸褂帽绢I域熟知的和例如Sambrook等在supra中描述的核酸表達系統(tǒng)重組制備多肽。還可以使用化學聚合物合成法如固相肽合成法合成GnRH多肽。這些方法是本領域技術人員所熟知的。參見例如，J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》(Solid Phase Synthesis)第二版，PierceChemical CO.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield,《肽分析、合成、生物學》(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology),E.Gross和J.Meienhofer編著，第2卷，學術出版社，紐約(1980)，第3-254頁中有關固相肽合成技術部分。
本發(fā)明組合物中所用的GnRH多肽，也可以通過將所述GnRH多肽的編碼序列克隆入任何適宜的表達載體和復制子中而制備。不勝枚舉的克隆載體為本領域技術人員所公知，適宜克隆載體的選用僅是個選擇問題而已?？寺∮玫闹亟MDNA載體和能夠轉化的宿主細胞的實例包括噬菌體入(大腸桿菌),pBR322(大腸桿菌),pACYC1 77(大腸桿菌),pKT230(革蘭氏陰性菌),pGV1106(革蘭氏陰性菌),pLAFR1(革蘭氏陰性菌),pME90(非大腸桿菌革蘭氏陰性菌),pHV14(大腸桿菌和枯草桿菌),pBD9(枯草桿菌),pIJ61(鏈霉菌屬),pUC6(鏈霉菌屬),YIp5(酵母屬),YCp19(酵母屬)和牛乳頭狀瘤病毒(哺乳動物細胞)。一般參見DNA克隆(DNA Cloning)第1&Ⅱ,supra；Sambrook等，supra；B.Perbal,supra。
例如，已經測定了豬、牛和羊的GnRH編碼序列(Murad等(1980)第6版《治療的藥理學基礎》中激素和激素拮抗劑章節(jié))，已經克隆了人GnRH的cDNA并因而建立了其序列(Seeburg等(1984)自然(Nature)311:666-668)。也公開了已知序列的其它GnRH多肽，如鮭魚和雞中的GnRH分子(1986年12月18日公告的國際申請公開WO86/07383)。本發(fā)明使用的特定GnRH編碼序列示于圖2A(SEQ ID號8和9)和2B(SEQ ID號10和11)。該GnRH編碼序列在脊椎動物尤其是哺乳動物高度保守，豬、牛、羊和人GnRH序列彼此相同。
使用本領域公知的重組技術可以將這些編碼所需GnRH多肽的序列部分，和任選地編碼載體蛋白的序列克隆、分離和聯(lián)結在一起。參見例如Sambrook等，supra。
可以將基因放置于控制的啟動子、核糖體結合位點(細菌表達用的)和任選地一個操縱基因中，由此通過適宜轉錄體將有關DNA序列轉錄為RNA。編碼序列可以含有或不含有信號肽或前導序列。例如，可以使用大腸桿菌tac啟動子或蛋白A基因(spa)啟動子和信號序列表達多肽。在后-翻譯過程中前導序列可以被細菌宿主除去。參見例如，美國專利4431739；4425437；4338397。也可以含有前面曾描述過的輔助序列。
除了控制序列外，期望加入能夠調節(jié)涉及宿主細胞生長的多肽序列表達的調節(jié)序列。調節(jié)序列為本領域技術人員所公知，其實例包括使基因表達對化學或物理刺激應答而開或關的那些序列，所述刺激包括調節(jié)化合物的存在。其它類型的調節(jié)元件也可存在于載體中，例如增強子序列。
構建表達載體以使得特定編碼序列位于具有適當調節(jié)序列的載體中，關于控制序列，編碼序列的定位和方向是這樣的使編碼序列在控制序列的“控制”下進行轉錄(即，與控制序列處DNA分子結合的RNA聚合酶轉錄編碼序列)。為達到此目的，期望修飾編碼特定GnRH多肽的序列。例如，有些情況下，對序列進行修飾是必要的，以便于序列能夠以適當方向附著于控制序列上；即保持閱讀框架。控制序列和其它調節(jié)序列可以在插入載體前與編碼序列連接，所述載體如前述的克隆載體?；蛘?，可以將編碼序列直接克隆入已經含有控制序列和適當限制位點的表達載體中。
有些情況下，期望加入使宿主生物體分泌多肽的序列，接下來將分泌信號分裂掉。也期望產生多肽的突變體或類似物。突變體或類似物可以這樣來制備將編碼參照多肽的序列部分刪除，或者如果編碼參照多肽的序列部分存在的話，則在序列內插入和/或取代一種或多種核苷酸序列。修飾核苷酸序列的技術，比如定點誘變的突變等，是本領域技術人員眾所周知的。參見例如，Sambrook等，supra；DNA克隆(DNA Cloning)，第1和Ⅱ卷，supra；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，supra；Kunkel,T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1 985)82:448；Geisselsoder等，生物技術(BioTechniques)(1987)5:786；Zoller和Smith，酶學方法(Methods Enzymol.)(1983)100:468；Dalbie-McFarland等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1982)79:6409。
GnRH多肽可以在各種系統(tǒng)中表達，包括昆蟲、哺乳動物、細菌、病毒和酵母表達系統(tǒng)，所有這些系統(tǒng)均為本領域所熟知。例如，昆蟲細胞表達系統(tǒng)，如桿狀病毒系統(tǒng)，是本領域技術人員所已知的并且例如Summers和Smith在德克薩斯農業(yè)試驗站公報(Texas AgriculturalExperiment Station Bullein)1555號(1987)中作了描述。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的材料和方法是市售的試劑盒形式，購自Invitrogen，圣地亞哥CA(“MaxBac”試劑盒)。類似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是本領域所公知的并且例如Sambrook等在supra上作了描述。酵母表達系統(tǒng)也是本領域所公知的并且在例如《酵母基因工程》(Barr等編著，1989,Butterworths，倫敦)上作了描述。
使用上述系統(tǒng)的大量適宜宿主細胞也是已知的。例如，哺乳動物細胞株是本領域技術人員所公知的，包括購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的無限增殖細胞株，例如但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎臟細胞(COS)、人肝細胞肉瘤細胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛腎(“MDBK”)細胞，以及其它細胞。類似地，細菌宿主如大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌可以用于本發(fā)明表達構建體中。適用于本發(fā)明的酵母宿主包括尤其是啤酒糖酵母，白色假絲酵母、麥芽糖假絲酵母、多形漢遜酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、季也蒙氏畢赤氏酵母、巴斯德畢氏酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowialipolytica。使用桿狀病毒表達載體的昆蟲細胞包括，尤其是，埃及伊蚊、Autographa califomica、家蠶、果蠅、spodoptera frugiperda和Trichoplusiani。
取決于選擇的表達系統(tǒng)和宿主，用上述表達載體轉化了的生長宿主細胞在能夠表達多肽的條件下產生GnRH多肽。然后從宿主細胞中分離和純化表達的多肽。如果表達系統(tǒng)將多肽分泌到生長介質中，那么可以直接從生長介質中純化多肽。如果多肽不是被分泌的，那么可以從細胞溶胞產物中純化多肽。適宜生長條件和回收方法的選擇是本領域公知常識。
一旦得到GnRH多肽，聯(lián)合或不聯(lián)合載體，GnRH多肽即可用于制備成組合物，比如下面將要進一步描述的疫苗組合物，以引發(fā)抗體產生。
抗體產生標題GnRH免疫原可用于生成被動免疫方法所使用的抗體。通常，適用于產生抗體的肽一般在長度上要有至少約3-5個氨基酸，優(yōu)選7-10個氨基酸長度的肽。
抗標題免疫原的抗體包括多克隆和單克隆抗體制劑、單特異抗血清，以及含有對正在討論的靶分子保持特異性的雜合抗體、變化的(altered)抗體、F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、單個結構域抗體、嵌合抗體、人源化抗體和它們的功能片段的制劑。例如，抗體可以包括對正在討論的靶分子保持特異性可變區(qū)或者可變區(qū)片段。其它的抗體可以衍生自將要對其施用此抗體的種屬。因此，如果抗體將要施用于人，那么可以將抗體“人源化”以便減少免疫原性而仍保存抗體活性。對于嵌合抗體的描述，參見例如Winter,G.和Milstein,C.(1991)自然(Nature)349:293-299；Jones,P.T.等(1988)332:323-327；和Carter,P.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289。此類嵌合抗體可以不僅含有靶分子結合位點，而且也含有其它蛋白質的結合位點。這樣，就可以生成既對外源性抗原也對內源性抗原具有靶向特異性的雙功能反應物。
如果需要多克隆抗體，那么，就按照前面所描述的那樣，用所需的抗原或其片段或者突變抗原對選定的哺乳動物(如鼠、兔、羊、馬等)進行免疫。免疫前，可以期望進一步增加特定免疫原的免疫原性，使用本領域已知的數種方式中的任何一種即可實現。
例如，為產生抗體而進行的免疫通常通過如下步驟來完成將蛋白質和適宜賦形劑混合或乳化，將混合物或乳劑進行非腸道注射(一般為皮下或肌內注射)，其中所述賦形劑如生理鹽水，優(yōu)選在佐劑如Freund’s完全佐劑，或者下述的任何佐劑中。在2-6周后通常用在生理鹽水中的蛋白質，優(yōu)選使用Freund’s不完全佐劑給等動物進行加強免疫。使用本領域已知的技術，通過體外免疫也可以產生抗體。然后從免疫了的動物中按照已知的方法得到多克隆抗血清。參見例如Jurgens等(1985)色譜雜志(J.Chrom.)348:363-370。如果要使用含有多克隆抗體的血清，則可以用已知的方法通過免疫親合色譜法來純化多克隆抗體。
通常使用Kohler和Milstein(自然(Nature)(1975)256:495-96)或其改良法制備單克隆抗體。具有代表性的是按如上所述對小鼠或大鼠進行免疫。然而，與其通過使動物出血來提取血清，不如切除脾臟(和任選地數個大的淋巴結節(jié))并分散成單個細胞來制備。如果需要，在包被了蛋白抗原的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔上加入一種細胞懸浮液，可以篩選脾細胞(去除了非特異粘附細胞之后)。表達對抗原特異的膜-結合免疫球蛋白的B-細胞將結合在培養(yǎng)皿上，而且不被剩余的懸浮液漂洗下來。然后，將得到的B-細胞或者所有分散的脾細胞用于與來自雜交瘤的骨髓瘤進行融合，并在選擇的培養(yǎng)基(例如，次黃嘌呤、氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基，“HAT”)中培養(yǎng)。將得到的雜交瘤進行有限的稀釋后制板，并分析特異結合于免疫抗原(不與未處理抗原結合)的抗體的產生。然后體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或者空纖維反應器中)或體內(如小鼠腹水)培養(yǎng)選出的單克隆抗體-分泌型雜交瘤。參見例如，M.Schreier等，雜交瘤技術(Hybridoma Techniques)(1980)；Hammerling等，單克隆抗體和T-細胞雜交瘤(Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas)(1981)；Kennett等，單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)(1980)；也參見下列美國專利4341761；4399121；4427783；4444887；4452570；4466917；4472500,4491632；和4493890。產生的抗有關GnRH免疫原的一系列單克隆抗體或其片段，可以按其各種特性來篩選；即，按照同位型、抗原決定基、親和力等。
也可以制備抗有關GnRH免疫原的抗體的功能性片段，而且可以通過從抗體分子上裂解掉不負責與抗原結合的恒定區(qū)來制備，例如使用胃蛋白酶來產生F(ab’)2片段。這些片段含有兩種結合位點，但是每條重鏈缺乏恒定區(qū)。類似地，如果需要，可以制備含有單抗原結合位點的Fab片段，例如，通過用胃蛋白酶消化多克隆或單克隆抗體。使用標準的技術，也可以制備僅包括重鏈可變區(qū)和輕鏈的功能性片段。這些片段被稱為Fv。
使用標題免疫原也可以制備嵌合的和人源化的抗體。這些抗體可以被設計成將不需要的免疫反應降至最小，所述不需要的免疫反應通常歸因于單克隆和多克隆抗體中所含的異源性恒定區(qū)和種屬特異性構架可變區(qū)。例如，如果要將抗體施用于人，則使用本領域普遍知曉的技術，通過用人的恒定區(qū)置換非-人恒定區(qū)，無論非-人恒定區(qū)位于重鏈還是位于輕鏈亦或是既位于重鏈也位于輕鏈，可以制備嵌合的抗體。參見例如，Winter,G.和Milstein,C.(1991)自然(Nature)349:293-299；Jones,P.T.等(1988)332:323-327；和Carter,P.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289。
GnRH組合物一旦制備出上述GnRH多肽或抗體，那么即可以把GnRH多肽或抗體制成用于釋放給脊椎動物體的組合物。有關的GnRH分子是單獨給藥，或者與可藥用載體或賦形劑混合給藥。適宜的載體是，例如水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，和它們的聯(lián)合。另外，載體可以含有小量輔助物質如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑，或者當組合物為疫苗組合物時含有佐劑，佐劑增加疫苗的效力。適宜的佐劑將在下面更加詳細地描述。本發(fā)明組合物也可以含有輔助物質，諸如藥理試劑、細胞因子或者其它生物反應調節(jié)劑。
正如上面所闡述的那樣，本發(fā)明疫苗組合物可以含有佐劑以進一步增加GnRH免疫原的免疫原性。佐劑可以包括例如，乳化劑、胞壁酰二肽、阿夫立定、含水佐劑如氫氧化鋁和各種皂甙中的任何一個、殼聚糖-基佐劑、油和本領域已知的其它物質。例如，這里用作乳化劑的化合物包括天然和合成的乳化劑，以及陽離子、陰離子和非離子化合物。在合成的化合物中，陽離子乳化劑包括例如月桂酸和油酸的鉀、鈉和鋁鹽，脂肪酸的鈣、鎂和鋁鹽(即，金屬皂)，和有機磺酸鹽如十二烷基硫酸鈉。合成的陰離子劑包括例如，溴化十六烷基三甲銨，而合成的非離子劑的實例是甘油酯(如，單甘油酯)、聚氧乙烯乙二醇酯和醚，以及脫水山梨醇脂肪酸酯(如，脫水山梨醇一棕櫚酸酯)和其聚氧乙烯衍生物(如，聚氧乙烯脫水山梨醇一棕櫚酸酯)。天然乳化劑包括阿拉伯膠、明膠、卵磷脂和膽固醇。
其它適宜的佐劑可以用油性組分形成，如單個油、油的混合物、油包水乳液或者水包油乳液。油可以是礦物油、蔬菜油或動物油。優(yōu)選礦物油或者油性組分為礦物油的水包油乳液。在這方面，這里將“礦物油”定義為通過蒸餾技術從石油中得到的液態(tài)烴混合物；該術語與“液態(tài)石蠟”、“液態(tài)石油”和“白色礦物油”同義。術語也包括“輕礦物油”，即類似地通過蒸餾石油而得到的油，但是較白色礦物油具有稍小的比重。參見例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,supra。一個特別優(yōu)選的油性組分是以商品名EMULSIGEN PLUSTM(含有輕礦物油和0.05％福爾馬林，和作為防腐劑的30 mcq/mL慶大霉素)出售的水包油乳液，可購自MVP實驗室，Ralston,Nebraska。適宜的動物油包括例如，鱈魚肝油、大比目魚油、鯡油、柑橘粗制油(orange roughy oil)和鯊魚肝油，所有這些動物油均可商購得到。適宜的蔬菜油包括但不限于，canola油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、大豆油等。
或者，大量脂肪族含氮堿可用作疫苗制劑的佐劑。例如，已知的免疫原性佐劑包括氨、季銨鹽化合物、胍、芐脒和硫脲(thiouroniums)(Gall,D.(1966)免疫學(Immunology)11:369-386)。特異化合物包括二甲基雙十八烷基溴(DDA)(可以從Kodak商購)和N,N-雙十八烷基烷基-N,N-雙(2-羥乙基)丙二胺(“avridine”)。也描述了使用DDA作為免疫佐劑；參見例如，KodakLaboratory Chemicals Bulletin 56(1):1-5(1986)；Adv.Drug Deliv.Rev.5(3):163-187(1990)；控釋雜志(J.Controlled Release)7:123-132(1988)；臨床實驗免疫學雜志(Clin.Exp.Immunol.)78(2):256-262(1989)；免疫方法學雜志(J.Immunol.Methods)97(2):159-164(1987)；免疫學(Immunology)58(2):245-250(1986)；和Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.68(3):201-208(1982)。Avridine也是眾所周知的佐劑。參見例如，授予Wolff,Ⅲ等的4310550號美國專利，其中描述了一般使用N,N-高級烷烴基烴基-N,N’-雙(2-羥乙基)丙二胺，尤其使用avridine作為疫苗佐劑。授予Babiuk的5151267號美國專利和Babiuk等(1986)病毒學(Virology)159:57-66中也涉及使用阿夫立定作為疫苗佐劑。
特別優(yōu)選用于本發(fā)明的是稱為“VSA-3”的佐劑，它是EMULSIGENPLUSTM佐劑的改良型，所述EMULSIGEN PLUSTM佐劑包括DDA(參見例如序號為08/463837的美國專利申請)。
對于本領域技術人員而言，制備此劑型的實際方法是已知的或顯而易見的。參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,Pennsylvania，第18版，1990。將要施用的組合物或制劑包括足以使接受處理的個體達到所需狀態(tài)的大量GnRH多肽。
通常，本發(fā)明組合物被制備成可注射的劑型，或者液態(tài)溶液或懸浮液形式，或者適宜于在注射前在液體載體中配制成溶液或懸浮液的固態(tài)形式。也可以將制劑乳化或者將活性組分包裹在脂質體載體或使用的其它微粒載體中。
組合物也可以制成固體形式。例如，可以制備成能夠從市售無針注射器設備釋放的固體微粒制劑?；蛘?，提供植入個體的固體劑型的植入體。也可以使用控釋或持續(xù)釋放制劑，而且通過將GnRH多肽摻入到載體或賦形劑中而制得，所述載體或賦形劑如脂質體、非再吸收性不滲透性聚合物如醋酸乙烯基乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物、可膨脹的聚合物如水凝膠，或者再吸收聚合物如膠原和特定聚酸或聚酯如用于制作再吸收縫線的那些聚酸或聚酯。
此外，多肽可以以中性或鹽的形式摻入到組合物中?？伤幱名}包括酸加成鹽(與活性肽的自由氨基形成的鹽)和與無機酸如鹽酸或磷酸或者與有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等形成的鹽。由自由羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，和衍生自有機堿如異丙胺、三甲胺、乙氨基乙醇、組織胺、普魯卡因等。
制備含有有效量GnRH多肽的組合物，確切的量是本領域技術人員很容易決定的，如果是疫苗組合物，則所述量取決于要接受處理的動物、動物免疫系統(tǒng)對合成抗體的承受量，和所需的GnRH免疫中和程度。為了本發(fā)明的目的，以每mL注射溶液中包含約1μg～約2mg，更優(yōu)選約5μg～約800μg，甚至更優(yōu)選約10μg～約400μg GnRH多肽的制劑給藥，將足以喚起免疫反應。如果使用肽載體嵌合體，則疫苗制劑中免疫原與載體的比值將依構建此分子所選用的特定載體和免疫原而異。
舉例來說，如果使用的是白細胞毒素嵌合體，那么疫苗制劑中GnRH與白細胞毒素的比值將依構建分子所選用的特定白細胞毒素和GnRH多肽分子而異。一個優(yōu)選的疫苗組合物含有白細胞毒素-GnRH嵌合體，其每個融合分子中具有約1～90％GnRH，優(yōu)選約3～80％和最優(yōu)選約10～70％GnRH多肽。增加LKT-GnRH融合分子中GnRH含量百分比，則降低為了引發(fā)對GnRH的足夠免疫反應而必須施用于個體的總抗原量。
在肥育期，以至少單次劑量，任選地2次或更多次劑量對個體施用上述組合物中的一種，例如在初次免疫中。初次免疫后，在屠宰之前不久時間，用相同或不同的GnRH組合物進行一次或多次加強免疫，以顯著降低循環(huán)中一種或多種雄性和非雄性類固醇的水平。
任何適宜的藥物釋放手段均可用于將本發(fā)明組合物釋放給脊椎動物個體。例如，傳統(tǒng)的帶針注射器、噴霧或壓縮氣體(空氣)注射器(授權Smoot的1605763號美國專利；授權給Laurens的3788315號美國專利；授權Clark等的3853125號美國專利；授權Morrow等的4596556號美國專利；授權Dunlap的5062830號美國專利)、液體噴射注射器(授權Scherer的2754818號美國專利；授權Gordon的3330276號美國專利；和授權Lindmayer等的4518385號美國專利)和顆粒注射器(授權McCabe等的5149655和授權Sanford等的5204253號美國專利)均適宜釋放本發(fā)明組合物。
優(yōu)選地，通過肌內、皮下、靜脈內、皮下、皮內、經眼或經粘膜途徑施用于個體。如果使用的是噴射注射器，則液態(tài)疫苗組合物的單次噴射是在高壓和高速下噴射出來的，例如1200-1400 PSI，從而在皮膚上制造裂口并穿透到適宜免疫的深度。
下面是完成本發(fā)明特定實施方案的實施例。提供的實施例僅僅是為了闡述的目的，而不以任何方式來限定本發(fā)明的范圍。
3．試驗實施例1構建pCB122和pCB130質粒pCB122和pCB130用于制備下面描述的實施例中使用的GnRH融合蛋白。兩種質粒產生相同氨基酸序列的蛋白質。兩種質粒中的GnRH構建體含有與編碼載體白細胞毒素多肽的DNA序列的5’和3’末端均融合的8個GnRH串接重復序列。每一個改變的GnRH序列所發(fā)生的變化是序列中的第4個堿基由胞嘧啶變成鳥嘌呤。此變化導致GnRH分子第二個氨基酸由組氨酸變?yōu)樘於彼岬膯蝹€氨基酸的變化。參見圖2A(SEQID號8和9)和2B(SEQ ID號10和11)。構建體的白細胞毒素部分編碼截短的白細胞毒素，截短的白細胞毒素是從質粒pAA352(ATCC登陸號68283，在美國專利5476657中作了描述)所含的重組白細胞毒素基因中通過去除大約1300bp長度的內部DNA片段而得來的。白細胞毒素多肽估計分子量52kDa，含有用于產生本發(fā)明融合蛋白的常規(guī)的限制位點。嵌合構建體在Tac啟動子控制之下，而通過Lac I的使用來控制誘導。由質粒pCB122和pCB130產生的GnRH-白細胞毒素融合蛋白示于圖3A～圖3F(SEQ ID號12和13)。
質粒pCB122如下制備。按照美國專利5476657和5837268所描述的方法分離白細胞毒素基因。尤其是，為了分離白細胞毒素基因，使用標準技術構建p.Haemolytica A1(菌株B122)的基因文庫。參見Lo等，感染免疫學(Infect.Immun.),supra；DNA克隆(DNA CLONING)第Ⅰ和Ⅱ卷，supra；和Sambrook等，supra。在質粒載體pUC13中建立基因組文庫，在入噬菌體gtll中構建DNA文庫。產生的克隆用于轉染大腸桿菌，匯聚并篩選與曾感染過p.Haemolytica并用濃縮的p.Haemolytica培養(yǎng)物上清液加強免疫過以提高抗白細胞毒素抗體水平的牛血清反應的單個的克隆。通過將細胞溶解產物與牛中性白細胞一起孵育，接下來測定從中性白細胞中釋放出的乳酸鹽脫氫酶，從而篩選陽性克隆產生白細胞毒素的能力。
鑒定了數種陽性克隆，并使用限制性核酸內切酶繪圖分析這些重組體。一個克隆似乎與前面克隆的白細胞毒素基因相同。參見Lo等感染免疫學(Infect.Immun.)supra。為了確認是否如此，重新克隆了較小的片段并進行了限制圖譜的比較。檢測表明已克隆了DNA的大約4千個堿基對。通過染色體步移(從5’到3’方向)分離出進行性變大的克隆以便分離大約8kb的全長重組體。最終的構建體稱為pAA114。該構建體含有完整的白細胞毒素基因序列。
1ktA，得自含有完整白細胞基因pAA114的MaeⅠ限制性內切酶片段，用DNA聚合酶的克列諾片段加上核苷酸三磷酸進行處理，并且連接到克隆載體pUC13的SmaⅠ位點中。該質粒命名為pAA179。從該質粒，在用SmaⅠ消化的ptac-基載體pGH432:lacⅠ中制備兩個表達構建體。一個是pAA342，由lktA基因的5’-AhaⅢ片段組成，而另一個pAA345，含有上述完整的MaeⅠ片段?？寺AA342高水平表達截短的白細胞毒素多肽，而pAA345在特別低的水平表達全長白細胞毒素。因此，lktA基因(從pAA345得到的StyⅠ BamHⅠ片段)的3’端連接到StyⅠ BamHⅠ消化的pAA 342上，得到質粒pAA352。此后把由pAA352構建體p.Haemolytica產生的白細胞毒素稱作LKT 352。
然后，質粒pAA352用于制備截短的重組白細胞毒素多肽。該截短的LKT基因是通過從重組LKT基因中缺失大約1300bp長度的內部DNA片段而產生的，方法如下用限制性酶BstB1(New England Biolabs)消化包括LKT 352多肽的質粒pCB113(ATCC登錄號為69749，并在美國專利5837268中作了描述)。然后，用綠豆核酸酶(Pharmacia)消化生成的線性質粒以除去由BstBl消化產生的單條突出末端。接著，用限制性酶Nael(New England Biolabs)消化平頭DNA，并將消化的DNA加樣到1％瓊脂糖凝膠上，通過電泳分離DNA片段。使用基因潔凈試劑盒(gene cleankit)(Bio 101)從瓊脂糖凝膠中分離純化出大約6190bp的較大DNA片段，并且使用噬菌體T4 DNA連接酶(Pharmacia)使純化的片段自身相連接。產生的連接混合物用于轉染感受態(tài)(competent)大腸桿菌JM105細胞，通過其產生具有適宜分子量的聚集蛋白質的能力來鑒定陽性克隆。如此形成的重組質粒是設計的pCB111(ATCC登錄號為69748)，并且產生與四拷貝GnRH多肽融合的截短的白細胞毒素多肽(此后稱之為LKT111)。質粒pCB114具有2次插入的多拷貝GnRH序列(相當于圖2B(SEQID號10和11)的寡聚物)。這兩種質粒均在美國專利5837268中描述過，并且分別產生稱為LKT 111和LKT 114的截短的白細胞毒素多肽。
通過在LKT 114編碼序列的5’末端2次連接多拷貝GnRH序列(相當于圖2B(SEQ ID號10和11)的寡聚物)，由得自pCB114質粒的LKT-GnRH融合序列構建具有兩個8拷貝GnRH多體的重組LKT-GnRH融合分子，一個安排在LKT 114的N’-末端，而另一個安排在LKT 114的C，-末端。將具有如下序列的合成核苷酸序列5’-ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3’(SEQID號6)連接到多拷貝GnRH序列的5’末端。該合成核苷酸序列編碼8個氨基酸序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)(SEQ ID號7)。因此，產生的重組分子按照從5’到3’的方向含有合成的核酸分子；編碼第一個8拷貝GnRH多體的核苷酸序列；編碼截短的LKT肽(LKT 114)的序列；和編碼第二個8拷貝GnRH多體的核苷酸序列。
重組分子成環(huán)形，產生的分子用于轉化感受態(tài)大腸桿菌JM105細胞。通過其產生具有約74kDa分子量的聚集蛋白質的能力來鑒定陽性克隆。如此形成的重組質粒是設計的pCB122，其產生與16拷貝GnRH多肽融合的截短的LKT 114。
對于質粒pCB130，其中ampr基因或pCB122被tetr基因置換。因而，質粒屬于四環(huán)素選擇性。pCB122和pCB130質粒的重組LKT-GnRH融合體的核苷酸序列示于圖3A至3F(SEQ ID號12和13)。
實施例2LKT-抗原融合體的純化使用下述方法純化實施例1制備的重組LKT-GnRH。5～10克隆的轉化的大腸桿菌株接種到10mL含有100μg/mL氨芐青霉素的TB肉湯上清液中，于37℃在220 rpm的G10搖床上培養(yǎng)6小時。4mL培養(yǎng)物加入到2個含有400mL TB肉湯+氨芐青霉素的帶擋板的Fembach搖瓶的每一個瓶中進行稀釋，并如上培養(yǎng)過夜。在500mL容積的聚丙烯瓶中，使用Sorvall GS3轉子，以4000rpm離心10分鐘來收集細胞。用已經預熱到37℃的等體積(即2×400mL)含有氨芐青霉素的TB肉湯重新懸浮沉淀，按照上述條件培養(yǎng)細胞2小時。
在每個培養(yǎng)物中加入500mM異丙基-B,D-硫吡喃半乳糖苷(IPTG,Gibco/BRL)水溶液3.2mL，以誘導重組蛋白的合成。培養(yǎng)物孵育2小時。按照上述方法離心收取細胞，在30mL pH 8.0的50mM Tris-鹽酸、25％(w/v)蔗糖溶液中重新懸浮，并于-70℃冷凍。-70℃60分鐘后室溫下解凍冷凍細胞，并加入5mL溶菌酶(Sigma，在250mM Tris-HCL中20mg/mL,pH8.0)。將混合物高速渦流10秒鐘后，置入冰中15分鐘。接著將細胞加入到盛有500mL溶胞緩沖液的1000mL燒瓶中，用2mL移液管攪拌混合。把盛有溶解的細胞懸浮液的燒瓶放在冰上，用大探頭、設定在100瓦特功率的Braun超聲器總共超聲2.5分鐘(每5-30秒脈沖串之間冷卻1分鐘)。等體積溶液置入特氟隆SS34離心管中，用SS34轉子以10000rpm離心20分鐘。通過高速渦流在總共100mL的無菌雙蒸水中重新懸浮沉淀，重復離心步驟。棄掉上清液，沉淀收集在20mL pH8.0 10mM Tris-HCL、150mM NaCl(Tris-緩沖的生理鹽水)中，-20℃冷凍過夜。
室溫下解凍重組懸浮液，加入到100mL Tris-緩沖鹽水的8M鹽酸胍(Sigma)中，劇烈混合。在瓶中放置磁力攪拌棒，室溫下攪拌混合溶解的樣本30分鐘。溶液轉移至2000mL Erlenmeyer燒瓶中，快速加入1200mLTris-緩沖鹽液。室溫下再攪拌該混合物2小時。500mL等份液置入透析袋中(光譜，直徑63.7mm,6000-8000 MW截止，#132670，購自Fisherscientific)，并把透析袋放入盛有3500mL Tris-緩沖鹽水+0.5M鹽酸胍的4000mL燒瓶中。把燒瓶放在4℃場所中磁棒攪拌過夜，然后，用Tris-緩沖鹽水+0.1M鹽酸胍替換透析緩沖液，繼續(xù)透析12小時。再用Tris-緩沖鹽水+0.05M鹽酸胍替換緩沖液，繼續(xù)透析過夜。接著用Tris-緩沖鹽水(不含鹽酸胍)替換緩沖液，繼續(xù)透析12小時。重復此過程3遍。把最終的溶液傾入2000mL塑料滾筒瓶(Corning)中，加入13mL 100mMPMSF(在乙醇中)以抑制蛋白酶活性。以每份100mL的等份溶液形式貯存在-20℃。
為了確定融合蛋白已被分離出來，用雙蒸水將每份制劑稀釋20倍，與等體積SDS-PAGE樣本緩沖液混合，置入沸水浴中5分鐘，通過12％聚丙酰凝膠。重組白細胞毒素對照物也通過12％聚丙酰凝膠。作為包涵體，融合蛋白高水平表達。
實施例3GnRH給豬免疫后的抗體滴度該試驗是為了評價包括注射體積、第二次注射相對于第一次注射的位點和初次接種注射次數(一次和兩次相比)的變量。為了此次研究，體重3～4kg、28天日齡的160只豬分成8個處理組(見表1)。每組中有10只雌性豬和10只去勢雄性豬。每圍欄中10只豬，由Saskatchewan大學分支機構的試驗基地Prairie Swine Centre,Inc.使用標準操作方法飼養(yǎng)，，并得到加拿大動物保護委員會檢驗。
對于1～7組，GnRH疫苗是按照上述方法使用來自質粒pCB122的GnRH免疫原制備的。特別是，GnRH免疫原在8 M尿素中溶解為20mg/mL濃度。配制疫苗的佐劑是VSA-3，它是包含DDA的EMULSIGENPLUSTM的一種改良形式(參見，序號為08/463837的美國專利申請)。
通過將GnRH免疫原的貯存原液與磷酸緩沖鹽水合并并且以1∶1(v/v)的比值與VSA-3混合形成穩(wěn)定的乳液來制備GnRH疫苗。1、2、3、4和6組的GnRH免疫原的劑量為40μg，然而一些制劑的體積不同。表1給出每個處理組的詳細情況。5組和7組的GnRH疫苗每0.25mL含有30μg GnRH免疫原，而8組接受在0.4mL佐劑中的40μg GnRH免疫原，所述GnRH免疫原得自質粒pCB130。在所有情況下，VSA-3佐劑與水相(磷酸緩沖鹽水)的比值保持1∶1(v/v)。通過改變貯存免疫原溶液的體積進行調整。

*L和R指左耳和石耳**該體積是對每個耳朵給藥的體積。因此，5、6和7組在初次注射時接受的總量分別為0.5、0.3和0.5mL。
所有的疫苗是使用美國在波蘭俄勒岡的Bioject公司生產的Biojector2000型無針注射裝置給藥的。該裝置使用氣體圓筒在高壓下通過一個小的開口進行疫苗注射。疫苗穿透皮膚并沉積在皮下。對于每個處理組來說，首次注射在豬28天日齡時進行，第二次注射在35天之后進行。
所有注射位點是耳朵的耳廓外表皮，除第7組第2次注射之外，后者的注射位點是距頭后部10-15cm的背側中線上。于試驗第35、49和63天(相對于試驗開始(0天)計)經頸靜脈靜脈穿刺采集血液。血液在室溫下凝結，收集血清，將血清貯存于-20℃直至分析GnRH抗體滴度時。
使用改良的放免分析法測定GnRH抗體滴度。用I125(Amersham,Oakville,Ontario)標記合成的GnRH(Bachem,Inc.)。把稀釋血清加入到試驗試管中，接著加入標準量的I125標記的GnRH，使孵育物終體積為0.7mL。于2-6℃孵育24小時結束時加入在分析緩沖液中的木炭懸浮液，以吸收非-抗體結合的I125-GnRH。離心后，測定木炭部分的放射活性。數據以標準劑量(大約12000cpm)的I125-GnRH與特定血清稀釋液中抗體結合的百分數值表示。
描述性統(tǒng)計，使用1996年出版的第1版《學生版統(tǒng)計學》(StudentVersion of Statistix)進行變量分析和“t”檢驗。
在1、2組中分別評價了單個注射位點給藥0.15、0.25和0.35ml的情況。

圖1顯示實驗第35天(動物63日齡)加強接種前的抗體滴度與加強注射后14天也即實驗第49天(動物77日齡)時抗體滴度之間的關系。在35天時稀釋度為1∶5000時滴度高于10％結合的動物較那些對初次接種具有弱的反應的動物能夠對加強接種產生更大的反應?；谄渌囼?，我們知道了在1∶5000稀釋度時大約20％的結合將部分抑制睪酮分泌。
這些結果表明對初次免疫強烈反應的利用對生長或飼料利用效率無影響。
實施例4GnRH免疫對睪酮水平的影響下面的試驗利用免疫研究來證明對青春期前動物的睪酮濃度沒有影響。60只完整無傷豬分成3個處理組。1組動物在出生時進行手術去勢，2組和3組保持完整無傷。大約21天日齡時，給3組動物用含有連接在含38-378個氨基酸的內部有缺失的白細胞毒素和815-951個氨基酸的天然白細胞毒素上的8拷貝GnRH免疫原進行免疫。該免疫原用VSA-3佐劑如上述配制。免疫導致抗體產生增加足以引起可檢測得到的睪酮分泌降低。整個試驗中2組動物保持完整無傷并且不被免疫。
前面的研究證明用佐劑免疫的動物其GnRH抗體滴度中度、持續(xù)增加，從而降低睪酮濃度，但是降低的濃度仍在可測得到的水平。試驗期間測定了食物消耗和尸體(carcass)成分，以比較在不同年齡時的各種參數。
一直到大約90天日齡時，用GnRH疫苗處理(免疫去勢)的動物與去勢的雄性動物(barrows)和未去勢雄性動物(公豬)相似。而且，所有3組動物具有相似的體重增加。見圖4。
實施例5用GnRH疫苗免疫去勢性成熟豬該研究目的是測定GnRH疫苗是否將性成熟豬的血清睪酮和脂肪雄甾烯酮濃度降低至與手術去勢豬中的同等水平，并且測定初次免疫和第二次免疫后GnRH抗體反應動力學、血清睪酮濃度和脂肪雄甾烯酮水平。
按照表2在試驗0天之前將24只完整無傷的雄性豬隨機分成3個處理組(組1、2和3)。把小于1周齡時被手術去勢的6只日齡-和litter匹配的豬分配為第4組(組4一早期去勢)。以每圍欄10只動物飼養(yǎng)至體重大約60kg，此時按每圍欄2只動物進行飼養(yǎng)。豬自由進食和水，使用Saskatchewan大學的分支機構動物試驗基地Prairie Swine Centre記載的標準操作方法飼養(yǎng)，并得到了加拿大動物保護委員會的檢驗。
GnRH疫苗是使用來自質粒pCB122的GnRH免疫原，在4M鹽酸胍中溶解為28mg/mL濃度而制備的。配制GnRH疫苗的佐劑是VSA-3。通過將GnRH免疫原的貯存原液與磷酸緩沖鹽水合并并且以1∶1(v/v)的比值與VSA-3混合形成穩(wěn)定的乳液來制備GnRH疫苗。每0.5ml含有40μg GnRH免疫原的疫苗經IM給藥。安慰劑含有磷酸緩沖鹽水和VSA-3佐劑。
給豬在頸部IM注射疫苗或者安慰劑2次。首次注射在試驗0天時進行，此時豬的日齡為21天。第二次注射在豬接近性成熟時進行，此時豬的體重約100kg(110天-120天)(見表2)。2組(遲去勢)動物在達到性成熟時進行手術去勢，性成熟在很大程度上受體重的影響，性成熟出現在大約110kg體重時(115～125天)。在對2組的動物實施手術去勢前約一周時，1組動物接受第二次免疫。這樣做的目的是使第二次免疫產生的GnRH抗體滴度在大致相同的時間達到2組手術去勢動物GnRH抗體滴度的生物活性水平。

為了使數據分析簡單化和具有代表性，120天指“事件”的時間，即當動物接受第二次注射(所有組)或者接受手術去勢(組2)時的時間?！笆录焙蟛杉乃袛祿鄬τ凇笆录眮砻枋?，即“事件”后7天是指127天，“事件”后14天指134天等。
在28天與120天的期間，按照約28天的間隔經頸靜脈穿刺采集所有豬的血液樣本。此后，以1周的間隔采集所有豬的血液，直至在試驗第162天(“事件”后42天)時處死動物。血液在室溫下凝結，離心得到血清并在24小時內冷凍血清。
從0天至“事件”期間每個月測量所有動物中每一只動物的體重增加情況，“事件”后每周測量體重直到動物被屠宰。
檢測雄甾烯酮所用的皮下脂肪樣本(大約5g)是這樣獲取的在“事件”的時間和以每周的間隔直至動物被屠宰(162天)的期間內，在局部麻醉下，從所有豬的頸部兩側交替取出脂肪組織。立即冷凍脂肪標本并且在活組織檢查后4小時內冷凍。
屠宰時測量指標包括尸體(carcass)重量、在第10肋水平背部脂肪的厚度、睪丸重量和球-尿道腺的長度。
使用改良的放免分析法測定GnRH抗體滴度。用I125(Amersham,Oakville,Ontario)標記合成的GnRH(Bachem,Inc.)。把稀釋血清加入到試驗試管中，接著加入標準量的I125標記的GnRH，使孵育物終體積為0.7mL。于2-6℃孵育24小時結束時加入在分析緩沖液中的木炭懸浮液，以吸收非-抗體結合的I125-GnRH。離心后，測定木炭部分的放射活性。數據以標準劑量(大約12000cpm)的I125-GnRH與特定血清稀釋液中抗體結合的百分數值表示。
使用Coat-A-Count總睪酮試劑盒(DPS，洛杉磯，CA)測定血清睪酮。此試驗是建立在I125-睪酮和對睪酮具有高特異性的抗體的基礎上的。
使用比色法測定脂肪雄甾烯酮的濃度。
初次測量結果包括GnRH抗體滴度，它是在1組血清稀釋度為1∶5000時，和2、3、4組稀釋度為1∶100時測得的結合百分率。也測定血清睪酮濃度、脂肪雄甾烯酮、體重、背部脂肪、睪丸重量和球尿道長度。
初次免疫后，在血清稀釋度為1∶100時1組中所有豬產生的GnRH抗體滴度很容易被檢測到(見表3)。另外，在21天和約140天日齡時免疫的豬產生的GnRH抗體滴度對血清睪酮和脂肪雄甾烯酮濃度的降低程度與早期和晚期去勢豬中的血清睪酮和脂肪雄甾烯酮濃度相當。與完整無傷雄性豬相比，免疫去勢豬的睪丸和球尿道腺的大小也見明顯減小。

實施例6公牛的GnRH免疫用58頭青春期前的公牛仔進行試驗。Ⅰ組的28頭公牛仔皮下接種疫苗組合物2次(0天和56天)，所述疫苗組合物含有在佐劑VSA-3中的得自質粒pCB122的GnRH免疫原200μg，對2組的30頭對照公牛接種安慰劑。Ⅰ組的接種，到42天時產生顯著的抗GnRH滴度，到84天時陰囊周長明顯減小，到98天時睪酮水平顯著降低(表4)。盡管有顯著的抗-GnRH滴度和睪酮水平下降，但是，在0天～84天的期間內，動物每日體重增加或者飼料利用效率未見差異(表5)。

*在血清稀釋度為1∶1000時測得的GnRH-I125結合百分比。在用GnRH免疫的組和對照組之間進行統(tǒng)計學比較。不同上標(a對b)的值不同(p＜0.5)。

這些新發(fā)現表明利用GnRH疫苗是非常重要的，所述GnRH疫苗在初次免疫后產生足夠強的免疫反應，產生的抗體滴度能夠使血清睪酮發(fā)生可檢測得到的下降而不會顯著減慢生長或降低飼料利用效率。這些發(fā)現特別具有新穎性，因為這些發(fā)現顯示在生長早期短暫抑制雄性激素分泌并不抑制機體生長或者飼料利用效率。當使用疫苗方案時特別具有實用性，所述方案需要在生命后期繼續(xù)免疫以達到強的繼發(fā)反應的目的。
菌株保藏物在本發(fā)明實踐中的應用下列菌株的生物純培養(yǎng)物保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801 Univercity Boulevard,Manassas,V.A。標明的登錄號是在成功地進行了活性檢測和交付了所需的費用后才給出的。保藏是根據國際承認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的條款和其規(guī)則(布達佩斯條約)而進行的。這確保自保藏日起30年(30)期限內和在保藏中心最近一次請求提供保藏物后至少5年(5)保持培養(yǎng)物的活性。根據布達佩斯條約的規(guī)定，可以由ATCC得到微生物，條約確保根據35 U.S.C.§122授權的U.S.專利和商標委員和委員會細則(包括37 C.F.R.§1.12)決定的個體對培養(yǎng)物的永久性和不受限制的可利用性。授予專利后，對于公眾得到保藏培養(yǎng)物的所有限制將永久性取消。
這些保藏是為了方便本領域技術人員而進行的，不是35 U.S.C.§112所需求的保藏。這些質粒的核苷酸序列以及它們編碼的多肽的氨基酸序列在此引入參考，并且如果與本說明書中的描述有出入的話，以此為準。制造、使用或者銷售保藏的材料需要許可證，這里不授權這樣的許可。菌株號 保藏日期ATCCpAA352在大腸桿菌W1485中1990.3.30 68283pAA113在大腸桿菌JM105中1995.2.169749pAA111在大腸桿菌JM105中1995.2.169748因此，公開了免疫抗GnRH的方法。盡管本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在某些細節(jié)上作了描述，但是應當懂得，可以進行不背離本發(fā)明權利要求限定的實質和范圍的顯而易見的變更。
序列表<110>生物星公司<120>提高動物肉產量的方法<130>08-883393WO<140>PCT/CA99/00360<141>1999-05-05<150>uS 60/084,217<151>1998-05-05<160>14<170>patentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>xaa是焦谷氨酸<400>1Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro G1y1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>xaa是Gly或D-氨基酸<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>Xaa是一個或多個相同或不同的氨基酸殘基，優(yōu)選1-3個Gly殘基<220><221>MOD_RES<222>(12)<223>xaa是Cys或Tyr<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa是焦谷氨酸<400>2Xaa His Trp Ser Tyr Xaa Leu Arg Pro Gly Xaa Xaa1 5 10<210>3<211>17<212>PRT<213>GnRH<400>3Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro1 5 10 15Gly<210>4<211>17<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa<400>4Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Ser Pro Pro Pro Pro1 5 10 15Cys<210>5<211>16<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa是焦谷氨酸<400>5Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Arg Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10 15<210>6<211>24<212>DNA合成構建體<213><400>6atggctactg ttatagatcg atct 24<210>7<211>8<212>PRT<213>GnRH<400>7Met Ala Thr Val Ile Asp Arg Ser1 5<210>8<211>30<212>DNA<213>GnRH<220><221>CDS<222>(1)..(30)<400>8cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc30Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>GnRH<400>9Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10<210>10<211>147<212>DNA<213>GnRH<220><221>CDS<222>(1)..(147)<400>10cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc agc ggt tct caa gat tgg 48Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp1 5 10 15agc tac ggc ctg cgt ccg ggt ggc tct agc cag cat tgg agc tac ggc 96Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly20 25 30ctg cgc cct ggc agc ggt agc caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg 144Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro35 40 45ggt 147Gly<210>11<211>49<212>PRT<213>GnRH<400>11Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu.Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp1 5 10 15Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly20 25 30Leu Arg Pro Gly Ser Gly 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1．第一和第二GnRH免疫原在制備提高未去勢雄性產食動物肉產量方法中應用的第一和第二疫苗組合物中的應用，所述方法包括在所述動物的肥育期前或肥育期用所述第一疫苗組合物接種所述動物以降低循環(huán)睪酮的水平，和在屠宰動物前約2～約8周用所述第二疫苗組合物接種所述動物以顯著降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇的水平。
2．權利要求1所述的應用，其中所述第一疫苗組合物在所述動物出生到約10周齡的期間施用。
3．權利要求1所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物進一步包括免疫佐劑。
4．權利要求3所述的應用，其中所述第一和/或第二疫苗組合物中的佐劑包括油和二甲基二-十八烷基溴化銨。
5．權利要求3所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物中的GnRH免疫原是相同的。
6．權利要求3所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物中的GnRH免疫原是不同的。
7．權利要求1所述的應用，其中第一疫苗組合物的施用導致與所述動物內源性GnRH發(fā)生交叉反應的抗體產生，和在抗體水平已經下降后施用第二疫苗組合物。
8．權利要求3所述的應用，其中在所述第一和/或第二疫苗組合物中的GnRH免疫原是含有通式為(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多體，其中GnRH是GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔基團、載體分子和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數。
9．權利要求8所述的應用，其中載體分子是白細胞毒素多肽。
10．權利要求1所述的應用，其中所述GnRH免疫原是核酸分子。
11．權利要求1所述的應用，其中所述第二疫苗組合物在屠宰動物前約4～約6周施用。
12．權利要求11所述的應用，其中在所述第二疫苗組合物中的免疫佐劑是含水佐劑。
13．第一和第二GnRH免疫原在制備提高未去勢雄性牛、羊或豬肉產量的方法中應用的第一和第二疫苗組合物中的應用，所述方法包括在所述動物的肥育期前或肥育期用所述第一疫苗組合物接種所述動物以降低循環(huán)睪酮的水平，和在屠宰動物前約2～約8周用所述第二疫苗組合物接種所述動物以顯著降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇的水平。
14．權利要求13所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物進一步包括免疫佐劑。
15．權利要求14所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物中的GnRH免疫原是相同的。
16．權利要求14所述的應用，其中第一和第二疫苗組合物中的GnRH免疫原是不同的。
17．權利要求13所述的應用，其中在所述第一和/或第二疫苗組合物中的所述GnRH免疫原是含有通式為(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多體，其中GnRH是GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔基團、載體分子和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數。
18．權利要求17所述的應用，其中載體分子是白細胞毒素多肽。
19．權利要求13所述的應用，其中所述第二疫苗組合物在屠宰動物前約4～約6周施用。
20．第一和第二GnRH多體在制備提高未去勢雄性牛、羊或豬肉產量的方法中應用的第一和第二疫苗組合物中的應用，所述第一和第二疫苗組合物包括佐劑，所述第一和第二GnRH多體含有通式(GnRH-X-GnRH)y，通式中GnRH為GnRH免疫原；X是選自肽鍵、氨基酸間隔基團、白細胞毒素多肽和[GnRH]n的一個或多個分子，其中n是大于或者等于1的整數；和y是大于或者等于1的整數，其中所述第一疫苗組合物在動物肥育期前或肥育期施用以降低循環(huán)中的睪酮水平，和所述第二疫苗組合物在屠宰動物前約2～約8周施用以顯著降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇的水平。
21．權利要求20所述的應用，其中所述第一和第二疫苗組合物含有相同的GnRH多體。
22．權利要求20所述的應用，其中所述第一和第二疫苗組合物中的所述GnRH多體含有圖3A-3F(SEQ ID號12和13)描繪的氨基酸序列，或者與其序列具有至少約75％序列同源性的氨基酸序列。
23．權利要求22所述的應用，其中所述GnRH多體含有圖3A-3F(SEQID號12和13)描繪的氨基酸序列。
24．權利要求20所述的應用，其中第二疫苗組合物在屠宰動物前約4～約6周施用。
25．第一和第二GnRH多體在制備提高未去勢雄性牛、羊或豬肉產量的方法中應用的第一和第二疫苗組合物中的應用，所述第一和第二疫苗組合物包括佐劑，所述第一和第二GnRH多體含有圖3A-3F(SEQ ID號12和13)描繪的氨基酸序列，或者與其序列具有至少約75％序列同源性的氨基酸序列，其中所述第一疫苗組合物在動物肥育期前或肥育期施用以降低循環(huán)中的睪酮水平，和所述第二疫苗組合物在屠宰動物前約2～約8周施用以顯著降低一種或多種雄性和/或非雄性類固醇的水平。
26．權利要求25所述的應用，其中所述第一和第二疫苗組合物中的所述GnRH多體含有圖3A-3F(SEQID號12和13)描繪的氨基酸序列。
27．權利要求25所述的應用，其中第二疫苗組合物在屠宰動物前約4～約6周施用。
28．權利要求25所述的應用，其中所述第一和/或第二疫苗組合物中的免疫佐劑含有輕礦物油和二甲基二-十八烷基溴化銨。
全文摘要
公開了提高雄性動物肉產量的方法。方法使用含有GnRH免疫原的組合物。方法適用于生產具有改善的感官質量的肉塊。
文檔編號A61P43/00GK1310628SQ99808301
公開日2001年8月29日 申請日期1999年5月5日 優(yōu)先權日1998年5月5日
發(fā)明者杰克·G·曼斯, 斯蒂芬·D·阿克爾, 理查德·阿蘭 申請人:生物星公司