專(zhuān)利名稱(chēng)：一種治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的療效來(lái)自其原料所含的各種有效成分，這些有效成分已為西方尖端醫(yī)學(xué)、生理學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)，下面就本藥物中的各種有效成分作詳細(xì)說(shuō)明。
1神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)的生理和保健作用神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化過(guò)程有三個(gè)階段，先是由特定神經(jīng)母細(xì)胞分裂增殖，然后向特定部移行、伸展，最后形成互相聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。NGF在促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)，形成突觸網(wǎng)絡(luò)這三個(gè)階段中都發(fā)揮著重要作用。NGF對(duì)交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)元的生存和生長(zhǎng)是不可缺少的。給發(fā)育期動(dòng)物注射抗NGF血清，除去體內(nèi)天然的NGF后，動(dòng)物的交感神經(jīng)鏈便不發(fā)育。實(shí)驗(yàn)證明，NGF能促進(jìn)多胺合成酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)活性增強(qiáng)，交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在發(fā)生期對(duì)這類(lèi)酶的依賴(lài)性很強(qiáng)，越是幼稚期對(duì)酶的促進(jìn)作用越強(qiáng)。攝入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的NGF能加速神經(jīng)遞質(zhì)的合成。在交感神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)能增加酪氨酸羥化酶活性，使兒茶酚胺類(lèi)遞質(zhì)合成加快。這一過(guò)程并非通過(guò)第二信使cAMP起作用，而是酶蛋白合成增加。NGF也能促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元P物質(zhì)的合成。
2腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可從豬等哺乳動(dòng)物腦中分離出來(lái)，是一種堿性蛋白，等電點(diǎn)10，分子量12.3kD。腦內(nèi)主要分布在海馬部位，每克豬腦能提取BDNF5ng。BDNF的生理和保健作用；能促進(jìn)胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活，對(duì)脊髓背根節(jié)細(xì)胞和顱神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)元也有營(yíng)養(yǎng)作用，促進(jìn)其軸突生長(zhǎng)，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)的存活時(shí)間。
3神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)是NGF家族中的第三成員，又稱(chēng)NGF-2或海馬衍生NTF。成熟NT-3是119個(gè)氨基酸組成的多肽，等電點(diǎn)9.5。NT-3能促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)和延長(zhǎng)存活時(shí)間，能加速結(jié)狀節(jié)和交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)。
4成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在子(fibroblast growth factor,FGF).FGF是一種蛋白分裂原，在這一家族中已先后發(fā)現(xiàn)有7種結(jié)構(gòu)相似的生長(zhǎng)因子，其中FGF-1和FGF-2(或稱(chēng)aFGF和bFGF)這兩種因子的受體，與神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切。FGF能刺激大多數(shù)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的分裂增殖，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨骼肌細(xì)胞、晶體上皮細(xì)胞、虹膜細(xì)胞等。在早期胚胎發(fā)育期，F(xiàn)GF能誘導(dǎo)中胚層的形成，使一些胚胎細(xì)胞向著中胚層細(xì)胞模式分化。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF是具有明顯神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。小量FGF-2就能使培養(yǎng)中的海馬神經(jīng)細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，突起增多。FGF-2對(duì)許多中樞神經(jīng)元都有這種類(lèi)似的作用。FGF-1對(duì)維持視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的生存明顯高于FGF-2。FGF-2可增加膽堿能中隔神經(jīng)細(xì)胞的存活，挽救受到損傷的神經(jīng)元。FGF-2對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞也具有營(yíng)養(yǎng)活性；能促進(jìn)肉芽組織(主要是小血管和纖維細(xì)胞)新生，加速創(chuàng)口的愈合。
5上皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)是由53個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽。分子量6045，等電點(diǎn)4.6，耐熱，100℃水中30分鐘仍不失活。人EGF(hEGF)與小鼠EGF(mEGF)結(jié)構(gòu)很相似，在53個(gè)氨基酸中37個(gè)相同，雙硫鍵的位置也相同。EGF的作用主要是刺激皮膚和中胚層細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)乳腺上皮細(xì)胞、皮纖維細(xì)胞、呼吸道與胃腸道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及卵巢顆粒細(xì)胞等均有促生長(zhǎng)和增殖活性。EGF能增加神經(jīng)細(xì)胞的存活時(shí)間，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，加速膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。在EGF的作用下，K+和葡萄糖等小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)速度加快，并加速糖的分解，使乳酸增加。EGF還能促進(jìn)RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成。
6、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)。Ach對(duì)神經(jīng)組織的生物效應(yīng)相當(dāng)廣泛，包括對(duì)神經(jīng)——肌肉的接頭處、自主神經(jīng)節(jié)、膽堿能神經(jīng)元和神經(jīng)元通路(外圍及中樞)都有廣泛的生物效應(yīng)。由于膽堿能神經(jīng)元在中樞分布很廣，有證實(shí)的是上行網(wǎng)狀系統(tǒng)、邊緣系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、感覺(jué)系統(tǒng)等，Ach效應(yīng)有的是興奮性，有的是抑制性，一般說(shuō)以興奮性為主，此外Ach對(duì)攝食、飲水、體溫、血壓等調(diào)節(jié)中樞都有特定的效應(yīng)，具體的生物效應(yīng)，有以下幾方面①促進(jìn)磷酯酸及磷脂酰肌醇類(lèi)的合成。②促進(jìn)生物胺的釋放；Ach促進(jìn)嗜鉻細(xì)胞釋放兒茶酚胺，促使肥大細(xì)胞釋放組胺。③促進(jìn)神經(jīng)組織釋放硫胺近年發(fā)現(xiàn)，Ach灌注神經(jīng)組織試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)硫胺類(lèi)物質(zhì)的釋放。臨床上已證實(shí)Ach對(duì)治療老年性癡呆癥有療效，能改善患者的記憶力和認(rèn)知能力。
7、組胺(histamine,HA)，它的療效除了具有擴(kuò)張血管增加毛細(xì)血管通透性外，還有①邊緣系統(tǒng)的功能組胺能神經(jīng)元投射至許多邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如海馬、杏仁核、伏隔核等結(jié)構(gòu)，因而以為其與情感的控制，記憶功能和植物性功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。②對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用可引起逆向性的血管擴(kuò)張和軸索反射，與周?chē)窠?jīng)感覺(jué)的起始和傳遞有關(guān)。
8、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide-,CGRP)、CGRP前體由128個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為16KD，含有一個(gè)與CT前體相同的76個(gè)氨基酸的N端序列。CGRP有強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用，使腦血流量明顯增加。
9、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)。NPY可增加交感神經(jīng)支配的平滑肌對(duì)去甲腎上腺素的敏感性，可降低血壓、減慢心率。
11環(huán)核苷酸。它是重要的細(xì)胞內(nèi)信使；在許多細(xì)胞系統(tǒng)中，細(xì)胞對(duì)各種調(diào)節(jié)訊號(hào)的應(yīng)答是由3＇,5＇一環(huán)腺苷酸(cAMP)介導(dǎo)的。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)遞質(zhì)、激素和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞cAMP含量或(和)3＇,5＇一環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)有重要的調(diào)節(jié)作用，cAMP和cGMP是介導(dǎo)一些神經(jīng)活動(dòng)的細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)作用，cAMP和cGMP是介導(dǎo)一些神經(jīng)活動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)信使。鳥(niǎo)苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G蛋白)在受體信號(hào)的跨膜傳遞中起重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，許多效應(yīng)蛋白質(zhì)，如腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2和磷酸二酯酶等的活性受G蛋白的調(diào)節(jié)。在信息的跨膜傳遞中，G蛋白是聯(lián)系受體和效應(yīng)蛋白質(zhì)的“中繼站”。
12、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)節(jié)苷脂具有許多重要的功能。它是膜相關(guān)活性物質(zhì)，特別濃集于神經(jīng)元的突觸部位。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的各個(gè)階段，隨著細(xì)胞分化，突觸建立和髓鞘形成，神經(jīng)節(jié)苷脂的含量和成分往往發(fā)生特殊的變化。神經(jīng)節(jié)苷脂參與神經(jīng)系統(tǒng)與環(huán)境的相互作用和信息傳遞過(guò)程，也與神經(jīng)的可塑性以及學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)活動(dòng)有關(guān)。此外，神經(jīng)節(jié)苷脂還具有促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的再生作用。
13、利鈉多肽家族包括心鈉素、腦鈉素、C型利鈉肽，具有利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓的作用。
上述多肽類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在制備中經(jīng)控制性酶解，如用CNBr處理后的蛋白酶消化NGF，在得到的11個(gè)多肽中，由雙硫鍵結(jié)合的10-25肽和75-88肽具有100倍的NGF活性，這些小肽鏈能通過(guò)血腦屏障，作用于大腦。或者用胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶(thermoly-sin)消化得到三個(gè)小肽鏈。以上為注射用凍干粉劑和注射劑，至于口服制劑如膠囊劑，片劑、滴丸劑等，無(wú)需經(jīng)基因工程蛋白酶控制性酶解，而是空腹服用，同時(shí)喝入300-500毫升白開(kāi)水，使藥物在胃內(nèi)酶解的時(shí)間較短，是一種自然控制性酶解，使進(jìn)入小腸的藥物中多肽類(lèi)成分，分解成有活性的小肽鏈，這些小肽鏈能通過(guò)血腦屏障。
試驗(yàn)中選擇89例老年性癡呆癥患者，每天注射本藥物5μg，對(duì)照組55例，每天服用安慰劑。經(jīng)4個(gè)月試驗(yàn)，結(jié)果本藥物有效率81％。試驗(yàn)組患者病情轉(zhuǎn)好，表現(xiàn)為記憶增強(qiáng)，定向力障礙減輕，CT檢查大腦皮層停止萎縮。
試驗(yàn)中選擇50例帕金森病患者，每天注射本藥物5μg；對(duì)照組50例每天服用安慰劑。經(jīng)4個(gè)月試驗(yàn)，結(jié)果本藥物有效率74％，試驗(yàn)組患者的病情減輕，如震顫減少，或從packinson癡呆漸具語(yǔ)言、思維能力。
本藥物用于腦血管病的預(yù)防和治療。
試驗(yàn)中在腦血管病高危人群中選擇100人，其中50人列為試驗(yàn)組，每天注射本藥物3μg；對(duì)照組50人每天服用安慰劑，經(jīng)4個(gè)月試驗(yàn)，試驗(yàn)組無(wú)1例發(fā)生出血性或缺血性腦血管病，對(duì)照組中有2例發(fā)?。辉囼?yàn)后一年內(nèi)，試驗(yàn)組無(wú)1例發(fā)病，對(duì)照組有7例發(fā)病。
試驗(yàn)中選擇64例腦血管病患者，其中試驗(yàn)Ⅰ組30例為出血性腦血管病患者，試驗(yàn)Ⅱ組34例為缺血性腦血管病患者，Ⅰ組患者每天注射本藥物5μg和需時(shí)用高滲性脫水劑(20％甘露醇、甘油鹽水)或利尿藥。Ⅱ組患者每天注射本藥物4μg和需時(shí)用腦嗌嗪。對(duì)照組50例腦血管病患者，其中對(duì)照Ⅰ組25例為出血性腦血管病患者，每天服用安慰劑和需時(shí)用高滲性脫水劑和利尿劑，對(duì)照Ⅱ組25例為缺血性腦血管病患者，每天服用安慰劑和腦嗌嗪。經(jīng)6個(gè)月試驗(yàn)，結(jié)果顯示本藥物對(duì)出血性腦血管病有效率為68％，對(duì)缺血性腦血管病有效率為76％。
試驗(yàn)中選擇100例冠心病患者，每天注射本藥物5μg和需時(shí)用硝酸甘油；對(duì)照組80例，每天服用安慰劑和需時(shí)用硝酸甘油；經(jīng)5個(gè)月試驗(yàn)，試驗(yàn)組患者心絞痛或心肌梗塞發(fā)生次數(shù)比試驗(yàn)前減少85％，對(duì)照組未見(jiàn)減少。
試驗(yàn)中選擇90例高血壓患者，每天注射本藥物4μg和服用異搏定(維拉帕米verapamil)，試驗(yàn)前試驗(yàn)組患者平均血壓SBP179mmHg和DBP109mmHg；對(duì)照組90例，每天服用安慰劑和異搏定。經(jīng)6個(gè)月試驗(yàn)，結(jié)果顯示本藥物有效率92％，試驗(yàn)組患者平均血壓SBP136mmHg,DBP93mmHg。對(duì)照組平均血壓比試驗(yàn)前只降低3-5mmHg。
試驗(yàn)中選擇70例動(dòng)脈粥樣硬化患者，每天注射本藥物3μg，對(duì)照組70例，每天服用安慰劑，經(jīng)6個(gè)月試驗(yàn)，結(jié)果顯示本藥物有效率87％。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
本發(fā)明是以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4(NT-4)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5(NT-5)，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)，乙酰膽堿(Ach)，組胺(HA)，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)，神經(jīng)肽Y(NPY)，環(huán)核苷酸(cAMP)，心鈉素(atrialnatriuretic peptide.ANP)，腦鈉素(brain natriuretic peptide-.BNP),C型利鈉肽(c-type Natriuetic peptide.CNP)，前列環(huán)素(PGI2)，內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(EDRF)為原料，上述原料可單獨(dú)或混合制成治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化的藥劑。上述原料都可從動(dòng)物器官中提取，或用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)，原料的制取為現(xiàn)有技術(shù)，以下是用基因工程技術(shù)制取原料的幾個(gè)實(shí)例A、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。
一、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)hEGF的基因定位于人第4號(hào)染色體的q24～q26帶。hEGF是53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，分子量約6200；等電點(diǎn)為4.7；分子內(nèi)不帶糖基，N端為天冬酰胺，C端為精氨酸；有三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分布在Cys6-Cys20,Cys14-Cys31以及Cys33-Cys12之間，在分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成三個(gè)二硫化物環(huán)，對(duì)維持其生物活性所需的穩(wěn)定空間構(gòu)型十分重要。
hEGF具有熱隱定性；容易放蛋白酶水解；它的三個(gè)二硫鍵難以正確配對(duì)，錯(cuò)配后，造成蛋白質(zhì)分子重折疊而使生物活性降低或消失。因此，利用工程菌表達(dá)hEGF，保持這三個(gè)二硫鍵的正確性至關(guān)重要。通常采用分泌型表達(dá)有利于形成正確的空間結(jié)構(gòu)。
二、生產(chǎn)工藝hEGF的成熟肽不含糖基化位點(diǎn)，活性與糖基無(wú)關(guān)，故適于在E.coli中表達(dá)。國(guó)內(nèi)外已有多家實(shí)驗(yàn)室和公司在E.coli中成功表達(dá)了hEGF，所采用的啟動(dòng)子包括Ecoli堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子(phoA)，外膜蛋白啟動(dòng)子(omp),Trp啟動(dòng)子和pk啟動(dòng)子等。由于hEGF是小分子多肽，在細(xì)菌細(xì)胞中不易形成包涵體，且在胞內(nèi)聚集會(huì)招致蛋白酶攻擊而降解。因此，表達(dá)的最佳策略是采用分泌型表達(dá)。目前最成功的是采用E.coli堿性磷酸酯酶基因(phoA)啟動(dòng)子和信號(hào)肽的分泌型表達(dá)。E.coli phoA啟動(dòng)子受phoA,phoM和phoR基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，在低磷酸鹽條件下被誘導(dǎo)合成大量堿性磷酸酯酶(APase)。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，Apase是以帶有信號(hào)肽的前體合成，然后由信號(hào)肽介導(dǎo)成熟的APase穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入周質(zhì)。如果將真核蛋白基因與phoA信號(hào)肽基因連接，二者之間不保留任何多余氨基酸，phoA信號(hào)肽就會(huì)得到加工，并將真核成熟肽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌膜外周質(zhì)中。表達(dá)的外源蛋白可用滲透休克的方法純化而無(wú)需破裂細(xì)菌。
首次構(gòu)建了編碼phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽的分泌型載體。其中之一是pTA1529。這個(gè)載體在phoA信號(hào)肽的3＇端有單一HindⅢ限制酶切點(diǎn)，可以容易地在這個(gè)位置插入外源結(jié)構(gòu)基因，phoA信號(hào)肽和插入體之間無(wú)任何堿基插入或缺失。用HindⅢ切開(kāi)pTA1529 DNA，用T4DNA聚合酶修復(fù)粘性末端，并用SalⅠ限制酶消化，回收SalⅠ-HindⅢ大片段。以同樣方式從克隆質(zhì)粒載體pTA1002中切出人工合成的hEGF結(jié)構(gòu)基因，用T4DNA連接酶使之與pTA1529的SalⅠ-HindⅢ片段連接，構(gòu)建成hEGF分泌型表達(dá)載體pTA1522。用pTA1522轉(zhuǎn)化E.coli APase缺失突變株YK537，轉(zhuǎn)化菌株于低磷酸鹽條件下，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)9h，收集菌體，滲透休克處理，凍干。產(chǎn)物經(jīng)SephadexG-50柱凝膠過(guò)濾，收集hEGF洗脫峰，凍干，干物質(zhì)溶于水中，再經(jīng)μbond pakc18柱層析，可得高純度的重組hEGF，產(chǎn)量為2413μg/L培養(yǎng)物，或每個(gè)細(xì)胞1.8×105分子。
由于Apase和表達(dá)的hEGF的分泌使用相同的信號(hào)肽，所以E.coli內(nèi)源APase可能會(huì)與hEGF的分泌發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，抑制hEGF的分泌。使用Apase缺陷株YK537可避免這個(gè)問(wèn)題的出現(xiàn)，使重組hEGF的回收量比在非APase缺陷株(如C600等)中提高5倍。另外試驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃誘導(dǎo)9h比在37℃誘導(dǎo)6h產(chǎn)量提高2倍。
國(guó)內(nèi)重組hEGF的生產(chǎn)亦采用類(lèi)似的工藝路線。人工合成的hEGF結(jié)構(gòu)基因由6個(gè)合成片段組成，共159個(gè)堿基對(duì)，在基因5＇端添加EcoRⅠ切點(diǎn)，3＇端添加。HindⅢ切點(diǎn)。將合成的hEGF基因與多拷貝質(zhì)粒pI218R同樣用EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切，并重組連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM103菌株，分析篩選出重組質(zhì)粒pEG14。利用合成的E.coli phoA基因啟動(dòng)子、信號(hào)肽編碼序列和上述hEGF基因構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p-AE-8。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YK537，篩選出hEGF表達(dá)最高的菌株EE-86做為工程菌株。將工程菌株37℃發(fā)酵培養(yǎng)，使細(xì)菌生長(zhǎng)至A660nm=1以上，在含低濃度磷酸鹽培養(yǎng)基中開(kāi)始誘導(dǎo)其高效表達(dá)。誘導(dǎo)10h后，表達(dá)的hEGF90％以上分泌到培養(yǎng)基中，最高可達(dá)30mg/L培養(yǎng)基。取發(fā)酵液上清，經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析和反相HPLC，純度可達(dá)98％以上。
利用補(bǔ)料分批培養(yǎng)(Fed-Batch culture)，在E.coli中大量生產(chǎn)了hEGF。他們構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒載體是pTRLBT1，這個(gè)質(zhì)粒含有trp啟動(dòng)子、trpL基因N-末端6個(gè)氨基酸的編碼序列及融接在其下游的合成hEGF結(jié)構(gòu)基因。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)比E.coliHB101，篩選出工程菌株。因?yàn)閔EGF生產(chǎn)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)菌的乙酸鹽同化作用，所以工程菌發(fā)酵采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，將細(xì)胞培養(yǎng)分為兩個(gè)步驟。第一步，加色氨酸抑制trp啟動(dòng)子表達(dá)hEGF基因，使細(xì)胞生長(zhǎng)；第二步，從培養(yǎng)基中撤除色氨酸，誘導(dǎo)trp啟動(dòng)子表達(dá)hEGF基因，生產(chǎn)hEGF。工程菌在5升發(fā)酵罐中培養(yǎng)，起始工作體積為2L，包括0.2L過(guò)夜菌種，1g/L葡萄糖和0.2ml抗泡沫劑。pH保持7，溫度37℃，氣體流速2L/min，攪拌速度400～1000r/min。用氨水(6mol/L)調(diào)pH。通過(guò)改變攪拌速度將溶解氧水平控制在1～3ppm。當(dāng)攪拌速度達(dá)到最高1000r/min時(shí)，向發(fā)酵罐補(bǔ)充50％氧氣以代替空氣。通過(guò)檢測(cè)乙酸鹽濃度控制進(jìn)料速度，以便使乙酸鹽濃度維持在33mmol/L以下。飼養(yǎng)培養(yǎng)基(feeding medium)由200g/L葡萄糖，1000g/L酪蛋白水解物，60g/L酵母提取物，0.8g/L色氨酸和0.1g/L氨芐青霉素組成，pH7.0。在誘導(dǎo)hEGF基因表達(dá)時(shí)，從飼養(yǎng)培養(yǎng)基中排除酵母提取物和色氨酸。細(xì)菌培養(yǎng)8h改變培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一改變hEGF即刻開(kāi)始產(chǎn)生，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到60mg/L。重組hEGF以N-末端融接TrpL蛋白的6個(gè)氨基酸殘基的融合蛋白形式產(chǎn)生，并以包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。
三、檢驗(yàn)方法1．質(zhì)量檢測(cè)重組hEGF產(chǎn)品為透明澄清液體；SDS-PAGE測(cè)定分子量6045；等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)為4.55～5.20；反相HPLC分析肽圖與標(biāo)準(zhǔn)品一致；氨基酸序列分析儀測(cè)定N-端氨基酸序列與文獻(xiàn)一致；HPLC測(cè)定純度＞95％。
2．生物活性測(cè)定用MTT A431細(xì)胞抑制法測(cè)定生物效價(jià)為標(biāo)示量80％～120％。
B、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。
一、bFGF的基因人bFGF基因位于第4號(hào)染色體，是單拷貝基因，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)度大于38kb。第一個(gè)內(nèi)含子位于第60和61位密碼子之間，第2個(gè)內(nèi)含子位于第94和95位密碼子之間。bFGF mRNA有兩種形式，分別為4.6kb和2.2kb。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA序列分析表明，在bFGF cDNA的可讀框架中，有一個(gè)常見(jiàn)的AUG起始密碼子和UGA終止密碼子。這個(gè)讀框編碼的氨基酸序列與從組織中提純的bFGF氨基酸序列一致。此外，在常見(jiàn)的起始密碼子前面三個(gè)不同位置上有三個(gè)不常見(jiàn)的起始密碼子CUG。已證實(shí)這些CUG密碼子分別啟動(dòng)三種末端延長(zhǎng)形式的bFGF(分子量分別為24、23.1和22kD)的合成。
二、bFGF的結(jié)構(gòu)bFGF是單鏈多肽。由cDNA推斷的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物編碼155個(gè)氨基酸組成的前體分子，分子量約為18kD，其中不含信號(hào)肽。從不同組織中提純的bFGF肽鏈長(zhǎng)短不一。最早從牛腦和垂體分離提純的bFGF由146個(gè)氨基酸組成，而黃體bFGF僅由130個(gè)氨基酸組成。少于155個(gè)氨基酸的bFGF為氨基末端截短形式。已證實(shí)bFGF氨基末端縮短少于25個(gè)氨基酸不影響其活性，說(shuō)明N-端氨基酸不參與生物活性或bFGF與細(xì)胞表而受體的結(jié)合。
bFGF分子內(nèi)部有兩個(gè)潛在的肝素結(jié)合區(qū)，一個(gè)位于氨基端的第18～22位殘基，另一個(gè)位于羧基端的第107～110位殘基，因此對(duì)肝素有很高的親合力。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，第37～40和第78～81位殘基恰好是纖連素(fibronectin)的精-甘-天冬-X序列的顛倒，可能存在于蛋白質(zhì)的外部，這些殘基可以使bFGF附著到細(xì)胞表面的識(shí)別部位。
bFGF有四個(gè)半胱氨酸，形成兩個(gè)二硫鍵。bFGF在進(jìn)化過(guò)程中極其保守，如人和牛的bFGF,146個(gè)氨基酸中只有兩個(gè)不同，同源性達(dá)98.7％，鳥(niǎo)bFGF與牛bFGF氮基酸組成相同。
bFGF的結(jié)構(gòu)和功能與aFGF相似，但bFGF的活性比aFGF大10倍～100倍，且aFGF的細(xì)胞分布比較有限，主要在腦組織、視網(wǎng)膜、腎臟和骨組織中，而bFGF則分布在腦、垂體、視網(wǎng)膜、腎、腎上腺、胎盤(pán)、前列腺、胸腺、骨、免疫系統(tǒng)和各種腫瘤中?；旧纤械募?xì)胞都有bFGF的特異性、高親和性受體。因此，bFGF是一種基本調(diào)節(jié)因子，通過(guò)自分泌和旁分泌兩種機(jī)制起作用。
三、bFGF的理化性質(zhì)bFGF的等電點(diǎn)為9.6對(duì)熱不穩(wěn)定，易被蛋白酶降解；對(duì)肝素有很強(qiáng)的親和力，與肝素結(jié)合后，生物活性不變，但對(duì)溫度和酸的穩(wěn)定性增強(qiáng)，不易被蛋白酶降解。
四、重組人bFGF生產(chǎn)工藝?yán)肨7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)在E.coli中表達(dá)了人bFGF，并利用肝素-Sepharose親和柱層析實(shí)現(xiàn)了重組bFGF的一步純化。
1．表達(dá)質(zhì)粒pJU1005的構(gòu)建構(gòu)建bFGF表達(dá)載體的基礎(chǔ)是質(zhì)粒pET-3b。這個(gè)質(zhì)粒是pBR322的衍生物，含T7噬菌體的φ10基因啟動(dòng)子、翻譯起始部位和前11個(gè)密碼子以及Tφ-T7RNA聚合酶識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這些序列在pBR322的BamHⅠ位點(diǎn)插入，使轉(zhuǎn)錄以逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行。用EcoRⅠ-EcoRv雙酶消化，除去pET-3b中的一個(gè)含內(nèi)源EcoRⅠ、ClaⅠ和HindⅢ切點(diǎn)的185bp片段。在BamHⅠ切點(diǎn)插入一個(gè)合成的多聚接頭(Polylinker)，其中，靠近T7啟動(dòng)子的是BamHⅠ切點(diǎn)，最遠(yuǎn)端的是XhoⅡ切點(diǎn)。用同源的tet基因的一個(gè)650bp EcoRⅠ-Sall片段(已用亞硫酸氫鹽誘變消除了內(nèi)部的BamHⅠ和HindⅢ切點(diǎn))置換pET-3b中的BglⅡ-Sall片段，恢復(fù)了該質(zhì)粒的tet基因，使其同時(shí)具有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性。此質(zhì)粒命名為pJU1003。用一個(gè)合成的兩端分別為BamHⅠ和NcoⅠ切點(diǎn)的接頭，將bFGF cDNA序列與pJU1003中的T7噬菌體基因10直接銜接，得到表達(dá)質(zhì)粒pJU10052．bFGF的表達(dá)和純化用質(zhì)粒pJU1005轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌。將轉(zhuǎn)化菌于30℃在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，加入0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)bFGF表達(dá)。2h后收獲菌體，快速冰浴冷卻。于4℃離心，每克細(xì)胞沉淀重懸于4ml緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5)中，用弗氏細(xì)胞壓碎器破碎細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液調(diào)至0.5mol/L氯化鈉濃度，于4℃離心，去除細(xì)胞碎片。含重組bFGF的懸液成分用含0.5mol/L氯化鈉的緩沖液A，進(jìn)一步稀釋至相應(yīng)于5ml/g細(xì)胞濕重的體積，直接加到預(yù)先用同樣緩沖液平衡的肝素-Sepharose親和柱上層析。用二倍體積的平衡緩沖液洗柱，然后，再用含1mol/L氯化鈉的緩沖液A洗住，直至流出物的A280nm達(dá)到基線值。用含2mol/L氯化鈉的緩沖液A從柱上洗脫bFGF，得到高純度的bFGF。
這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組bFGF占菌體總蛋白的10％以上，產(chǎn)量達(dá)40mg/L培養(yǎng)物/A260nm單位。
五、重組bFGF的活性測(cè)定通過(guò)3H-TdR摻入法，用小鼠3T3成纖維細(xì)胞測(cè)定其絲裂原活性。
C、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)。
NGF最早是由蛇毒腺提取，后來(lái)又由小鼠下頜腺分離提純的。從小鼠下頜腺中提純的NGF是一種沉降系數(shù)為7S的復(fù)合物，含α、β和γ三種蛋白質(zhì)亞基，組成為α2βγ2，分子量130kD。γ亞基是一種精氨酸特異性的酯肽酶，參與β-NGF前體的加工。α亞基與γ亞基有80％以上的同源性，但沒(méi)有酯肽酶活性。只有β亞基具有NGF活性。
7SNGF的α、β和γ亞基通過(guò)弱的非共價(jià)鍵結(jié)合，只有在pH5～8時(shí)穩(wěn)定。當(dāng)pH＞8或pH＜5時(shí)，或者簡(jiǎn)單稀降。7SNGF可解離為α、β和γ亞基。在生理?xiàng)l件下，NGF以7S復(fù)合體形式存在。7SNGF各亞基等電點(diǎn)不同，可通過(guò)離子交換層析完全分離(見(jiàn)表利用羧甲基纖維素柱層析得到了NGF的活性單位β-NGF，它具有NGF的全部生理效應(yīng)。沉降系數(shù)為2.5，分子量26kD，等電點(diǎn)為9.3，由二條相同的單鏈非共價(jià)連接成二聚體，每條鏈由118個(gè)氨基酸組成。N-末端為Ser.C-末端為Arg，含三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。
(二)人NGF(hNGF)及其基因由于人體組織中合成的NGF量極低，所以hNGF的研究非常困難。
利用小鼠β-NGF克隆cDNA的665bpHgaⅠ-HincⅡ片段做為探針，從人基因組文庫(kù)中篩選出3.9kb的hβ-NGF基因DNA序列。這個(gè)序列含有兩個(gè)分別為124bp和738bp的區(qū)域，與mNGF的前肽原(prepropeptide)基因高度同源，是hNGF基因的兩個(gè)外顯子，其中738bp的較大外顯子含成熟hβ-NGF編碼序列。這兩個(gè)外顯子之間有一個(gè)6.6kb的間隔序列，在-126位和-125位之間。在-187,-121和-119位有三個(gè)ATG三聯(lián)體，其中-121位的ATG可能是hβ-NGF的前肽原基因起始密碼子。-121位的上游，包括124bp的小外顯子可能是5＇非翻譯序列。β-NGF的信號(hào)肽(-121位-104位)和成熟β-NGF在人與小鼠之間高度保守，同源性分別為94.5％和90％。成熟hβ-NGF的N-末端氨基酸為Ser，與mNGF相同，C-末端比mNGF多出兩個(gè)氨基酸Arg和Ala。因此，hβ-NGF為120個(gè)氨基酸，其中的第45位Asn可能是N-糖基化位點(diǎn)。
(三)hNGF的性質(zhì)hNGF的前肽原含241個(gè)氨基酸，信號(hào)肽為18個(gè)氨基酸，成熟β-NGF為120個(gè)氨基酸。分子量13000，有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，六個(gè)Cys殘基，形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。等電點(diǎn)為8.86。在體內(nèi)以二聚體存在。
(四)重組hNGF生產(chǎn)工藝目前，重組hNGF已在E.coli、酵母和動(dòng)物細(xì)胞中獲得表達(dá)。不過(guò)，根據(jù)已公布的試驗(yàn)報(bào)道，重組hNGF的表達(dá)量一般都比較低，E.coli和酵母表達(dá)的NGF活性只相當(dāng)于小鼠下頜腺mNGF的1/200～1/1000，而用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的NGF與mNGF活性相等。
利用構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pTB1058在CHO細(xì)胞中表達(dá)了hNGF。
1．表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建以人工合成的0.38kb hNGF編碼序列做為探針，從人白血細(xì)胞基因組λEBL3文庫(kù)中篩選出一個(gè)具有15kb插入體的陽(yáng)性克隆。這個(gè)插入體中的一個(gè)開(kāi)放讀框的核苷酸序列與報(bào)道的編碼prepro-NGF(由Met-121至Ala120)的開(kāi)放讀框相同。從這個(gè)插入體DNA中分離出一個(gè)0.8kb的BclⅠ-ApaⅠ片段，編碼信號(hào)肽的C-端部分。肽原(propeptide)和成熟NGF。將這個(gè)片段與編碼信號(hào)肽N-端部分的合成DNA連接，得到完整的hNGF基因，插入到質(zhì)粒pTB399(已除去其中的II-2cDNA)中的鼠白血病毒(MuLV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的下游，得到質(zhì)粒pTB1054。從pTB1054中分離出含MuLV LTR和hNGF基因的2kb ClaⅠ片段，插入含二氫葉酸還原酶(DHFR)cDNA的質(zhì)粒pTB348的(ClaⅠ切點(diǎn)，得到表達(dá)質(zhì)粒pTB1058
(五)重組hNGF的檢驗(yàn)通過(guò)SDS-PAGE電泳測(cè)定的重組hNGF分子量為13000；等電點(diǎn)為9～10；N-端氨基酸序列與從hNGF基因核苷酸序列推斷的相同；根據(jù)肼解作用確定的羧基末端氨基酸是Ala，與Ullrich等推斷的成熟hNGF的羧基端比mNGF多兩個(gè)氨基酸即Arg119和Ala120的結(jié)論相符；依次用胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)消化得到三個(gè)片段，每個(gè)片段的氨基酸序列分析確定三個(gè)二硫鍵位于Cys15-Cys80,Cys58-Cys108和Cys68-Cys110，與mNGF相同。
根據(jù)刺激PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)和支持雞胚背根神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元存活測(cè)定的重組hNGF的特異生物學(xué)活性與2.5SmNGF相匹配。D、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)。
(一)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)BDNF是由119個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為13500；分子內(nèi)有三個(gè)二硫鍵和一個(gè)糖基化位點(diǎn)；等電點(diǎn)為9.99。在體內(nèi)以二聚體存在，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)多種神經(jīng)元如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、神經(jīng)脊及基板起源的感覺(jué)神經(jīng)元、黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元、基底前腦的膽堿能神經(jīng)元以及海馬、皮層、視神經(jīng)節(jié)等處的神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化以及損傷后修復(fù)有促進(jìn)作用。最近發(fā)現(xiàn)，BDNF還具有促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的功能。
(二)重組BDNF的生產(chǎn)工藝BDNF(還有NT3,NT4/5)的基因結(jié)構(gòu)與NGF相似，成熟蛋白的編碼序列位于單一外顯子內(nèi)，沒(méi)有內(nèi)含子間隔。因此，可以利用PCR方法直接以人基因組DNA為模板擴(kuò)增出來(lái)。何曉龍等(1995)利用這種方法制備了BDNF的編碼基因，并在E.coli中獲得較高表達(dá)。
首先設(shè)計(jì)兩種PCR引物引物I含成熟BDNF的N-端部分編碼序列和NdeⅠ酶切位點(diǎn)，引物2含成熟BDNF C-端部分編碼序列的互補(bǔ)序列，并在終止密碼子后加BamHⅠ酶切位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增出的BDNF基因插入質(zhì)粒pET-3a和pET-16a的NdeⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化E.coli JM109株，經(jīng)篩選鑒定，分別得到含BDNF基因的重組質(zhì)粒pET-3B和pET-16B。這兩個(gè)質(zhì)粒都由T7啟動(dòng)子控制BDNF的表達(dá)。
將重組質(zhì)粒pET-3B和pET-16B重新轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)株，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃,3h)。菌體裂解液的SDS-PAGE電泳表明，pET-3B工程菌表達(dá)了分子量約15kD的蛋白質(zhì)，為非融合的BDNF，占菌體總蛋白的15.4％。N-端前15個(gè)氨基酸序列分析結(jié)果除起始端多了一個(gè)Met以外，與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致，但SDS-PAGE顯示的分子量與理論值有一定差異，原因不清。pET-16B工程菌表達(dá)了分子量為16.5kD的蛋白質(zhì)，N-端融合了21肽的BDNF，占菌體總蛋白的47.2％。其中的21肽含10個(gè)連續(xù)的組氨酸和凝血因子X(jué)a特異性識(shí)別位點(diǎn)。因此，可以用特殊的組氨酸結(jié)合樹(shù)酯(Novage公司產(chǎn)品)純化，然后用凝血因子X(jué)a切除N-端融合的21肽，得到成熟BDNF。
E、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)。
(一)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)CNTF由200個(gè)氨基酸組成，分子量為24kD,N-端不帶信號(hào)肽，不是典型的分泌因子。分子內(nèi)只在第17位有一個(gè)Cys殘基，不含二硫鍵，也不含糖基化位點(diǎn)。等電點(diǎn)為5.78，是酸性蛋白質(zhì)。CNTF對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、海馬膽堿能神經(jīng)元、黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元等均有促進(jìn)存活和損傷保護(hù)作用。
(二)生產(chǎn)工藝用EooRⅠ從人CNTF cDNA克隆載體pKSH CNTF質(zhì)粒中切出CNTF基因片段，定向插入到含PL啟動(dòng)子的載體pBPL的EcoRⅠ切點(diǎn)，轉(zhuǎn)化E.coliJM83，經(jīng)篩選鑒定得到表達(dá)載本pBLHc，轉(zhuǎn)化E.coliHB101得到CNTF表達(dá)菌株。該菌株經(jīng)培養(yǎng)和熱誘導(dǎo)，表達(dá)了分子量為24kD的蛋白質(zhì)，占菌體總蛋白的25％。
收集菌體，超聲裂解，離心取上清。上清用硫酸銨沉淀，收集30％～60％飽和度的沉淀組分，用TE緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、5mmol/LEDTA,pH7.5)溶解后，對(duì)TE透析。然后上DEAE-A50離子交換-交聯(lián)葡聚糖凝膠柱層析。用TE和TE加0.5mol/L氯化鈉(pH7.5)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集CNTF富集組分，對(duì)TE透析，再上Sephacryl S-200柱，用TE洗脫，得純化CNTF，純度95％以上，得率25.4％。
用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測(cè)定重組CNTF的活性為1.3TU/ng。此處ITU(活性單位)表示在1ml培養(yǎng)液中能使神經(jīng)細(xì)胞達(dá)到最大存活數(shù)一半時(shí)所需樣品的質(zhì)量數(shù)。
原料中的多肽類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子需經(jīng)CNBr處理后的蛋白酶消化，得到活性小肽鏈后，制成注射用凍干粉劑或注射劑。
口服制劑無(wú)需經(jīng)蛋白酶消化，而是將原料制成冷干粉后，直接制成膠囊劑、片劑、滴丸劑或其它口服制劑。
權(quán)利要求
1.一種治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的藥物，其特征在于它是以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor、NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4(NT-4)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5(NT-5)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic fa-ctor,CNTF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)、組胺(his-tamine,HA)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related pep-tide,CGRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、環(huán)核苷酸(cAMP)、心鈉素(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉素(brain natriuretic peptide,BNP)、C型利鈉肽(C-typeNatriuretic peptide,CNP)、前列環(huán)素(PGI2)、內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(EDRF)為原料，上述原料可單獨(dú)或混合制成治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化的藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說(shuō)的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，用于治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子－3、4、5(NT－3、NT－4、NT－5)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganlioside)、乙酰膽堿(Ach)、組胺(HA)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY),環(huán)核苷酸(cAMP)為原料制成的治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化的藥劑,劑型包括注射用凍干粉劑、注射劑和口服用膠囊劑、片劑、滴丸劑。該藥物經(jīng)控制性酶解,得到的小肽鏈能通過(guò)血腦屏障,作用于大腦。上述病癥嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命健康,它的市場(chǎng)需求是巨大的。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1228995SQ9911343
公開(kāi)日1999年9月22日 申請(qǐng)日期1999年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月26日
發(fā)明者盧杲 申請(qǐng)人:盧杲