專利名稱：供治療葡萄球菌感染的只含溶葡萄球菌素或含溶葡萄球菌素和抗生素的藥物組合物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及給予溶葡萄球菌素治療哺乳動物，包括人體，的葡萄球菌感染，和在所述治療中使用的藥物制劑。本發(fā)明也涉及治療特定的疾病，包括葡萄球菌心內(nèi)膜炎、葡萄球菌菌血癥；和腎臟、肺部、皮膚、骨骼、燒傷、創(chuàng)傷和假體設(shè)備的葡萄球菌感染。本發(fā)明還涵蓋了廣義的溶葡萄球菌素，不僅包括野生型溶葡萄球菌素，而且包括重組溶葡萄球菌素的應用；溶葡萄球菌素變體是其氨基酸序列由于基因突變(如取代、加成和刪除)、轉(zhuǎn)錄后加工、嵌合融合蛋白的基因工程等而從成熟肽的公開的“天然序列”(美國專利4,931,390)中變化的變體或這些變體的組合。
現(xiàn)有技術(shù)背景溶葡萄球菌素是一種酶，首先在假葡萄球菌(Staphylococcus simulans)(以前稱為S.staphylolyticus)里發(fā)現(xiàn)，依靠它對細菌的細胞壁肽葡聚糖里含甘氨酸的橋鍵的蛋白分解活性顯示出抗微生物活性[Zygmunt等，Progr.Drug Res.16309-333(1972)]。
在體外，溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌特別有活性，因為該類細胞壁里的橋鍵含高比例的甘氨酸，但對其它葡萄球菌也有活性(同上)。
在動物感染模型里檢查溶葡萄球菌素的活性。腹腔內(nèi)感染后用腹腔內(nèi)治療的研究與體外實驗相似，在此不作考慮。有兩個報道述及，當動物患有腹腔內(nèi)感染后，單劑皮下給予或多劑皮下給予總共約1毫克/千克溶葡萄球菌素制劑時，50％小鼠存活[Schuhardt等，J.Bacteriol.88815-816(1964)；Harrison等，加拿大微生物雜志，1393-97(1967)]。據(jù)報道，在這些研究中總劑量6毫克/千克能保護100％小鼠存活[Harrison等，同上]。用于兩個研究里的細菌毒力似乎相當?shù)?，因為未治療的感染小鼠在短期里根本不死亡?br> 一些實驗使用了小鼠亞急性模型，測量用金黃色葡萄球菌的Giorgio菌株感染后負載在腎臟里的細菌[Dixon等，Yale J.Biol.Med.4162-68(1968)；Schaffner等，Yale J.Biol.Med.39230-244(1967)；Harrison等，Bacteriol。93520-524(1967)]。當溶葡萄球菌素制劑在感染后6小時里靜脈給予時，在1.5毫克/千克劑量或更高劑量下細菌數(shù)明顯減少。但是，已有的感染較難控制；當停止治療后24小時或更長的時間后，即使用125或250毫克/千克溶葡萄球菌素制劑治療，也只適度減少細菌數(shù)。
一個研究(Goldberg等，Antimicrob.Chemother.196745-53(1967))在一種非普通的心內(nèi)膜炎模型里使用有限數(shù)量的狗。狗模型尚沒有進一步的發(fā)展。Goldberg等實驗不可比，因此能有限地用來評價溶葡萄球菌素的給藥。但是，通過判定狗的健康和心臟瓣膜和腎臟里的細菌數(shù)的減少，發(fā)現(xiàn)高劑量的溶葡萄球菌素(至少50毫克/kg/治療)只適度有效。
因此，從現(xiàn)有技術(shù)用動物模型研究得到的數(shù)據(jù)未提示使用溶葡萄球菌是有效的，并能清除各個器官里的感染。
進行有限的人體試驗，其目的是通過對鼻孔局部外用溶葡萄球菌素可以防止鼻子成為金黃色葡萄球菌的帶菌體[Martin等，J.Lab.Clin.Med.701-8(1967)；J.Lab.Clin.Med.71791-797(1968)；Quickel等Appl.Microbiol.22446-450(1971)]。鼻子帶菌本身不是疾病狀態(tài)。但它對集中護理治療的病人感染或?qū)凶o理病人的自身感染構(gòu)成了危險的因素。
本技術(shù)領(lǐng)域報道，用單劑非胃腸道給藥的溶葡萄球菌素，三天后用抗生素慶大霉素治療病重的病人。病人死亡，但其菌血癥減輕(Stark等，N.Engl.J.Med.291239-240(1974)]。
在動物和人體研究期間觀察到的致免疫的現(xiàn)象引起了人們的極大關(guān)注。溶葡萄球菌制劑被外來物質(zhì)污染可能與這些現(xiàn)象中的至少一些有關(guān)。
沒有進一步開發(fā)出作為治療劑的酶，因為在所討論的研究里缺乏所需的有效性。這可能進一步由于生產(chǎn)和純化溶葡萄球菌素的難度較大。
業(yè)已對溶葡萄球菌素的葡萄球菌基因進行了編序和克隆(美國專利4,931,390)。通過發(fā)酵Bacillus sphaericus非致病重組菌株來制備實驗室使用的試劑，這較易于純化。
本技術(shù)領(lǐng)域人員仍然在致力于開發(fā)能非胃腸道給藥并可用來治療葡萄球菌感染以及特定的組織感染，如心內(nèi)膜炎的治療劑。
發(fā)明綜述通過非胃腸道給予相對低劑量溶葡萄球菌素(50毫克/千克以下)能明顯有效地治療葡萄球菌感染，特別是耐藥的感染，和/或典型地與發(fā)病率和死亡率有關(guān)的感染。進一步的是，溶葡萄球菌素顯示出能有效地抗葡萄球菌，所述的葡萄球菌至少部分對現(xiàn)有的抗微生物劑，如β-內(nèi)酰胺抗生素，包括青霉素酶穩(wěn)定的青霉素、萬古霉素等有耐藥性。
本發(fā)明進一步包括結(jié)合療法，所述的療法包括交替或同時給予溶葡萄球菌素和一種或多種其它抗微生物劑。特別優(yōu)選的與本發(fā)明溶葡萄球菌一致給藥的抗生素是利福霉素(從微生物中分離得到，或合成或半合成地生產(chǎn)，如利福平)和糖肽(一組分子，其中天然形成的分子通常含一種七肽和一種或多種糖部分)，所述的糖肽可為天然形成和分離得到的(如萬古霉素，替考拉寧等)或是半合成制劑。
克隆、重組和變體的溶葡萄球菌素的可利用性進一步擴展了本發(fā)明。已識別出了相關(guān)的酶，它可與溶葡萄球菌素一起使用或替代溶葡萄球菌素。
對溶葡萄球菌素基因的克隆和序列化涉及分離性質(zhì)與野生型溶葡萄球菌素相似或不同的變體酶。一個這類改變的酶具有單個氨基酸改變，它由我們的研究得到，已對其作了特征化，并在體外和動物感染模型里顯示有效的抗葡萄球菌活性。
其它的溶葡萄球菌素類似物包括序列與溶葡萄球菌素相同并具有內(nèi)肽酶活性的天然形成的酶，或甚至是通過使一種酶的結(jié)合閾與另一個催化閾融合得到的嵌合酶，它們也是能治療難以治療的、由葡萄球菌或其它致病細菌引起的細菌疾病的有效制劑。
附圖簡述

圖1是與萬古霉素相比，溶葡萄球菌素對耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌株的殺菌活性的表示圖。
圖2是反映了溶葡萄球菌素對耐不同抗微生物劑的各種金黃色葡萄球菌的殺菌活性的圖。
定義用于本申請的術(shù)語含義與通常一般使用時的含義相同。某些術(shù)語用來揭示一類作用或化合物，以提供邏輯上能成組的項目或科學現(xiàn)象的一般描述。
溶葡萄球菌素類似物-任何酶，包括溶葡萄球菌素(野生型)、任何溶葡萄球菌素突變體或變體、任何保留了分解蛋白能力的相關(guān)酶，所述的酶能體內(nèi)或體外對葡萄球菌的細胞壁肽葡聚糖里的含甘氨酸的橋鍵進行蛋白分解。通過對蛋白質(zhì)(存在于發(fā)生菌株里的酶或通過在加工的任何階段引入的酶或試劑)進行轉(zhuǎn)錄后加工，或通過使結(jié)構(gòu)基因進行突變產(chǎn)生變體。突變包括位點刪除、插入、除去閾和替換突變。本發(fā)明里的溶葡萄球菌素類似物可重組表達或用別的方式表達。
非胃腸道給藥-通過注射給藥，包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、眼窩里注射、脊椎注射、腹腔內(nèi)注射和直接輸液，或通過注射(如髓內(nèi)注射)釋放到組織或器官。
發(fā)明詳述金黃色葡萄球菌是高度致命的人類病原體。它引起了各種人體疾病，從皮膚感染到威脅生命的菌血癥和至關(guān)重要的器官感染。若不迅速控制，金黃色葡萄球菌感染會迅速從感染的原發(fā)位置擴展到其它器官。雖然感染沒有特別的集中點，但特別易于感染的器官包括心臟瓣膜、腎臟、肺部、骨骼、腦膜和燒傷病人的皮膚。手術(shù)或創(chuàng)傷和有外來物存在的任何區(qū)域也易于感染。這些由于接觸或在醫(yī)院里逗留的感染是發(fā)病率和死亡率高的原因，即使使用了最佳的治療，在特定的人群中會高達60％嚴重感染。其它種類的葡萄球菌(諸如S.epidermidis的凝固酶陰性的葡萄球菌)致命性較差，但會混入插管或假體裝置；這在裝置是移植的心臟瓣膜時會有毀滅性的結(jié)果。
在葡萄球菌里對現(xiàn)有抗微生物劑有耐藥性似乎特別容易，金黃色葡萄球菌開始對青霉素有耐藥性；該耐藥性在抗生素時代開始后即迅速出現(xiàn)。事實上所有的葡萄球菌感染，不論是公眾接觸或醫(yī)院里患的感染，由于產(chǎn)生了青霉素酶不再對第一代青霉素敏感；對青霉素酶穩(wěn)定的青霉素(如甲氧苯青霉素)也有耐藥性的菌株也有很大的問題，特別是在醫(yī)院里獲得的感染。[疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，1997.金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性減少(Reduced susceptibility ofStaphylococcus aureus to vancomycin)--日本，1996。發(fā)病率和死亡率每周報道46624-626(1997)。]
葡萄球菌感染的首選治療是萬古霉素，特別是在醫(yī)院里的治療。但是，從高死亡率可見，對于某些疾病，如金黃色葡萄球菌性心內(nèi)膜炎和菌血癥，它們需要迅速地減少細菌數(shù)以防止對心臟和通過血液擴散使其它器官感染而發(fā)生不能逆轉(zhuǎn)的損傷，目前的治療均不理想。目前不能有效治療的一個原因是它們的作用，特別是體內(nèi)作用相當慢，感染的部位需要迅速殺菌以使病人迅速康復。在這樣危及生命的情況下，和在一些其它感染中(諸如骨髓炎，其中的治療方案很冗長)，新穎的療法或新的組合療法大大地改善了疾病的結(jié)果。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，溶葡萄球菌素在中等劑量下活性很高。下面顯示了在很嚴重的特征性很強的動物感染模型里，由耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的兔子的心內(nèi)膜炎。特別是，我們顯示，在用本發(fā)明劑量方案治療的幾乎所有動物中對心臟瓣膜完全殺菌，而用目前可得的抗微生物劑則沒有新奇的結(jié)果。我們在此進一步顯示，即使很低每日劑量溶葡萄球菌素與標準治療劑組合能加強該模型系統(tǒng)里抗微生物活性。
我們使用的溶葡萄球菌素劑量明顯地低于以前顯示的對動物模型的器官上的細菌只有有限清除效果的劑量[Zygmunt等，Progr.Drug.Res.16309-333(1972)；Goldberg等，Antimicrob.Ag.Chemother.196745-53(1967)]。
我們在下面也顯示了對體外和小鼠急性感染模型里，由攜帶溶葡萄球菌素的Bacillus sphaericus的重組菌株突變產(chǎn)生的溶葡萄球菌素改變形式產(chǎn)生的抗葡萄球菌的活性。因此，本發(fā)明的另一方面涉及給予溶葡萄球菌素類似物的藥物制劑，所述的類似物是溶葡萄球菌素或具有肽葡聚糖內(nèi)肽酶活性的其它酶，包括含一個或直到五個氨基酸發(fā)生取代的基因修飾酶；有直到10個氨基酸發(fā)生刪除或插入，包括發(fā)生在N-末端上的刪除和插入的酶；或由不同酶的催化閾和結(jié)合閾的融合得到的嵌合酶等作為治療劑來治療人體或動物的感染。
例如，已揭示了另一種甘氨酰甘氨酸內(nèi)肽酶(來自Staphylococcus capitisEPK1的ALE-1)。ALE-1不同于溶葡萄球菌素，但兩種酶具有相當多的氨基酸相同(Sugai等，J.Bacteriol.1791193-1202(1997)]。另一種與溶葡萄球菌素的相同程度低、當也具有內(nèi)肽酶活性的肽葡聚糖水解酶是zoocin A，由Streptococcus zooepidemicus 4881產(chǎn)生[Simmonds等，應用和環(huán)境微生物學624536-4541(1996)；Simmonds等，基因(Gene)189255-261(1997)]。嵌合蛋白可通過使這些酶或相似酶的一個閾與溶葡萄球菌素類似物的一個閾融合來制備。
雖然在早期研究中觀察到的某些免疫副作用有些場合下會考慮，但其它場合(如緊急或短期場合)用通過發(fā)酵無害的細菌重組菌株得到的溶葡萄球菌素類似物的適當純的制劑被希望不易誘發(fā)免疫副作用或其它副作用。
這些抗微生物酶的有效藥劑包括水溶液或無水制劑(如，凍干、結(jié)晶或無定形的制劑，有或沒有另外的溶劑供滲透平衡)供與液體再構(gòu)建適合活性劑非胃腸道釋放。釋放優(yōu)選地通過靜脈注射(i.v.)、肌肉注射(i，m.)、皮下注射(s.c)或腹腔內(nèi)注射(i.p.)途徑，或囊內(nèi)給藥或吸入給藥或通過直接滴注入感染部位，使血液和組織水平超過活性劑最小的抑制濃度(MIC)，這樣能有效地降低細菌滴度，以治愈或減輕感染。
此外，活性溶葡萄球菌素類似物可與其它抗微生物劑同時或交替地共同給藥，以更有效地治療感染疾病。制劑可配制成或再構(gòu)成，小體積適合靜脈注射或外周注射的液體，或加到大體積的靜脈滴注溶液里，或再構(gòu)成大體積以通過靜脈輸液給予。與溶葡萄球菌素或其它抗微生物酶一起給予的制劑可與所述的酶一起進行混合組合來配制，或在所得的制劑里用公知的使這些制劑在感染部位的濃度達到合適水平的給藥途徑即席地使用。
溶葡萄球菌素的合適劑量和給藥方案隨著感染的嚴重程度和感染機體的敏感程度而改變，對于結(jié)合療法，可根據(jù)組合里使用的特定的抗微生物劑而定。劑量范圍是0.5-200mg/kg/天，優(yōu)選的是3到25-50mg/kg/天，單劑或分次劑量給予，優(yōu)選的是連續(xù)輸液，或每天分成兩次或四次劑量。
實施例如Recsei(美國專利4,931,390)所述，用重組B.sphaericus菌株發(fā)酵產(chǎn)生含溶葡萄球菌素基因的溶葡萄球菌素類似物或其突變體來進行所有的實驗。特別是，通過使B.sphaericus發(fā)酵制備的溶葡萄球菌素類似物不同于在N-末端有多達2個或直到2個另外的氨基酸的公開序列。
特別是，本文是數(shù)據(jù)來自用重組產(chǎn)生的溶葡萄球菌素類似物的制劑，其中大部分組分沒有公開序列的兩個N-末端氨基酸的組分。但是，發(fā)現(xiàn)不局限于這些制劑。任何有適當純度和活性的制劑都能得到相似的結(jié)果。
實施例1溶葡萄球菌素的體外活性如表1a所示，實驗顯示溶葡萄球菌素制劑是活性的，能體外殺滅金黃色葡萄球菌的臨床分離物；用標準肉湯微稀釋方法(臨床實驗室標準的國家委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards)，1993)測得的最小抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)≤1.0微克/毫升[臨床實驗室標準的國家委員會，1993。應用標準M7-A3。對需氧生長的細菌的稀釋抗微生物劑的敏感性試驗方法-第三版。臨床實驗室標準的國家委員會，美國賓夕法尼亞；臨床實驗室標準的國家委員會，1992。試驗指南M26-T。測定抗微生物劑殺菌活性的方法。臨床實驗室標準的國家委員會，美國賓夕法尼亞]。
此外，溶葡萄球菌素顯示能抵抗許多表皮(epidermidis)葡萄球菌分離物(凝固酶陰性種類)，對于13個被試驗的臨床分離物中的11個，其MIC≤8微克/毫升。MIC被定義為完全抑制細菌可見生長的最低濃度，MBC是暴露了24小時后殺死99.9％最初接種體的最低濃度。如表1a所示，對溶葡萄球菌素的易感性不被對甲氧苯青霉素和/或萬古霉素的耐藥性或降低的敏感性所影響。最近，美國也出現(xiàn)了對甲氧苯青霉素有耐藥性且對萬古霉素也只有中等易感性的金黃色葡萄球菌菌株[疾病控制和預防中心，發(fā)病率和死亡率每周道道199。46813-815]。
表1a 金黃色葡萄球菌對溶葡萄球菌素體外易感性的初步研究

c臨床分離物；m耐甲氧苯青霉素物；vVISA菌株(對萬古霉素有中等易感性)；*在實驗室里派生自耐甲氧苯青霉素臨床分離物，對萬古霉素有中等易感性的菌株。
溶葡萄球菌素粘附于塑料材料上，會從溶液里失去；這會影響它的表觀活性。因此，一些MIC測定也通過向稀釋物里加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)來進行。否則，該方法與上述的是相同的。如表1b所示，在BSA存在下，溶葡萄球菌素對被試驗菌株的體外活性改進了8到64倍。由于該觀察涉及到溶葡萄球菌素對塑料材料的親和力，預計葡萄球菌菌株對溶葡萄球菌素的易感性比已觀察到的更高。
表1b.帶有BSA和不帶有BSA時溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌的活性

c臨床分離物；m耐甲氧苯青霉素這些數(shù)據(jù)顯示溶葡萄球菌素對多個抗生素有耐藥性的金黃色葡萄球菌的臨床分離物有極為有效的活性。
通過時間-殺死實驗也研究了溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌的殺菌活性。在該類型的一個實驗里，將來自意大利Genoa的耐甲氧苯青霉素的臨床分離物，金黃色葡萄球菌菌株AG461接種到Mueller-Hinton肉湯里(Difco)，在輕輕搖動、37℃下生長，直到每毫升有約108存活細胞(CFU/ml)，這用600 nm處的培養(yǎng)物的吸光度來測定。然后用新鮮肉湯將培養(yǎng)物稀釋到約106CFU/ml，5毫升等分物放在數(shù)個不同的燒瓶里供暴露于不同濃度的抗菌素。繼續(xù)輕輕振動、37℃下的培養(yǎng)，以一定的間隔取出樣品來測定存活細胞。在消毒鹽水(0.9％NaCl在蒸餾水里)里制備一系列10-倍稀釋的樣品，用瓊脂包含的方法將0.1毫升合適稀釋物的等分物一式兩份地放在胰蛋白酶(Tryptic)大豆瓊脂板(Remel)上。(在該方法中，等分物被加到2.5毫升頂部瓊脂上，使之混合并倒在板上。頂部瓊脂由熔融的胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco)構(gòu)成，用Difco胰蛋白酶大豆肉湯稀釋2-倍，得到最終的瓊脂濃度為0.75％，w/v)。使板在36℃下培養(yǎng)24-48小時，人工數(shù)出菌落數(shù)。所有的溶葡萄球菌素稀釋物在0.1-0.2％BSA存在下制備，以預防溶葡萄球菌素被塑料材料吸附。萬古霉素(SigmaCHemical Co.)在無菌蒸餾水里稀釋。
如圖1所示，濃度為0.004-0.032微克/毫升的溶葡萄球菌素能快速殺菌，在接觸后的一小時里至少99.9％細菌被殺死。在對比試驗中，萬古霉素的殺菌作用降低且慢得多，即使使用很高濃度的萬古霉素(2和16微克/毫升)，接觸三小時后幾乎沒有殺死什么細菌。所用的溶葡萄球菌素和萬古霉素的不同濃度是它們各自MIC的一倍和八倍。
在另一個實驗中(圖2)，將金黃色葡萄球菌的三個不同的耐甲氧苯青霉素的臨床分離物和第四菌株，27619VR，派生自耐甲氧苯青霉素臨床分離物的實驗室衍生出的“VISA”菌株(即對萬古霉素具有中等的耐藥性)接種入小心調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯(Becton Dickinson)，在37℃下生長過夜。然后用新鮮肉湯稀釋，在輕輕振動、37℃下培養(yǎng)，直到達到對數(shù)級的生長階段。如圖2所示，此時細菌滴度范圍是2×106到9×107CFU/毫升。溶葡萄球菌素以1微克/毫升加到每個培養(yǎng)物里。以一定的間隔取出樣品，用0.9％NaCl作系列稀釋，通過噴在Mueller-Hinton瓊脂(Becton Dickinson)上鋪板。瓊脂板在37℃度下培養(yǎng)48小時，人工數(shù)出菌落，如圖2所示，所有的這些菌株能迅速地被溶葡萄球菌素殺死。
這些數(shù)據(jù)顯示，溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌同代的臨床分離物，包括耐甲氧苯青霉素的菌株和同時耐甲氧苯青霉素和對萬古霉素有中等耐藥性的菌株，都有有效和迅速的殺菌活性。
動物模型研究實施例2溶葡萄球菌素在小鼠金黃色葡萄球菌感染模型里的對比效果在小鼠的急性感染模型里，將溶葡萄球菌素的效果與萬古霉素的相比。金黃色葡萄球菌Smith在小牛肉灌輸肉湯(Difco)，并在含5％豬胃粘液素(Difco)里稀釋，中等振搖培養(yǎng)過夜。對體重大約20克的雄性Swiss-Webster小鼠(Taconic農(nóng)場，美國紐約)腹腔內(nèi)注射105-106存活細胞，這約是在48小時里能再生地殺死所有未處理動物的接種物的10倍。在每個處理組里有6個小鼠。靜脈注射溶葡萄球菌素(在0.1毫升5％右旋糖里供注射)或皮下注射(在0.2毫升里)，在10分鐘里注射。皮下注射萬古霉素。
如表2所示，靜脈注射給予0.16mg/kg或皮下注射給予2.5mg/kg溶葡萄球菌素能100％保護感染小鼠。萬古霉素對小鼠皮下給藥是完全可生物利用的，不論皮下給予或靜脈給予有相似的活性，在25毫克/kg劑量下100％有效。所有的未處理小鼠在不到24小時里都死亡。
表2溶葡萄球菌素對小鼠金黃色葡萄球菌感染的效應

該實施例顯示，溶葡萄球菌素對用高致命的細菌劑量的小鼠急性感染模型里對抵抗金黃色葡萄球菌是有效的。當靜脈給予，非常低劑量的純的重組溶葡萄球菌素是有效的。以重量為基準，溶葡萄球菌素的有效性是萬古霉素的16倍；以摩爾數(shù)為基準，溶葡萄球菌素的有效性是萬古霉素的約200倍。
實施例3變化的溶葡萄球菌素酶的體外和體內(nèi)活性含美國專利4,931,390所述的克隆的溶葡萄球菌素基因的Bacillussphaericus菌株用N，N-亞硝基胍誘變。存活的克隆通過使它們在金黃色葡萄球菌菌株RN4880的熱殺死細胞上鋪板來篩選溶解活性，在32℃下培養(yǎng)過夜。保留產(chǎn)生明顯澄清帶的菌落。
這些菌落之一被進一步特征化。溶葡萄球菌素被編序列，發(fā)現(xiàn)在成熟溶葡萄球菌素蛋白質(zhì)的相應位置218處含單個G-to-A突變，得到GGT(甘氨酸)到GAT(天冬氨酸)的編碼改變。該突變菌株的發(fā)酵能產(chǎn)生體外和體內(nèi)試驗充足的物質(zhì)。
如表3所示，變體酶在體外對金黃色葡萄球菌的活性很高，但野生型的溶葡萄球菌素制劑活性更大。在該實驗中，通過在玻璃管中，在肉湯里稀釋到最終體積1毫升時測量MIC。否則，用上述方法測量。
表3變體溶葡萄球菌素抵抗體外金黃色葡萄球菌的活性

臨床分離物；m耐甲氧苯青霉素如表4所示，變化的溶葡萄球菌素酶在急性小鼠感染模型里對金黃色葡萄球菌也有很高的活性。變體比野生型溶葡萄球菌素的活性稍低，但它比萬古霉素的活性大。
表4 變體溶葡萄球菌素對小鼠中金黃色葡萄球菌感染的活性

實施例4用溶葡萄球菌素處理的兔子血清里的抗微生物活性對體重約5千克的新西蘭白兔靜脈輸液125毫克溶葡萄球菌素。按間隔取血樣，直到4小時，制備血清；制備2倍系列的稀釋物，測定血清對金黃色葡萄球菌的耐甲氧苯青霉素菌株(MRSA 27619)的殺菌滴度。血清殺菌滴度24小時里殺死99.9％接種物的最高稀釋度。在該試驗里，除了微滴定坑里含不同稀釋度的血清而不是不同濃度的純化的抗微生物劑溶液外，基本上用最小殺菌方法測定細菌的存活性。
如表5所示，在整個試驗期間，血清含很高殺菌濃度的溶葡萄球菌素。特別是，從30分鐘到120分鐘時間點上，滴度大于1∶256(被試驗的最高稀釋度)，這包括至少稀釋256被仍能殺死99.9％細菌。在最后的時間點240分鐘處，滴度為1∶64。表5對5千克兔子給予125毫克溶葡萄球菌素后血清的殺菌滴度<

該實施例顯示，溶葡萄球菌素保留了兔子血清里的殺菌活性，在注射后能在循環(huán)里存在并保留活性達至少4小時。
實施例5溶葡萄球菌素對兔子中實驗性心內(nèi)膜炎的效應在體重約3千克的新西蘭白兔里建立大動脈瓣膜心內(nèi)膜炎。麻醉兔子，手術(shù)暴露右側(cè)頸動脈，用聚乙烯插管插入心臟的左側(cè)靜脈。在至少24小時后，給兔子靜脈注射106-107耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌菌株(MRSA 27619)。24小時后，動物被隨機指派成不同的處理組未處理對照(9個兔子)；陽性對照，萬古霉素30毫克/kg，每天兩次(15)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天三次(11)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天一次(10)；溶葡萄球菌素5毫克/kg，每天一次+萬古霉素30毫克/kg，每天兩次(11)。剔除未被治療前血培養(yǎng)證實感染的兔子。另外，對包含在分析里的所有兔子進行解剖，通過動脈增殖體上進行性的或已存在的疾病狀態(tài)來判斷，以證實已患有心內(nèi)膜炎感染。
所有的治療都是靜脈內(nèi)給藥，持續(xù)三天。按一定間隔評價兔子的健康狀況。在最后的處理后18小時殺死兔子。取出大動脈增殖體，稱重，測定存活的細菌數(shù)，表達為log10CFU/克。測定的限制是102CFU/克(log10CFU/克＝2.0)。每克細菌的平均滴度與單向分析的變量進行比較。Student-Newman-Keuls試驗用來判斷多個比較。用Fisher精確概率法比較小鼠的無菌化程度。統(tǒng)計學上有意義的被定義為p≤0.05。
如表6所示，每天給予溶葡萄球菌素三次是最有效的治療。值得注意的統(tǒng)計數(shù)據(jù)是該處理能使一個兔子外的所有兔子的心臟瓣膜增殖體完全無菌。這遠遠優(yōu)于該感染模型里作為陽性對照的標準方案30毫克/kg萬古霉素，每天兩次。每天給予一次5毫克/kg溶葡萄球菌素不如每天給予三次的有效，但在減少增殖體上細菌數(shù)方面幾乎與萬古霉素的一樣好；事實上，效果不是統(tǒng)計學上不同于萬古霉素組。每天給予溶葡萄球菌素方案也可使一些動物的增殖體完全無菌。向標準的萬古霉素方案里每天加入一次溶葡萄球菌素會明顯降低平均細菌數(shù)，幾乎可達到每天3次的溶葡萄球菌素治療的水平。但是，就增殖體完全滅菌而言，每天三次的溶葡萄球菌素方案很清楚地優(yōu)于其它所有的方案。
表6溶葡萄球菌素抵抗兔子中金黃色葡萄球菌性心內(nèi)膜炎的效應

ap＜0.05，與未處理對照比較；bp＜0.05與萬古霉素相比；cp＝0.008相對于溶葡萄球菌素每天一次+萬古霉素在葡萄球菌的存在下也會發(fā)生腎臟膿腫。與未處理組相比每天三次給予溶葡萄球菌素會明顯減少細菌，溶葡萄球菌素組只是稍高于102CFU/克組織，對照組是稍低于108CFU/克。
動物觀察顯示，在治療循環(huán)早期用溶葡萄球菌素每天治療三次，所有的兔子都呈良好的健康狀態(tài)。
這些結(jié)果在以前研究的基礎(chǔ)上是不可預見的。特別是，從沒見過或報道過在該感染模型里用任何抗微生物劑可使所有的增殖體無菌。在治療期間相當短的時間里，3天里，發(fā)生滅菌的事實表明，溶葡萄球菌素體內(nèi)的作用極為迅速，這也提示，抗微生物的溶葡萄球菌素類似物能大大地改進患有嚴重葡萄球菌感染，需要迅速減少細菌負載的病人的治療效果。
上述數(shù)據(jù)顯示了溶葡萄球菌素類似物對金黃色葡萄球菌，包括MRSA(耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌)的作用。對甲氧苯青霉素和萬古霉素都有耐藥性的菌株已成為新的問題。在含糖肽的介質(zhì)里生長循環(huán)后選擇該類型的變體菌株。萬古霉素對該所得的菌株的MIC為8微克/毫升，如所報道的，在美國和日本，也對于從病人分離得到的天然形成的VISA菌株。(疾病控制和預防中心，發(fā)病率和死亡率每周報道，1997；46813-815)。若MIC低于或等于32微克/毫升，葡萄球菌分離物被認為對于萬古霉素是易感的，若MIC大于或等于32微克/毫升，則對萬古霉素完全有耐受性(臨床實驗室標準的國家委員會，1993。許可的標準M2-A5。抗微生物盤易感性試驗的執(zhí)行標準-第五版。臨床實驗室標準的國家委員會，美國賓夕法尼亞)。
如表7所示，溶葡萄球菌素在治療患由耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌的VISA菌株引起的感染的心內(nèi)膜炎的兔子的效果。
表7溶葡萄球菌素對由耐甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌的VISA菌株引起的兔子的心內(nèi)膜炎的作用

>*表達為平均值的log10**明顯優(yōu)于萬古霉素或較低劑量的溶葡萄球菌素(p＜0.05)。
為了抵抗VISA菌株，以5毫克/kg溶葡萄球菌素每天給予三次在減少大動脈增殖體里細菌負載數(shù)與萬古霉素一樣有效。以15毫克/kg溶葡萄球菌素每天給予兩次比標準劑量萬古霉素更有效(統(tǒng)計學上意義)，也比每天給予三次5毫克/kg溶葡萄球菌素更有效。此外，萬古霉素即使以30毫克/kg每天給予兩次也不能使試驗動物的心臟瓣膜增殖體完全滅菌。另一方面，每天給予三次溶葡萄球菌素可使一些動物里的增殖體完全滅菌。
兔子心內(nèi)膜炎模型現(xiàn)已被極良好地標準化，可作為抗微生物劑對治愈嚴重人體感染的能力的嚴格試驗來接受。以前研究中，在已建立的感染里使用溶葡萄球菌素顯示能有限地減少小鼠模型里腎臟的細菌負載，在狗心內(nèi)膜炎模型里心臟瓣膜和其它器官里的細菌負載，其劑量范圍是50-250mg/kg/處理。盡管以前研究中使用了高劑量，但沒有觀察到在治療嚴重葡萄球菌感染里所需的劑量的有效性。以前得到的結(jié)果沒有得到快速、實際上使所有心臟瓣膜無菌的結(jié)果，目前這在兔子心內(nèi)膜炎模型里用極溫和劑量的溶葡萄球菌素中已經(jīng)看見。
本文呈現(xiàn)的結(jié)果不僅表明了溶葡萄球菌素對金黃色葡萄球菌性心內(nèi)膜炎的有效性，也顯示了這類效應遠遠地優(yōu)于標準治療所預期的效果。目前的治療在處理導致組織不可逆轉(zhuǎn)損傷的對生命有威脅的感染中常常是無效的，因此需要迅速地減少細菌數(shù)，以預防這類損傷，以及感染轉(zhuǎn)移擴散至其它重要的器官。上述結(jié)果表明，溶葡萄球菌素類似物，單獨使用或與其它制劑一起使用時對這類感染可能是有效的。此外，基于這些結(jié)果和溶葡萄球菌素抗葡萄球菌的體外活性，可以預期溶葡萄球菌素類似物單獨使用或與其它制劑組合使用會有用地抵抗除了金黃色葡萄球菌意外的葡萄球菌菌種。適合與溶葡萄球菌素一起使用的制劑是萬古霉素和其它糖肽、利福平和其它利福霉素類，和有抗葡萄球菌活性的其它抗感染劑。
可使用的溶葡萄球菌素類似物不僅可用來治療溶葡萄球菌素性心內(nèi)膜炎，而且也可治療其它潛在致命的葡萄球菌疾病，如菌血癥和其它重要器官，如腎臟、肺部、皮膚和骨骼的感染。本發(fā)明的方法也能用來治療腦、傷口和假體裝置的感染。這些相同的方法可用于治療諸如骨髓炎等需要用目前使用的抗微生物劑長期治療的感染類型。本發(fā)明進一步擴展了溶葡萄球菌素在治療由對常規(guī)使用的抗生素有耐藥性的葡萄球菌引起的感染和疾病中的應用。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物中葡萄球菌感染的方法，包括對哺乳動物給予有效量的至少一種溶葡萄球菌素類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中溶葡萄球菌素類似物與至少一種其它抗微生物劑一起給予。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中其它抗微生物劑是利福平或糖肽。
4.一種治療選自心臟瓣膜、血液、腎臟、肺、骨骼和腦膜的至少一個器官或組織被葡萄球菌感染的方法，包括選擇患有至少一種所述疾病的哺乳動物，對所述的哺乳動物給予有效量的溶葡萄球菌素類似物。
5.一種治療與插管或假體裝置有關(guān)的葡萄球菌感染的方法，包括，選擇帶有這類感染的哺乳動物，對所述的哺乳動物給予有效量的溶葡萄球菌素類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素類似物是溶葡萄球菌素或?qū)υ谄咸亚蚓募毎陔钠暇厶抢锖拾彼岬臉蜴I顯示出分解蛋白的生物活性的溶葡萄球菌素的變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中感染是心內(nèi)膜炎。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中感染是骨髓炎。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中感染是菌血癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中類似物是溶葡萄球菌素。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中類似物是溶葡萄球菌素。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中類似物是溶葡萄球菌素。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中哺乳動物是人體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素感染至少對非溶葡萄球菌素的抗微生物劑有部分的耐藥性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中抗微生物劑是β-內(nèi)酰胺抗微生物劑或萬古霉素。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中β-內(nèi)酰胺是甲氧苯青霉素。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素類似物是重組產(chǎn)生的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中類似物是溶葡萄球菌素。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中類似物通過直接滴注、吸入或非胃腸道途徑給予。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中類似物通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)或膜內(nèi)給藥。
21.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中溶葡萄球菌素與至少一種其它抗微生物劑一起給藥。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中其它抗微生物劑是利福平或糖肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的方法，其中類似物以每劑不超過50毫克/kg給藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中給予類似物的量為0.5mg/kg/天-200mg/kg/天。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中給予類似物的量為3mg/kg/天-50mg/kg/天。
26..根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中給予類似物的量為3mg/kg/天-25mg/kg/天。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中給予類似物的量不大于45mg/kg/天。
28.一種治療溶葡萄球菌素感染的治療組合物，包括溶葡萄球菌素類似物和藥學上可接受的載體，所述的溶葡萄球菌素類似物對葡萄球菌的細胞壁肽葡聚糖里含甘氨酸的橋鍵有分解蛋白活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的治療組合物，其中組合物適合于人體非胃腸道給藥。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中組合物進一步包括第二種抗微生物劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中溶葡萄球菌素類似物是重組產(chǎn)生的。
全文摘要
溶葡萄球菌素顯示出是一種強有效的抗葡萄球菌制劑,它適合非胃腸道給予包括人體的哺乳動物。低劑量,級別為0.5—45mg/kg/天足以根除大多數(shù)葡萄球菌感染。溶葡萄球菌素也能抵抗諸如青霉素和萬古霉素的常規(guī)的抗生素有耐藥性的細菌。溶葡萄球菌素類似物,如變體和相關(guān)的酶顯示出相似的活性。
文檔編號A61P31/04GK1269727SQ98808669
公開日2000年10月11日 申請日期1998年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月23日
發(fā)明者B·P·戈爾茨坦, M·W·克林莫, R·P·諾維克, G·L·阿徹 申請人:Ambi股份有限公司