專利名稱：一種空前體脂質(zhì)體及其制備和在包封藥物在臨床中的應(yīng)用的制作方法
該發(fā)明涉及一種藥物制劑領(lǐng)域，更具體地說是一種加藥物溶液后，形成等滲的脂質(zhì)體混懸液的空前體脂質(zhì)體，為一種干燥的產(chǎn)品藥物制劑及用途專利。
脂質(zhì)體(Liposome)作為藥物載體，在藥物傳遞系統(tǒng)(Drug Delivery System)中的研究和應(yīng)用日益廣泛展開，但也存在一定的局限性。一般脂質(zhì)體混懸液以水分散體儲(chǔ)存，易水解的藥物穩(wěn)定性受到很大影響。由于磷脂易被氧化、粒子沉降、聚集、融合導(dǎo)致包封藥物泄漏等，這些因素使脂質(zhì)體分散系不能長(zhǎng)期存放。上述存在的不穩(wěn)定問題是脂質(zhì)體研究的重要課題；此外，注射用的脂質(zhì)體在生產(chǎn)過程高溫滅菌，將嚴(yán)重破壞其雙分子結(jié)構(gòu)和被包封的熱不穩(wěn)定、有活性的藥物。近年來，開展了凍融、凍干等方法制備脂質(zhì)體如L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體(EPA 0485 143A)，但存在制備中加入的活性藥物L(fēng)-門冬酰胺酶存在不必要的損失問題。除了上述脂質(zhì)體本身和制備上的限制外，它的應(yīng)用也受到限制，如另一種液態(tài)脂質(zhì)體Lipofecetin雖不包封藥物，但只適合體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，因毒性大而在體內(nèi)不能應(yīng)用。正因?yàn)檫@些脂質(zhì)體不足之處，限制了脂質(zhì)體的商品化應(yīng)用。為提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，將液態(tài)的脂質(zhì)體制備成固態(tài)儲(chǔ)存的脂質(zhì)體，使用前加水水合形成脂質(zhì)體而被應(yīng)用，這將避免與脂質(zhì)體混懸液有關(guān)的諸多問題。進(jìn)而，出現(xiàn)了前體脂質(zhì)體方面的研究。
國(guó)外目前常規(guī)制備的前體脂質(zhì)體均為包含某種藥物的制劑，雖然加水即可形成脂質(zhì)體，但在制備過程中，往往加入藥物，如BYUNG-NAK AHN，et al.，J.Microencapsulation，1995，12(4)363-365。O.P.KATARE，et al.，J.Microencapsutation，1995，12(5)487-493報(bào)道，這不利于制備那些不穩(wěn)定的具有活性的藥物的脂質(zhì)體。另外，由于大多數(shù)生物技術(shù)產(chǎn)品不耐熱，常規(guī)制備工藝易導(dǎo)致這類產(chǎn)品破壞失效，因此，有必要研制一種前景廣泛的新制劑，不把主藥包在里面，臨用時(shí)現(xiàn)配的空前體脂質(zhì)體愈加重要。
本發(fā)明的目的在于提供一種不僅能包封蛋白類藥物和核酸類藥物，并且能靜脈注射或其它途徑給藥，可以廣泛用于臨床的新前體脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明涉及的技術(shù)根據(jù)以往脂質(zhì)體的勻化法加以改進(jìn)，在制備過程中將中間品經(jīng)過滅菌，后冷凍干燥得乳白色產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明，空前體脂質(zhì)體基本組成為大豆磷脂和膽固醇(摩爾比為7∶3)。
實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)途徑主要有(1)、類脂溶液的配制將大豆磷脂和膽固醇(摩爾比為7∶3)，在溫?zé)釛l件下溶于磷酸緩沖液(含甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮)，通氮?dú)獗Ｗo(hù)下經(jīng)過組織搗碎機(jī)勻化，再通過高壓乳化30～60Mpa壓力5～10分鐘制成脂溶液，其中脂類濃度0.1-8％，甘露醇濃度0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮0.02-6％。
(2)、將上述類脂溶液擠壓過0.45μm聚碳酸酯微孔濾膜，得脂質(zhì)溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下灌封，100℃30分鐘流通蒸氣滅菌。
(3)、滅菌的脂質(zhì)溶液，在無(wú)菌條件下分裝于安瓿中，經(jīng)冷凍干燥，充氮?dú)夂笕鄯狻Ｖ频冒咨涨绑w脂質(zhì)體。
其中甘露醇還可以是蔗糖、乳糖、右旋糖苷、海藻糖或其它多糖。所制備的空前體脂質(zhì)體，其特征在于加入藥物溶液進(jìn)行水合包封形成藥物脂質(zhì)體混懸液，具有維持動(dòng)物或人體內(nèi)白細(xì)胞在正常水平的能力。
前體脂質(zhì)體(Proliposome)為一種干燥的產(chǎn)品，在加入水或藥物水溶液后，分散或溶解形成一個(gè)等滲脂質(zhì)體混懸液，適用于靜脈或其它途徑給藥的新型工藝制品。
采用藥用組成制備出不包封藥物的空前體脂質(zhì)體，既區(qū)別于由藥物和脂類組成的常規(guī)前體脂質(zhì)體，克服其包封藥物穩(wěn)定性問題(藥物本身降解或被氧化)；又區(qū)別于常規(guī)脂質(zhì)體混懸液，克服其混懸液穩(wěn)定性問題(與脂類相關(guān)或藥物從脂質(zhì)體中泄漏)適合包封多種藥物的前體脂質(zhì)體。
本發(fā)明通過空白前體脂質(zhì)體加入L-門冬酰胺酶液進(jìn)行水合包封，形成L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體混懸液，保持了較高的酶活性并有穩(wěn)定的包封率。所制備包封的L-門冬酰胺酶的脂質(zhì)體比原來L-門冬酰胺酶毒性降低、靜脈給藥(高、中)劑量抗腫瘤療效提高。即L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體(空白前體脂質(zhì)體加得)i.p.(7400，3700 KU/kg)能顯著延長(zhǎng)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210、P388的存活天數(shù)(P＜0.01)，其效果優(yōu)于L-門冬酰胺酶。另外，對(duì)小鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)無(wú)明顯影響；而L-門冬酰胺酶高劑量組(1000KU/kg)與對(duì)照組相比有顯著降低小鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)的作用(P＜0.05)。L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體對(duì)小鼠靜脈注射的急性毒性明顯小于L-門冬酰胺酶。細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，作用L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體于人或鼠的血液病細(xì)胞，經(jīng)光學(xué)顯微鏡和逶射電鏡觀察均有明顯變化。光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞變圓、生長(zhǎng)緩慢、結(jié)構(gòu)不清。電鏡觀察到癌細(xì)胞核縮小、異染色質(zhì)增多、部分核固縮、部分細(xì)胞膜斷裂、細(xì)胞不完整。特別是經(jīng)流式細(xì)胞儀DNA含量分析HL-60細(xì)胞系的G0/G1期細(xì)胞明顯增加、進(jìn)入S期細(xì)胞減少；而且L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組比L-門冬酰胺酶組S期細(xì)胞減少5-8％。P815細(xì)胞系的細(xì)胞增殖指數(shù)下降更顯著，L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組PI＝39.4％，對(duì)照組PI＝65％；HL-60、L1210細(xì)胞系L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡比例顯著增多，分別是18.19％、11.67％，對(duì)照組為2.68％、2.81％；前者增加8倍，后者增加5倍。這反映了L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體對(duì)體外腫瘤細(xì)胞作用更顯著。
本發(fā)明用以下實(shí)施例予以解釋，這些實(shí)施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
結(jié)合附圖完成的實(shí)施例

圖1空前體脂質(zhì)體L-門冬酰胺酶溶液形成脂質(zhì)體的透射電鏡照片(×250,000)圖2空前體脂質(zhì)體加L-門冬酰胺酶溶液形成脂質(zhì)體的粒經(jīng)分布圖3空前體脂質(zhì)體加L-門冬酰胺酶溶液形成脂質(zhì)體粒經(jīng)分布(2個(gè)月)圖4 空前體脂質(zhì)體加L-門冬酰胺酶溶液形成脂質(zhì)體粒經(jīng)分布(3個(gè)月)圖5 P815細(xì)胞對(duì)照組圖6 P815細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖7 P815細(xì)胞實(shí)驗(yàn)C組圖8 P815細(xì)胞實(shí)驗(yàn)B組圖9 HL-60細(xì)胞對(duì)照組圖10HL-60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖11L1210細(xì)胞對(duì)照組圖12L1210細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖13K652細(xì)胞對(duì)照組圖14K652細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖15P815細(xì)胞對(duì)照組圖16P815細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖17P815細(xì)胞實(shí)驗(yàn)C組圖18HL-60細(xì)胞對(duì)照組圖19HL-60細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖20L1210細(xì)胞對(duì)照組圖21L1210細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A組圖22細(xì)胞增殖指數(shù)圖實(shí)施例1.本發(fā)明通過空白前體脂質(zhì)體500mg，分別加入L-門冬酰胺酶液(2mg/ml)10ml進(jìn)行水合包封，形成L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體混懸液，所制備包封的L-門冬酰胺酶的脂質(zhì)體用SephadexG 200凝膠柱測(cè)定包封率，見表1本發(fā)明制備的前體脂質(zhì)體對(duì)L-門冬酰胺酶的包封率在46.2±0.99(％)～52.2±1.25(％)之間.三個(gè)批號(hào)的變異系數(shù)(RSD％)均小于3％。
實(shí)施例2、L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體在人血清中活力保持率考察空前體脂質(zhì)體經(jīng)L-門冬酶胺酶溶液形成L-門冬酰胺酶混懸液，由SephadexG 200分離得到含L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體洗脫液，與人血清混合，37℃貯存.在0、6、12、18、24、30、36、42、48小時(shí)測(cè)定酶活力，計(jì)算酶活力保持率。見表2經(jīng)48小時(shí)，在人血清中(37℃)L-門冬酰胺酶活力保持率良好為90.3％實(shí)施例3、L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體的粒經(jīng)分布將空前體脂質(zhì)體加L-門冬酰胺酶溶液，水合得到脂質(zhì)體混懸液，用透射電鏡照相(圖1)庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(圖2)，表明脂質(zhì)體粒經(jīng)分布在0.662±0.0792um范圍，變異系數(shù)為12％。(66141個(gè)粒子統(tǒng)計(jì)95％可信限0.661～0.662um)L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體混懸液，在4℃儲(chǔ)存2個(gè)月后，粒經(jīng)分布在0.684±0.1um范圍，變異系數(shù)為14.6％(42508個(gè)粒子統(tǒng)計(jì)95％可信限0.683～表1 空前體脂質(zhì)體形成L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體的包封率批 號(hào)包 封 率 平均包封率 變異系數(shù)(RSD)N＝6％ ％±SD ％50.849.553.296072701 51.0±1.212.3750.650.951.049.248.447.296072702 48.2±0.992.0648.249.346.452.353.553.296072903 52.2±1.252.3950.252.951.4表2 L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體在人血清中活力保持率(37℃)時(shí)間(h)0 6 12 18 24 30 36 42 48活力664.2 653.1 644.3 637.0 634.5 629.6 618.5 612.3 600.1(單位)活力保持率10098.3 97.0 95.995.594.893.1 92.1 90.3(％)0.685um)圖3。L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體經(jīng)4℃儲(chǔ)存3個(gè)月后，粒經(jīng)分布在0.745±0.179um范圍內(nèi)，(統(tǒng)計(jì)粒子數(shù)目55277個(gè)，95％可信限0.744～0.747um)圖4，變異系數(shù)24.1％實(shí)施例4.L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210生命延長(zhǎng)作用取DBA/2小鼠18～22g，雌雄各半，80只，按移植性腫瘤研究法接種L1210腹水瘤，按種后隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半，分別按以下三個(gè)劑量給藥L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體(按L-門冬酰胺酶計(jì)7400，3700，1850KU/kg)，L-門冬酰胺酶注射液(7400，3700，1850KU/kg)；另設(shè)生理鹽水空白對(duì)照組(0.9NaCl，0.4ml/20g)及阿霉素注射劑(2mg/kg)組，于接種后24h腹腔注射，每天一次，共給藥10天，給藥后觀察荷瘤DBA/2小鼠存活天數(shù)(存活60天以上小鼠按60天計(jì))，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)(t檢驗(yàn))處理.試驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 與生理鹽水空白對(duì)照表組相比L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體(L-ASNaseliposomes)及L-門冬酰胺酶(L-ASNase))及阿霉素(DR)皆能顯著延長(zhǎng)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病的存活天數(shù)(P＜0.01)，對(duì)L1210的生命延長(zhǎng)作用DR作用最強(qiáng)，其生命延長(zhǎng)率為265.9％；其次為L(zhǎng)-門冬酰胺酶脂質(zhì)體，其生命延長(zhǎng)率最高達(dá)184.7％。L-ASNase作用最弱，其生命延長(zhǎng)率最高為132.9％.L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體與相同劑量的L-門冬酰胺酶相比，其高、中劑量組(7400，3700KU/kg)皆有顯著延長(zhǎng)L1210小鼠的存活天數(shù)作用(P＜0.05)，試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果相近，生命延長(zhǎng)率計(jì)算如下式生命延長(zhǎng)率＝(T-C)/C×100％式中C為對(duì)照組平均生存天數(shù)；T為給藥給平均生存天數(shù).結(jié)果見表3實(shí)施例5 L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病P388的生命延長(zhǎng)作用取DBA/2小鼠18～22g，雌雄各半，80只，按移植性腫瘤研究法接種P388腹水瘤，接種后，隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半，分別按以下劑量給藥L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體(按L-ASNase計(jì)7400，3700，1850KU/kg)；L-門冬酰胺酶注射劑(7400，3700，1850KU/kg)；另設(shè)生理鹽水空白對(duì)照組(0.9％NaCl，0.4ml/20g)及阿霉素注射劑(20mg/kg)組，于接種后24小時(shí)腹腔注射，每天一次，連續(xù)10天，給藥后記錄荷瘤DBA/2小鼠平均生存時(shí)間(存活60天以上小鼠按60天計(jì))，計(jì)算給藥組生命延長(zhǎng)率，并分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)(t檢驗(yàn))處理.試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與生理鹽水空白對(duì)照組相比，L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體、L-門冬酰胺酶及阿霉素皆均能顯著地延長(zhǎng)移植小鼠淋巴細(xì)胞白血病P388的存活天數(shù)(P＜0.01).對(duì)P388的生命延長(zhǎng)作用阿霉素作用最強(qiáng)，生命延長(zhǎng)率為253.4％，其次為L(zhǎng)-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體其生命延長(zhǎng)率最高達(dá)183.3％，L-門冬酰胺酶作用最弱，其生命延長(zhǎng)率最高為132.1％.與相同劑量的L-門冬酰胺酶注射劑相比，L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體高、中劑量組(7400、3700KU/kg)皆有顯著延長(zhǎng)P388小鼠的存活天數(shù)(P＜0.05).試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果相近.結(jié)果見表4.實(shí)施例6 L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)正常小鼠體重、外周血中白細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)的影響表3L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210的平均生存時(shí)間影響(i.p.)(×±SD，n＝10)實(shí)驗(yàn)cnt 制劑 動(dòng)物劑量平均生存 延長(zhǎng)率批號(hào) 種類 數(shù)目KU/kg 時(shí)間(天) (％)對(duì)照組 10 8.5±1.57L-門冬酰胺酶 10 7400 24.2±4.16△△***184.7脂質(zhì)體 10 3799 18.7±3.68△△***120.010 1850 12.5±3.81***47.096072701L-門冬酰胺酶10 7400 19.8±4.73***132.9注射液10 3700 15.1±3.84***77.610 1850 11.8±3.26***38.8阿霉素10 2mg 31.1±7.87***265.9對(duì)照組 10 8.6±1.4310 7400 24.3±4.24△△***182.6L-門冬酰胺酶10 3700 18.6±3.43△△***116.3脂質(zhì)體10 1850 12.3±3.65***43.096072702L-門冬酰胺酶 10 7400 19.5±4.43***126.7注射液 10 3700 15.2±3.49***76.710 1850 11.5±2.80***33.7阿霉素 10 2mg29.6±6.01***244.2對(duì)照組 10 8.6±1.5210 7400 23.9±4.12△△***177.9L-門冬酰胺酶10 3700 18.9±3.63△△***119.8脂質(zhì)體10 1850 10.6±3.14 23.396072703L-門冬酰胺酶 10 7400 19.3±4.14***124.4注射液 10 3700 14.7±3.93***70.910 1850 9.7±3.0512.8阿霉素 10 2mg 30.4±8.10***253.5*** p＜0.01，與對(duì)照組相比△△ p＜0.05，與同劑量的L-門冬酰胺酶注射液相比表4 L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病P388的平均生存時(shí)間影響(i.p)(×±SD，n＝10)實(shí)驗(yàn) 制劑 動(dòng)物劑量 平均生存延長(zhǎng)率批號(hào) 種類 數(shù)目KU/kg 時(shí)間(天)(％)對(duì)照組 10 8.9±1.1010 7400 24.5±4.97△△***175.3L-門冬酰胺酶10 3700 18.8±3.55△△***111.2脂質(zhì)體10 1850 12.7±3.5942.796072701L-門冬酰胺酶10 7400 19.9±4.75***123.6注射液 10 3700 15.3±3.83***71.910 1850 11.9±3.01***33.7阿霉素 10 2mg 30.9±7.53***247.1對(duì)照組 10 8.4±1.3510 7400 23.8±3.60△△***183.3L-門冬酰胺酶10 3700 18.5±3.44△△***120.2脂質(zhì)體 10 1850 12.2±2.94***45.29607270210 7400 19.5±4.50***132.1L-門冬酰胺酶10 3700 15.3±3.37***82.1注射液10 1850 11.7±2.95***39.3阿霉素 10 2mg 29.6±6.26***252.4對(duì)照組 10 8.6±1.43L-門冬酰胺酶10 7400 23.4±3.94△△***172.1脂質(zhì)體 10 3700 18.4±3.51△△***114.010 1850 10.8±3.01 25.696072903L-門冬酰胺酶10 7400 19.5±4.09***126.7注射液10 3700 15.0±3.64***74.410 1850 10.4±2.87 20.9阿霍素 10 2mg 30.4±7.96***253.4*** p＜0.01，與對(duì)照組相比△△ p＜0.05，與同劑量的L-門冬酰胺酶注射液相比表5 L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體對(duì)小鼠外周血細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)的影響 (i.v.) (×±SD，n＝10)劑量 小鼠平均體重(克) 紅細(xì)胞血小板數(shù)目制劑(ku/kg)給藥前 給藥后 數(shù)目/mm3109/升對(duì)照組 19.3±1.3 25.8±2.4 7696±2130274±7410000 19.2±1.3 24.6±1.8 5781±2016256±57L-門冬酰胺酶500019.5±1.4 25.9±2.0 7436±2083267±68脂質(zhì)體250019.0±1.1 26.3±2.4 7854±2169279±8110000 19.3±1.3 23.8±1.9 5196±0.23**218±61**L-門冬酰胺酶500018.9±1.1 25.6±2.1 6924±2007269±71注射液250019.0±1.2 26.0±2.2 7564±2148270±63**P＜0.05，與對(duì)照組相比取昆明種小鼠18～22g，70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半，設(shè)生理鹽水空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)按以下劑量L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體(按L-ASNase計(jì)10000、5000、2500KU/kg)L-門冬酰胺酶注射劑(10000、5000、2500KU/kg)；腹腔注射給藥體積為0.4/20Gg每天一次，連續(xù)10天，于停藥后第一天稱重，并由眼眶靜脈取血，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)(t檢驗(yàn))處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，L-門冬酰胺醇高劑量組(1000KU/kg)有顯著降低小鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)的作用(P＜0.05)，而L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體對(duì)小鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)及血小板數(shù)無(wú)明顯影響。L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組及L-門冬酰胺酶組對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。實(shí)施例7 L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體的急性毒性實(shí)驗(yàn)—最大耐受量的測(cè)定取18～22g昆明種小白鼠20只，雌雄各半，尾靜脈注射給藥(與臨床用藥一致)，給藥劑量為給以最大藥物濃度(4000KU/ml)，最大靜脈注射體積(0.5ml/20g)給藥一次，給藥后每天觀察記錄小鼠活動(dòng)、死亡情況，共觀察14天，于給藥后的第15天稱小鼠體重，并計(jì)算體重增長(zhǎng)率。
給藥后觀察14天，小鼠未出現(xiàn)死亡和任何毒副作用，體重皆有所增加，雄性小鼠體重增長(zhǎng)率為44.39％。雌性小鼠體重增長(zhǎng)率為31.28％，見表6。
表6. L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體對(duì)小鼠體重的影響(i.v.)(×±sD，n＝10)
表明小鼠靜脈注射L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體的最大耐受量為10.0×105KU/kg，最大耐受量相當(dāng)于每日人臨床擬用劑量的5000倍。臨床人擬用量為200KU/kg，10.0×105KU/kg÷200KU/kg＝5000(倍)。
L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體(空白前體脂質(zhì)體臨用前加L-門冬酰胺酶溶液配得i.p.(7400，3700KU/kg)能顯著地延長(zhǎng)移植性小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210及P388的存活天數(shù)(P 0＜.01)其效果優(yōu)于L-門冬酰胺酶。對(duì)L1210小鼠和P388小鼠生命延長(zhǎng)率最高可達(dá)184.7％和183.3％。昆明種小白鼠20只，尾靜脈注射L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體，給藥劑量為以最大藥物濃度(40000KU/ml)，最大靜脈注射體積(0.5ml/20g)給藥一次，觀察14天，小鼠未出現(xiàn)死亡和任何毒副作用，雄性小鼠體重增長(zhǎng)率為44.39％，雄性小鼠體重增長(zhǎng)率為31.1％，L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體的最大耐受量為10.0×105KU/kg。其急性毒性明顯小于L-門冬酰胺酶。實(shí)施例8 L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用L-門冬酰胺酶為治療白血病和惡性淋巴瘤的有效藥物。有關(guān)L-門冬酰胺酶前體脂質(zhì)體的研究報(bào)道尚少。本文重點(diǎn)研究體外腫瘤細(xì)胞藥物作用后的情況，進(jìn)行了光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞增殖率及流式細(xì)胞儀DNA含量分析。進(jìn)而研究該藥的作用，以便指導(dǎo)臨床合理用藥。
細(xì)胞系HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病P815小鼠漿細(xì)胞瘤，L1210小鼠淋巴白血病；K562人紅白血病細(xì)胞。
L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體(由前體脂質(zhì)體形成).
培養(yǎng)液 RPMI 1640美國(guó)DIBCO公司，內(nèi)含10％小牛血清。青霉素100U/ML對(duì)照組加培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)A組(L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體)，分別含酶2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml；實(shí)驗(yàn)B組加空白脂質(zhì)體(由前體脂質(zhì)體形成)；實(shí)驗(yàn)C組加L-門冬酰胺酶.實(shí)施例8.1.細(xì)胞培養(yǎng)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×105個(gè)細(xì)胞/ml懸液按種到25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使A、C組含藥物30μg/ml.A、B組含脂類1mg/ml。置于37°孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。再將細(xì)胞取出、離心3000轉(zhuǎn)/分×8分鐘，棄上清，加4％戊二醛固定2hr后。用雙蒸水沖洗，梯度酒精脫水、樹脂Epon-812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切出薄片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，H-300透射電鏡觀察。實(shí)施例8.2. 四甲基偶氮唑鹽(Sigma)MTT比色法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×105個(gè)細(xì)胞/ml濃度加入40孔酶標(biāo)板內(nèi)，100μl/孔，再加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)液倍比稀釋的待測(cè)藥品，100μl/孔培養(yǎng)上清，加入MTT溶液(其濃度5mg/ml)30μl/孔，于振蕩品上振蕩1分鐘，放置5％CO237℃育4小時(shí)，取出吸棄上清，加0.4mol/L鹽酸異丙醇100μl/孔，振蕩后在酶標(biāo)儀上570nm讀取A值。實(shí)施例8.3. 流式細(xì)胞儀DNA含量分析將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)成5×105個(gè)細(xì)胞/ml懸液，接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入A、B、C組藥物，使A、C組成含藥物30μg/ml，A、B組含脂類1mg/ml。置5％CO237℃孵育24小時(shí)，取出離心，棄上清，加固定液，后用碘化丙錠進(jìn)行DNA染色，用流式細(xì)胞儀(FCM)，作DNA細(xì)胞周期采樣分析(每份樣品測(cè)5000個(gè)細(xì)胞)。資料均經(jīng)Cellfit軟件收集、貯存和分析。
實(shí)施例9 四種細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)A、B、C三組藥物作用24小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見表7、8光學(xué)顯微鏡照片見圖5～14。
表7P815細(xì)胞形態(tài)對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)A組 實(shí)驗(yàn)B組 實(shí)驗(yàn)C組細(xì)胞顯上皮形， 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢， 細(xì)胞顯上皮形， L-門冬酰胺酶作用園形貼壁生長(zhǎng)， 大多數(shù)細(xì)胞變園，園形貼辟生長(zhǎng)， 后，與A組相比較細(xì)胞輪廓清楚， 細(xì)胞大小不一， 與對(duì)照組差別不大。
分細(xì)胞變園，生長(zhǎng)生長(zhǎng)旺盛。
結(jié)構(gòu)松散。
迅速。
表8 HL-60、L1210、K562細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞系 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)A組細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，輪廓清楚，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)大小HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。
不一，核染色質(zhì)濃集。L1210細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，輪廓清楚，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，結(jié)構(gòu)園而透亮松散，核染色質(zhì)濃集。。K562細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，輪廓清楚，細(xì)胞輪廓不請(qǐng)，園而透亮。
形態(tài)大小不一。實(shí)施例10透射電鏡觀察結(jié)果見表9、10，附超薄切片照片見圖15～21。
表9 透射電鏡觀察P815細(xì)胞超薄切片對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)A組 實(shí)驗(yàn)B組癌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，常染色 部分癌細(xì)胞核縮小，趨向固縮， 癌細(xì)胞與對(duì)照組比較，質(zhì)豐富，核仁明顯，胞質(zhì)中 胞質(zhì)中出現(xiàn)大小的空泡、脂滴 無(wú)明顯該變。胞質(zhì)中含少量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，及髓樣小體，有些細(xì)胞膜不 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略增多。細(xì)胞表面有短小微絨毛。完整。
表10 透射電鏡觀察HL-60、L1210細(xì)胞超薄切片細(xì)胞系 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)A組HL-60 癌細(xì)胞核仁形態(tài)不規(guī)則，核仁大癌細(xì)胞和縮小，異染色質(zhì)而明顯，有些邊集，常染色質(zhì) 增多，部分核固縮。核仁豐富，胞質(zhì)少，含大量游離不明顯，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，核糖體。其它細(xì)胞系少，細(xì)胞 脂滴及髓樣小體，部分細(xì)胞膜表面有少量短小微絨毛。
斷裂。細(xì)胞不完整。
L1210癌細(xì)胞為圓形及不規(guī)則形。核大癌細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，有些形狀不規(guī)則，常染色質(zhì)豐富。
趨向固縮、碎裂。胞質(zhì)中出現(xiàn)胞質(zhì)中含大量游離核糖體、少量空泡、質(zhì)滴、裂隙，胞膜不完粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，細(xì)胞表面無(wú)缺整，大量癌細(xì)胞壞死、崩解。
隙有少量短小微絨毛。
實(shí)施例11 四甲基偶氮唑鹽MTT比色法測(cè)定結(jié)果表明細(xì)胞受到L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體作用后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。隨著A組L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體濃度增加，增殖率降低。但P815細(xì)胞經(jīng)(空白)脂質(zhì)體作用與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。L-門冬酰胺酶對(duì)P815細(xì)胞(C組)不如加L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組(A組)明顯。見圖22。實(shí)施例12 細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，細(xì)胞增殖周期時(shí)相分析和凋亡比率變化。見表11、12。
表11 細(xì)胞增殖周期時(shí)相分析細(xì)胞系 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組G0/G1S G2M G0/G1SG2MHL-6029.761.6 8.6 41.249.9 9L121021.067.5 11.5 38.160.0 1.9P815 34.659.9 5.5a.60.613.8 25.6b.16.975.9 7.2c.59.019.6 21.4a. P815實(shí)驗(yàn)A組 b. P815實(shí)驗(yàn)B組 c. P815實(shí)驗(yàn)C組從表11說明，藥物A、C組即L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體(經(jīng)前體脂質(zhì)體水合而得)A組和L-門冬酰胺酶(C組)與腫瘤細(xì)胞作用后，G0/G1期細(xì)胞量明顯增加，而進(jìn)入S期的細(xì)胞明顯減少。
表12 腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞凋亡比例細(xì)胞系對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組PI (％) RA (％) PI (％) RA (％)HL-669.6 2.6858.9 18.19L1210 79.0 2.8161.9 11.67P81565.0 1.6a. 39.4 1.17b. 83.1 0.48c. 41.0 2.10a.P815實(shí)驗(yàn)A組b.P815實(shí)驗(yàn)B組 c.P815實(shí)驗(yàn)C組表12所示增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，表示腫瘤細(xì)胞群體的增殖程度，細(xì)胞周期中S、G2M期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，依據(jù)公式PI＝(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)可得出增殖指數(shù)L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體組和L-門冬酰胺酶組(A、C組)的PI值顯著下降。HL-60、L1210細(xì)胞凋亡比例顯著增多。P815細(xì)胞與對(duì)照組相比差異不顯著。
以上技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)該產(chǎn)品加藥物溶液，即可溶解，空前體脂質(zhì)體能在體內(nèi)應(yīng)用，且以固態(tài)形式儲(chǔ)藏，提高了脂質(zhì)體的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，室溫放置或低溫4℃儲(chǔ)存2.0年仍有良好外觀和穩(wěn)定性?？涨绑w脂質(zhì)體不僅能包封蛋白類藥物如L-門冬酰胺酶，而且能包封核酸類藥物如反義寡核苷酸以及普通小分子藥物如阿霉素；是一種能攜帶多種藥物的載體制劑。并且一定程度上解決了大分子藥物注射劑半衰期較短的問題。將生物技術(shù)產(chǎn)品制成低免疫原性的制劑，進(jìn)而減少過敏反應(yīng)，延長(zhǎng)體內(nèi)作用時(shí)間、降低劑量減少副作用。同時(shí)，使空前體脂質(zhì)體工業(yè)化生產(chǎn)或臨床藥物應(yīng)用質(zhì)量進(jìn)一步提高成為可能。
權(quán)利要求
1.一種空前體脂質(zhì)體，其特征為一種白色干燥產(chǎn)品，主要由大豆磷脂和膽固醇組成，脂類濃度為0.1-8％，甘露醇濃度為0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮為0.02-6％。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1，其中大豆磷脂和膽固醇的最佳摩爾比為7∶3。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1，其中大豆磷脂還可以是蛋黃卵磷脂或其它脂類。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1，膽固醇還可以是二甲基氨基乙氨基羧基膽固醇，或者是膽固醇的其它修飾物。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1，甘露醇還可以是蔗糖、乳糖、右旋糖苷、海藻糖或其它多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1的空前體脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于(1)類脂溶液的配制將大豆磷脂和膽固醇(摩爾比為7∶3)，在溫?zé)釛l件下溶于磷酸緩沖液(含甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮)，通氮?dú)獗Ｗo(hù)下經(jīng)過組織搗碎機(jī)勻化，再通過高壓乳化30～60Mpa壓力5～30分鐘制成類脂溶，其中脂類濃度0.1-8％，甘露醇濃度0.25-6.5％，聚乙烯吡咯烷酮0.02-6％。(2)將上述類脂溶液擠壓過0.45μm聚碳酸酯微孔濾膜，得脂質(zhì)溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下灌封，100℃30分鐘流通蒸氣滅菌。(3)滅菌的脂質(zhì)溶液，在無(wú)菌條件下分裝于安瓿中，經(jīng)冷凍干燥，充氮?dú)夂笕鄯?。制得白色空前體脂質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1的空前體脂質(zhì)體，其特征在于加入藥物溶液進(jìn)行水合包封形成藥物脂質(zhì)體混懸液。
7.根據(jù)權(quán)利要求書1的空前體脂質(zhì)體，其特征在于加入藥物溶液進(jìn)行水合包封形成藥物脂質(zhì)體混懸液，具有維持動(dòng)物或人體內(nèi)白細(xì)胞在正常水平的能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求書1的空前體脂質(zhì)體，其特征在于加入L-門冬酰胺酶溶液進(jìn)行水合包封形成脂質(zhì)體混懸液。
9.根據(jù)權(quán)利要求書6所述的L-門冬酰胺酶脂質(zhì)體混懸液，可以包封蛋白類藥物和核酸類藥物，并且能靜脈注射、口服、肌注等給藥途徑用于臨床。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域,采用藥用組成制備不包封藥物的空前體脂質(zhì)體,不僅能包封生物大分子或生物技術(shù)產(chǎn)品,如蛋白質(zhì)、核酸類藥物,而且能包封化學(xué)藥物。這種制劑不僅可適用于靜脈注射、口腔、眼部、鼻腔、皮膚給藥和口服給藥,而且可以廣泛用于其它途徑給藥,同時(shí)可以臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/36GK1255331SQ98125058
公開日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1998年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者王弘 申請(qǐng)人:王弘