專利名稱：一種預(yù)防及治療惡性腫瘤的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物制品類藥物的技術(shù)領(lǐng)域，即提供一種治療或預(yù)防惡性腫瘤的高新技術(shù)產(chǎn)品商品名為協(xié)會葡新康。現(xiàn)有技術(shù)中對如何殺傷惡性腫瘤細的報道較多，名抒已見，但最終結(jié)果不能仿人感到滿意。如下列三篇文獻。
葡萄球菌腸毒素目標免疫治療的應(yīng)用簡介葡萄球菌分泌的外毒素在中毒性休克和食物中毒中起著關(guān)鍵的作用，近來人們認識到這種情況所產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)在一定程度上依賴于葡萄球菌碭毒素SEs對T細胞的激活作用。為利用SEs在治療上的潛在生物性，我們在SEs和靶T淋巴細菌單克隆抗體(MAb)之間構(gòu)造了一些混合分子以破壞被MAb識別的細胞。這些混合分子的最初特點表明他們代表了新一簇抗腫瘤抗原。MCAb與SAg偶聯(lián)物或其融合蛋白抗腫瘤作用的實施研究進展提要超抗原(SAg)是能刺激T細胞增殖并且使之釋放細胞因子的細菌或病毒產(chǎn)物。其中，葡萄球菌腸毒素(SE)A與腫瘤單克隆抗體(McAb)相偶聯(lián)，或者得利用基因作用。實驗研究結(jié)果表明，它很可能成為一種型的、有效的腫瘤免疫導(dǎo)向治療劑。但是目前沿未見臨床應(yīng)用的報道。本文綜述了MaAb與SAg偶聯(lián)物以及它位的融合。蛋白在體外細胞水平和動物實驗水平抗腫瘤作用的實驗研究進展。
革蘭氏陽性球菌的超抗原和假超抗原摘要超抗原利用T淋巴細胞刺激的精細的和獨物的機制。原型超抗原是熱原性外毒素，它是由金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌產(chǎn)生的。細菌的多種蛋白都是超抗原。在大多數(shù)情況下，這些蛋白質(zhì)超抗原是間接的。革蘭氏陽性球菌產(chǎn)生超抗原而不是熱原性外毒素的結(jié)果，本文特別進行討論。有證據(jù)表明，金黃色葡萄菌的表皮松懈毒素和化膿性鏈球菌的熱原外毒素B及蛋白M不是超抗原。本文描述了超抗原的標準。
本發(fā)明的目的提供一種存活的金黃色葡萄球菌掊養(yǎng)基生成的代謝產(chǎn)物含有腸毒素即葡萄球菌腸毒素，其提存量大，可能普遍激活T細胞5-10％最高達40％，抑瘤率在80％以上，最終具有殺傷惡性腫瘤細胞的作用。
本發(fā)明的另一個目的是，公開(協(xié)合莆新康)產(chǎn)品，其含義是利用腸毒素在制備治療腫瘤微生物藥即治胃癌的效果。
本發(fā)明的目的可以通過如下方案來實施

圖1是本發(fā)明的工藝流程圖后補。
金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生腸毒素是一組有高度生物活性的蛋白質(zhì)，在免疫學(xué)中現(xiàn)已被確認是一種內(nèi)型的超級抗原，簡稱SAg。一般蛋白質(zhì)抗原通常須經(jīng)適度消化；在免疫應(yīng)答中SAg的另一個重要特點是它是一種非常強大的T細胞刺激抗原，一般說來，SAg能激活所有T細胞數(shù)的5-10％，甚至40％，SAg是一類具有雙功能的分子，它象鉗子樣夾住(Marrack和Kap-pler)象橋梁一樣連接Kal-11ancl。本發(fā)明的關(guān)鍵點是公開提純和了解腸毒素的機理及功能即葡康屢產(chǎn)品中含有腸毒素這一有效成份。金葡菌引起食物中毒是比較常見的腸胃病，即金葡菌是一種有眾多致病因素的病原菌即金葡菌產(chǎn)毒株是較為常見的。本發(fā)明的關(guān)鍵點可以概括為提供一個新的存活菌株提煉出更大量的腸毒素在治療惡性腫瘤中有效果如胃癌。
本發(fā)明的另一個關(guān)鍵點是腸毒素在制備治療癌癥惡性(腫瘤)的藥物中的應(yīng)用，即試圖使用腸毒素(就是本發(fā)明保護的SE1菌株staphy10coccus，aureus及金葡菌腸毒素(Staphy10cccal，enterotoxin，SE)的代謝產(chǎn)物治療癌癥探索，SE的病理損害主要由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量細胞因子和芙些代謝產(chǎn)物所致，這是細胞因子對機體造成不利的一面，但是如果使用得當，采用合適的SE劑量和劑型使之在機體內(nèi)產(chǎn)生有利的效應(yīng)，就等于用治療腫瘤和感染，如發(fā)明人正在研制生產(chǎn)的葡康靈在理論上是可行的，如瑞典隆德大學(xué)和法瑪西亞腫瘤中心在這方面的理論建樹；又如Kallancl發(fā)表的一篇題為“金葡菌腸毒素用作定靶免疫治療”而在實踐試驗中效果是相當可喜的，即葡新康不但在腸胃藥中有效，而且在腫瘤方面可達到殺傷腫瘤細胞的作用，抑瘤率80％以上。這一提法即本發(fā)明的創(chuàng)造性，通過臨床來驗證，如提供的臨床見附件。
(1)菌種試驗用菌種FRI 100(SEA) FRI 5-6 (SEB)FRI 137(SECI)FRI 361 (SEC2)FRI 315(SED) FRI 326 (SEE)(2)培養(yǎng)基根據(jù)文獻報導(dǎo)選用DOLman產(chǎn)毒培養(yǎng)基，略加改變；由研究所培養(yǎng)基室制備(3)腸毒素及抗血清，腸毒素按照其特性進行培養(yǎng)產(chǎn)毒提純精制，SDS-PAGE測定純定，測定濃度然后，免疫家兔制備抗血清；(4)酶結(jié)合物的制備，辣根過氧化物酶(RZ≈3.0)為上海產(chǎn)品，標記方法用改良過碘酸鈉法制備，以硫酸按提純，測定常規(guī)工作衡釋變后，分裝備用；(5)ELISA雙抗體夾心法用100ml抗體IgG包被塑料小杯，置4℃過夜，以洗滌液洗滌3次，每孔加腸毒素100ml，37℃30分鐘，充分洗滌5次，加底物100ml室溫，30分鐘比照比色記錄結(jié)果，或在620℃測定其值。
技術(shù)要點及主要質(zhì)量技術(shù)指標(1)建立了金葡萄產(chǎn)毒，毒素提純精制的工藝程序和方法，制備了A-E各型腸毒素。
(2)比較試驗了各廠家比色用板，并進行了各種比色方法論證比較。
(3)初步確立了檢測金葡萄腸毒素酶標試劑盒質(zhì)量控制指標敏感度(0097mg/ml)，特異性(＞9％)及效期(6個月)。
(4)建立了試劑制造及檢定規(guī)(草案)以及記錄的表格化。
(5)改進和發(fā)展了檢測腸毒素用ELISA技術(shù)工藝和方法，更簡便快速得出結(jié)果。
(6)與國內(nèi)外參考試劑進行比較其特異性和敏感性，結(jié)果滿意。
(7)通過比較試驗，會同質(zhì)管部門檢定結(jié)果證實，自制試劑優(yōu)于參考試劑，同意送檢定所檢定。
本發(fā)明的積極效果利用“SE”作為治療藥物具有其它藥物不可比擬的優(yōu)點1.SE的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序例已被闡明；2.SE較能抗消化并且耐熱；3.SE用SAg一樣只需要使用很小的SE劑量就可以引發(fā)T細胞應(yīng)答。
本文中“SE”是葡新康的有效成份，即葡萄球菌腸毒素(Stap-hylococ-cal tnterotoxin SE)SAg是超抗原SuperantigensAg.
“T細胞”淋巴免疫細胞。
本發(fā)明檢索對比材料提實質(zhì)審查時一并提供。
權(quán)利要求
1.一種采用金黃色葡萄球菌SE1的代謝產(chǎn)物“腸毒素”治療或抑制惡性腫瘤的協(xié)合葡新康藥物，包括培養(yǎng)基的制備，菌種的培養(yǎng)，腸毒素的大量提取，酶結(jié)合物制備及雙體夾心法等程序，其特征在于葡新康是葡萄球菌腸毒素(SE)與腫瘤單殼隆抗體(MCAD)SH相偶聯(lián)，普遍激活T細胞5-40％能有效地殺傷腫瘤細胞，本發(fā)明的關(guān)鍵點是，提供一個新的存活的菌株，提煉出大量腸毒素在臨床上有相當可觀效果。所述的SE1微生物菌株(Staphg to coccus aureus)菌種保藏號(C1MCC-0292)中國微生物菌種保藏管委員會普通微生物中心。所述的葡萄球菌腸毒素學(xué)名(Staphgt-ococcaltnterotoxin，SE)有5個主要血清SEA，SEB，SEC，SED和SEE，所述的培養(yǎng)基通常采用Dolman配方主要是酪蛋白消化液用HCL水解為酪蛋白水解液可替代蛋白棟其具體程序如下(1)菌種試驗用菌種FRI 100 (SEA) FRI5-6 (SEB)FRI 137 (SECI)FRI361 (SEC2)FRI 315 (SED) FRI326 (SEE)(2)培養(yǎng)基根據(jù)文獻報導(dǎo)選用DOLman產(chǎn)毒培養(yǎng)基，略加改變；(3)腸毒素及抗血清，腸毒素按照其特性進行培養(yǎng)產(chǎn)毒提純精制，SDS-PAGE測定純定，測定濃度然后，免疫家兔制備抗血清；(4)酶結(jié)合物的制備，辣根過氧化物酶(RZ≈3.0)為上海產(chǎn)品，標記方法用改良過碘酸鈉法制備，以硫酸胺提純，測定常規(guī)工作衡釋變后，分裝備用；(5)ELISA雙抗體夾心法用100ml抗體IgG包被塑料小杯，置4℃過夜，以洗滌液洗滌3次，每孔加腸毒素100ml，37℃30分鐘，充分洗滌5次，加底液100ml室溫，30分鐘比照比色記錄結(jié)果，或在620℃測定；
2.按照權(quán)利要求1所述(協(xié)合葡新康)特征在于所述的葡新康含義是利用腸毒素，在制備治療惡性腫瘤藥中的應(yīng)用；即腸毒素的提純可以用來治療惡性腫瘤，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)將其制成微生物的制劑對胃癌有效果。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物制品類藥物的技術(shù)領(lǐng)域,即提供一種治療或預(yù)防惡性腫瘤的高新技術(shù)產(chǎn)品商品名為葡新康。提供一種存活的金黃色葡萄球菌與培養(yǎng)基生成的代謝產(chǎn)物含有腸毒素即葡萄球菌腸毒素,可能普遍激活T細胞5—10%,最高達40%,抑瘤率在80%以上,最終具有殺傷惡性腫瘤細胞的作用。本發(fā)明的關(guān)鍵點是,提供一個新的存活的菌株,提煉出大量腸毒素用來治療惡性腫瘤如胃癌。
文檔編號A61K35/74GK1243716SQ9810336
公開日2000年2月9日 申請日期1998年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月3日
發(fā)明者陳巨余 申請人:沈陽協(xié)合集團公司