專(zhuān)利名稱(chēng):預(yù)防和治療病毒感染的方法和配方的制作方法
本發(fā)明涉及對(duì)于受病毒，特別是受還原病毒感染或處于病毒感染威脅下的動(dòng)物的治療。進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)抵抗病毒感染的狀態(tài)的方法與對(duì)受還原病毒感染的人類(lèi)的治療。
本發(fā)明特別涉及由還原病毒感染導(dǎo)致的免疫缺陷的療法，進(jìn)一步說(shuō)，這些治療是對(duì)于那些被認(rèn)為與獲得的免疫缺乏綜合征(AIDS)有關(guān)的感染的療法。
愛(ài)滋病是一種可傳染的細(xì)胞免疫缺乏癥，其特征為機(jī)會(huì)(opportunistic)感染及出現(xiàn)某些惡性的疾病，如，明顯的卡氏肺囊蟲(chóng)肺炎及卡波濟(jì)氏肉瘤，而對(duì)于患這些病的患者又沒(méi)有其它可以分辨得出的致病原因。(1-3)。愛(ài)滋病的病癥表現(xiàn)似乎是由OKT4+T淋巴細(xì)胞子集(4)的耗盡而引起的深度淋巴細(xì)胞減少、擴(kuò)散性的皮膚無(wú)反應(yīng)性及對(duì)有絲分裂因子、抗原及同種異體細(xì)胞的增殖效應(yīng)的明顯減少。而同時(shí)體液免疫性卻相對(duì)地不受影響，日益增多的證據(jù)表明存在著超活性B-細(xì)胞增殖響應(yīng)，而其在因果關(guān)系上可能與愛(ài)滋病人的B-淋巴瘤的高發(fā)生率有關(guān)(5，6)。除了完全顯現(xiàn)綜合征外，一種流行性的相關(guān)疾病[愛(ài)滋相關(guān)綜合征(ARC)]也顯現(xiàn)出來(lái)，其特征為全身性的慢性淋巴結(jié)病變。這種綜合征同時(shí)具有許多流行病特性及免疫異常，而往往超出愛(ài)滋病的臨床表現(xiàn)。
最近的證據(jù)有力地表明一種親淋巴細(xì)胞的還原病毒是愛(ài)滋病及愛(ài)滋相關(guān)綜合癥的主要的病原因子。淋巴結(jié)病相關(guān)病毒(LAV)首先從患淋巴結(jié)病及愛(ài)滋病的病人的培養(yǎng)的淋巴結(jié)T細(xì)胞中分離出來(lái)也同樣從患愛(ài)滋病的病人和一對(duì)受嗜血性B(haemophilia B)(7-9)感染無(wú)癥狀的孿生雙胞胎的培養(yǎng)淋巴結(jié)T細(xì)胞中分離出來(lái)。一種類(lèi)似的病毒，被稱(chēng)為人類(lèi)T親淋巴性Ⅲ病毒(HTLV-Ⅲ)通過(guò)與受納T細(xì)胞系H9(10，11)進(jìn)行共培養(yǎng)而從許多愛(ài)滋病及愛(ài)滋病相關(guān)綜合癥患者的血樣中分離出來(lái)。最近從愛(ài)滋病患者身上分離出的LAV及HTLV-Ⅲ和相關(guān)還原病毒(12，13)，同時(shí)分別具有幾種重要的特征。病毒復(fù)制發(fā)生在體內(nèi)及體外的OKT4+淋巴細(xì)胞群中并且出現(xiàn)損傷細(xì)胞增殖以及細(xì)胞疾病的后果(8，10，14)有關(guān)。該病毒具有一個(gè)Mg2+依賴(lài)性的逆轉(zhuǎn)錄酶，顯現(xiàn)出與D型還原病毒相似的密集的圓柱形核的形態(tài)(8，13，15)并且可通過(guò)事實(shí)上有所有的愛(ài)滋病及愛(ài)滋病相關(guān)綜合癥患者血清中均可發(fā)現(xiàn)的抗體(8，13，16-21)來(lái)識(shí)別。HTLV-Ⅲ及LAV目前被確信為是同一病毒的不同株，這些株被稱(chēng)為人類(lèi)免疫缺乏癥病毒(HIV)。
患愛(ài)滋病或愛(ài)滋病相關(guān)綜合癥的患者的免疫功能遭到嚴(yán)重的損傷。然后，由HTLV引起的異常的精確性質(zhì)正有待繼續(xù)的研究。特別有興趣的是，HIV感染對(duì)這些患者的免疫細(xì)胞產(chǎn)生淋巴激活素的影響，及其對(duì)外源給與的淋巴激活素的響應(yīng)。對(duì)十六位愛(ài)滋病患者的T淋巴細(xì)胞分泌包括γ干擾素在內(nèi)的巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)物的能力進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果十四位患者不能產(chǎn)生有活性的淋巴激活素而有十三至十四位完全不能分泌γ干擾素。另外，愛(ài)滋病患者的巨噬細(xì)胞與γ干擾素在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，顯示出能增加抗微生物的性能，因而提高了這些細(xì)胞對(duì)外源給予的γ干擾素在體內(nèi)發(fā)生響應(yīng)的可能性(22，24)。
愛(ài)滋病患者的淋巴細(xì)胞據(jù)報(bào)導(dǎo)缺乏產(chǎn)生內(nèi)白細(xì)胞素-2(interleukin-2)的能力，內(nèi)白細(xì)胞素-2(interleukin-2)是一種淋巴激活素在T淋巴細(xì)胞增殖與分化過(guò)積中發(fā)揮作用并且刺激γ干擾素的產(chǎn)生(23)。
γ干擾素最終被發(fā)現(xiàn)對(duì)被泡狀口炎病毒(VSV)感染的細(xì)胞發(fā)揮直接的抗病毒作用，并加強(qiáng)一種細(xì)胞活性素對(duì)VSV感染細(xì)胞的作用(25)。該細(xì)胞活性素由這些作者們經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為一種多肽在此被作為腫瘤壞死α因子的多肽。同時(shí)參閱Eifel等著《Cell.Immun》47197-203(1979)。因而，對(duì)愛(ài)滋病進(jìn)行的免疫增補(bǔ)療法顯得有機(jī)會(huì)被采用，并且創(chuàng)立了對(duì)病人的臨床研究。
盡管對(duì)愛(ài)滋病人的淋巴激活素療法是有希望的，但是體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是令人失望的。與從體外實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相反，長(zhǎng)期靜脈注射重組體γ干擾素的治療療程似乎是對(duì)單細(xì)胞呼吸突發(fā)作用產(chǎn)生抑制作用而非增強(qiáng)(26)，對(duì)愛(ài)滋病用不同的劑量進(jìn)行內(nèi)白細(xì)胞素2(interleukin-2)或γ干擾素的靜脈注射而得到的結(jié)論是，體內(nèi)淋巴激活素療法對(duì)于愛(ài)滋病的治療沒(méi)有重大的價(jià)值(27)。事實(shí)上，在本發(fā)明以前，一種學(xué)派認(rèn)為，免疫激活作用或者免疫重建方法對(duì)愛(ài)滋病的療法事實(shí)上是“危險(xiǎn)的”，因?yàn)橛昧馨图せ钏貙?duì)細(xì)胞的激活作用被認(rèn)為會(huì)引起病毒的擴(kuò)散及T細(xì)胞的衰竭，因而加劇了疾病的進(jìn)程(28)。1986年6月Yamamoto等人(29)揭示了人類(lèi)α及β(而非γ)干擾素抑制，HIV病毒株的體外復(fù)制，但當(dāng)停止暴露于干擾毒時(shí)，被感染的細(xì)胞的病毒產(chǎn)量則增加了。這就進(jìn)一步說(shuō)明愛(ài)滋病的免疫療法是抗產(chǎn)生性(counter production)的。
最后，也意味著淋巴毒素是由HIV病毒感染的T細(xì)胞被病毒誘發(fā)的T細(xì)胞的內(nèi)源淋巴毒素基因的轉(zhuǎn)激活作用而(transactivation)產(chǎn)生的，因而導(dǎo)致了自身有毒性數(shù)量的淋巴毒素的分泌(35)。
干擾素用于預(yù)防或治療受諸如牛痘、風(fēng)疹、單純性皰疹、水痘-帶狀皰疹、小雞痘、細(xì)胞巨病毒、腺病毒、未分類(lèi)的RNA病毒、狂犬病病毒及乙型肝炎病毒感染的慢性、急性疾病和/或?qū)嶒?yàn)感染。慢性的細(xì)胞巨病毒感染經(jīng)證明難以用干擾素治愈，甚至用預(yù)防CMV的感染所需劑量高得多的劑量治療也無(wú)用。這樣的劑量可能引起預(yù)料不到的副作用如中性白細(xì)胞減少癥及對(duì)體重增加產(chǎn)生抑制。因此這是希望對(duì)于被長(zhǎng)期存在的病毒或慢性病毒感染的病人提供一種更有效而又不會(huì)引發(fā)干擾素副反應(yīng)的干擾素制品。
干擾素同樣也被廣泛地試驗(yàn)其預(yù)防或治療通常的(主要由鼻病毒感染引起)感冒的能力。大多的研究是采用每天用0.8×106至42.8×106單位的劑量進(jìn)行滴鼻(Finter等著，1985，Interferon Vol.4pp.186-187)。然而需要明白的是，由早期研究報(bào)導(dǎo)的專(zhuān)一活性與目前使用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)之間的關(guān)系是模糊的。施用的劑量當(dāng)用國(guó)際單位表達(dá)時(shí)可能更大些或更小些。盡管據(jù)報(bào)導(dǎo)用浸藥的拭子施藥更為有效，但一般是用煙霧劑來(lái)進(jìn)行鼻腔施藥的。典型的方法是，將每天的劑量分成1至3次施用。采用重組體干擾素的實(shí)踐表明噴霧施與大約1×106單位/劑量(每個(gè)鼻孔施用0.1ml)對(duì)于提供保護(hù)作用是有效的，無(wú)論是采用此劑量的十分之一或是百分之一都沒(méi)有能檢測(cè)得出的作用(Finter等.，op cit，P188)。然而，大約1×106單位的干擾素的測(cè)量會(huì)伴隨產(chǎn)生心煩，對(duì)鼻腔有輕微的刺激，更大的劑量則產(chǎn)生顯著的刺激(Finter等Id.)。
干擾素同樣也可以采用滴眼藥的形式治療單純性皰疹病毒引起的結(jié)膜炎或以靜脈或腹腔的注射或輸藥的形式對(duì)各種病毒感染進(jìn)行治療。典型情況下，每毫升滴眼藥中含有超過(guò)大約1×106單位的干擾素(含有60，000單位/ml干擾素濃度的制劑據(jù)報(bào)導(dǎo)不產(chǎn)生臨床上的作用，Sundmacher等.，1976，“J.Infect.Dis”133A160-A164)。靜脈注射施藥的劑量一般也超過(guò)1×106單位/患者人次，盡管早期的研究者在當(dāng)時(shí)不能獲得粗制干擾素制劑而只能采用較低的劑量。這些研究結(jié)果表明，干擾素對(duì)于治療已產(chǎn)生的病毒感染不如用與預(yù)防時(shí)那么有效。因而，需要有一種對(duì)于活性感染表現(xiàn)出增進(jìn)的活性并顯示更高的保護(hù)(預(yù)防)能力以便能使用較低的劑量的干擾素。
腫瘤壞死因子(參見(jiàn)Pennica等.，20/27 Dec.1984，“Nature”312724)及淋巴毒素(參見(jiàn)Gray等.，20/27 Dec.1984，“Nature”312721)是由被激活的巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的蛋自質(zhì)，在此分別稱(chēng)為“TNF”(或“TNF-α”)及“LT”(“或TNF-β”)。兩者在體外與體內(nèi)都直接地對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，并在這一點(diǎn)上與干擾素產(chǎn)生協(xié)同作用(參見(jiàn)Lee等.，1984年，“J.Immun，”1331083)。然而，TNF或LT本身都沒(méi)有任何直接的抗病毒的保護(hù)活性作用TNF-α被認(rèn)為與嚴(yán)重感染的癌癥病人可導(dǎo)致消瘦與惡病質(zhì)(34)，而且對(duì)TNF-α的被動(dòng)免疫作用據(jù)報(bào)導(dǎo)能保護(hù)小白鼠以抵抗內(nèi)源毒素的致死作用(30)。已經(jīng)了解到TNF-α的抗腫瘤作用及被干擾素協(xié)同地增強(qiáng)作用，而TNF-β的抗腫瘤作用類(lèi)似地由干擾素γ而加強(qiáng)。然而，TNF-α及TNF-β混合物的抗腫瘤作用僅僅是兩者的加和，如α及β干擾素混合后的抗病毒作用一樣。
本發(fā)明的一個(gè)目的是增進(jìn)干擾素的抗病毒活性而不增加干擾素副反應(yīng)的發(fā)生率。
另一個(gè)目的是增加干擾素的抗病毒的專(zhuān)一性。
本發(fā)明的一個(gè)附加目的是采用干擾素以進(jìn)行個(gè)體病毒感染的預(yù)防，包括DNA病毒的感染。
本發(fā)明的一個(gè)目的是將免疫療法成功地用于被還原病毒，特別是親淋巴細(xì)胞性病毒，如HIV感染的病人的治療。
在此的另一個(gè)目的是對(duì)那些處于活性還原病毒感染威脅之下的人，如對(duì)懷帶有潛伏性還原病毒的人進(jìn)行治療。
一個(gè)附加的目的是提供免疫療法預(yù)防以抵抗還原病毒的感染。
如果將本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)總體來(lái)看待，則這些目的以及本發(fā)明的其它目的將會(huì)更為明顯。
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)已經(jīng)受病毒感染或處于受病毒感染威脅之下的哺乳動(dòng)物施于抗病毒有效量的TNF或LT或(a)干擾素及(b)TNF或LT而完成的。盡管單獨(dú)的TNF或LT是不存在抗病毒保護(hù)活性，但是TNF或LT協(xié)同地增強(qiáng)了干擾素的抗病毒活性。非常典型而又十分預(yù)料不到的是，當(dāng)干擾素配方中含有TNF或LT時(shí)干擾素的活性，增加了2倍至超過(guò)100倍據(jù)觀察對(duì)γ-干擾素作用最大。
對(duì)于本發(fā)明的情況，認(rèn)為用于治療包括抗病毒或抗腫瘤所提供的干擾素配方中含有的干擾素量是不足的，這些干抗素劑量少于大約500，000國(guó)際單位，一般少于25，000單位。這樣劑量的干抗素通過(guò)在其中滲和一定數(shù)量的本身不足以顯示毒性而又足于增加干擾素抗病毒活性的LT或TNF而產(chǎn)生效力。
出乎預(yù)料的是，我發(fā)現(xiàn)單獨(dú)施用治療有效數(shù)量的腫瘤壞死因子，或者最好是與干擾素合用時(shí)，可以對(duì)受還原病毒威脅的人起到保護(hù)并殺死已受還原病毒感染的細(xì)胞。與此同時(shí)，γ干擾素單獨(dú)施用時(shí)產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生對(duì)還原病毒感染的保護(hù)活性，而且γ干擾素對(duì)于受還原病毒感染的細(xì)胞也沒(méi)有足夠的細(xì)胞毒作用，而且TNF單獨(dú)施用時(shí)在高濃度下也只有中度的活性，但當(dāng)這兩個(gè)藥劑聯(lián)用時(shí)則產(chǎn)生顯著的作用。盡管受還原病毒感染的病人的免疫系統(tǒng)是處于免疫混亂的狀態(tài)，在體內(nèi)還是觀察到了這樣的現(xiàn)象。這樣的結(jié)果特別令人鼓舞，因?yàn)闆](méi)有知道在這些病人中缺乏TNF。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1及2表示當(dāng)干擾素γ與LT或TNF合用時(shí)其抗病毒活性的顯著增加。
圖3描繪了通過(guò)改變TNF和干擾素γ的濃度而使之得到保護(hù)而不受病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物。
圖4a及4b顯示了TNF或LT增加干擾素α、β或γ的抗病毒活性的情況。
圖5a至5d描述了被TNF或LT加強(qiáng)的干擾素γ對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用。
圖6是一種Northern凝膠顯示了與不用TNF-α及IFN-γ預(yù)處理的細(xì)胞作比較，當(dāng)被HIV感染的Hu T78細(xì)胞用TNF-α及IFN-γ作預(yù)處理后HIVm RNA顯著地減少。
圖7說(shuō)明了過(guò)氧化氫酶與TNF-α和/或IFN-γ合用時(shí)的抗病毒的保護(hù)作用。
本發(fā)明的方法及配方可用于預(yù)防或治療被單股RNA或雙股RNA病毒或DNA病毒所引起的顯性感染或潛伏感染，而引起感染的病毒不受限制地包括腺病毒、皰疹病毒、乳多空病毒(包括猿病毒40、乳頭瘤及多瘤病毒)、痘病毒如小痘及牛痘、蟲(chóng)媒病毒、沙粒病毒、冠狀病毒、粘病毒((新城病New Castte)、流行性腮腺炎、麻疹及呼吸道合胞體(synctial)病毒)、鼻病毒、副粘病毒如甲、乙或丙型流行感冒病毒、微小病毒微小核糖核酸病毒、披膜病毒、還原病毒(包括HTLV-Ⅰ，Ⅱ及Ⅲ)、呼腸孤病毒及輪狀病毒。其它的特定的病毒包括風(fēng)疹、單純皰疹性、水痘-帶狀皰疹、小雞痘、細(xì)胞巨病毒、未分類(lèi)的RNA病毒、狂犬病及乙型肝炎。
還原病毒被定義為含單股或雙股RNA的病毒。這類(lèi)病毒通過(guò)利用永久性宿主的細(xì)胞代謝以逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA遺傳物質(zhì)而進(jìn)行病毒復(fù)制的。如此大量產(chǎn)生的DNA經(jīng)轉(zhuǎn)譯至HIV蛋白及RNA以組裝成子代病毒粒。這些病毒的例子包括所謂的“慢”或慢性病毒及T-細(xì)胞白血病病毒如HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ，但最優(yōu)選的是與愛(ài)滋病有關(guān)的HIV病毒株(以前稱(chēng)為HTLVⅢ)。
干擾素是很為人們了解的。從性質(zhì)上分別包括β及γ干擾素，以及大約20種不而的α干擾素亞型。它們與本發(fā)明目的最為相關(guān)的特征為，可以在體內(nèi)及體外能保護(hù)細(xì)胞免受病毒的感染。本發(fā)明用于方法或配方中的干擾素典型地為α-干擾素、β或γ干擾素，但γ干擾素被優(yōu)先采用。由干擾素氨基酸順序或其糖基化的變型(包括非糖基化的形式)所決定，只要它們顯示抗病毒的活性，不論是由重組體細(xì)胞培養(yǎng)物、或從自然分離物中或由穩(wěn)定的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生的干擾素都能在此滿意地被使用。因?yàn)棣酶蓴_素被認(rèn)為是種專(zhuān)一性的，因而干擾素γ應(yīng)該用于對(duì)同一種的動(dòng)物進(jìn)行治療。干擾素最好有足夠的同源性并且有超過(guò)大約1×106國(guó)際單位/mg的專(zhuān)一活性。
TNF及LT包括重組體或未轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)物，包括氨基酸順序或者(對(duì)于LT的情況)糖甙基化的變型(包括非糖甙基化的LT)。無(wú)論是單獨(dú)的TNF或LN或者它們的混合物都是適用的。因?yàn)門(mén)NF及LT與干擾素協(xié)同作用的能力沒(méi)有種的的專(zhuān)一性，由一種物種得到的TNF或LT可以用于其它種的物種的療法中。在此最好采用人類(lèi)成熟的TNF或人類(lèi)的非糖甙基化的成熟的LT。
TNF-α或TNF-β單獨(dú)使用或者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)測(cè)得的能發(fā)揮最大臨床效應(yīng)的比例混合使用。TNF沒(méi)有種子的專(zhuān)一性，因而從其它的動(dòng)物種如豬或牛得到的TNF在此也能使用。TNF最好是從重組成微生物細(xì)胞培養(yǎng)物得到的成熟的人類(lèi)TNF-α。TNF通常對(duì)于敏感的L-929鼠細(xì)胞株具有大于1×106單位/毫克的溶細(xì)胞活性，此處的單位是由上述描述的那些專(zhuān)利申請(qǐng)所規(guī)定的，這些申請(qǐng)揭示的內(nèi)容加在此處作為參考。
此處的配方包括可容納藥物的載體，如那些在治療中用于施于干擾素、TNF或LT的載體，如生理鹽水或5%葡萄糖及常用的穩(wěn)定劑和/或賦形劑如人類(lèi)血清白蛋白或甘露糖醇。所提供的配方可以是凍干擾素狀態(tài)的或是滅菌水溶液狀態(tài)的。
普通的操作人員可以就α、β、或γ干擾素與TNF-α或TNF-β的比例，干擾素與TNF的凈比例，干擾素及TNF在配方中的濃度以及對(duì)每公斤物種基質(zhì)施用的劑量等方面考慮作一些改變。在治療上作的改變也包括被治療的動(dòng)物種的變化，施用途徑的變化，及患者的臨床條件的變化(如果存在的話，在治療的開(kāi)始包括根據(jù)還原病毒和/或偶發(fā)性有機(jī)體感染的階段及程度的條件不同而作的變化)干擾素的合適的起始劑量水平在大約從1至50μg/m2的范圍?？梢匀淌艿膭┝坎怀^(guò)大約25μg/m2。
到現(xiàn)在為止;合適的干擾素劑量在大約為被認(rèn)為是具有最小劑量范圍的50%至0.1%，該劑量可與TNF或LT合用以對(duì)病毒感染提供抵抗力，及用于殺死已被病毒感染的細(xì)胞。劑量可以達(dá)到大約500，000國(guó)際單位/70kg患者體重，但可以典型地低于大約100，000單位/70kg患者體重。干擾素與TNF或LT的相對(duì)重量比一般在大約1000∶1至1∶1的范圍，而大約100∶1為最佳。典型的治療配方為每毫升含有大約從1×103至1×105國(guó)際單位干擾素及每毫升含大約從1×10g-9至5×10g-6的TNF或LT的水溶液。這些配方根據(jù)所預(yù)防或治療的病毒感染的情況而通過(guò)鼻腔、腹腔注射或靜脈注射施藥。鼻腔施藥劑量一般少于大約25，000國(guó)際單位(每0.1ml體積)，而靜脈施藥的劑量少于500，000國(guó)際單位，一般少于100，000單位。
TNF或LT與干擾素的合用的協(xié)同抗病毒保護(hù)作用可以廣泛地應(yīng)用于各種哺乳動(dòng)物。如表1所示的細(xì)胞系在24眼的組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)并與TNF或LT及干擾素γ一起預(yù)培養(yǎng)。所有的細(xì)胞系(通過(guò)細(xì)胞致病作用來(lái)測(cè)定)用感染復(fù)數(shù)分別為1、1及100的EMC、VSV及HSV-α進(jìn)行多次感染，均在某種程度上有抵抗感染的保護(hù)作用。
表1A)人類(lèi)細(xì)胞系 B)非人類(lèi)細(xì)胞
1.A549(肺癌) 1.3 T3(鼠成纖維細(xì)胞)2.HT-1080(肺纖維內(nèi)瘤) 2.C127(鼠上皮細(xì)胞)3.Hela(頸癌) 3.Raw～264(鼠巨噬細(xì)胞)4.T24(膀胱腫瘤) 4.Rat-1(大鼠成纖維細(xì)胞)5.HT29(結(jié)腸腫瘤) 5.NRK(正常大鼠腎細(xì)胞)6.7860(腎腫瘤) 6.PK15(豬細(xì)胞)7.ST486(淋巴細(xì)胞) 7.MDBK(牛細(xì)胞)8.R8226(淋巴細(xì)胞)因此，本發(fā)明的方法可以用于提供哺乳動(dòng)物抵抗病毒感染，哺乳動(dòng)物包括人、牛、禽類(lèi)及馬?；颊呖赡芤训弥蛭吹弥颊吣[瘤或惡性腫瘤。
本發(fā)明的方法特別適用于發(fā)生在高密度農(nóng)用動(dòng)物群體的高度傳染性病毒傳染的預(yù)防，首先為發(fā)生在幼雞中的新城病New Castle疾病及牛的航運(yùn)熱。盡管病毒群體中引起的變種可能使疫苗失效，但由于本發(fā)明的配方和疫苗不同因而對(duì)所有的病毒都有效，并在剛出現(xiàn)流行瘟疫突發(fā)的預(yù)兆時(shí)緊急施用得到快速的保護(hù)效果因而避免了對(duì)群體中的所有動(dòng)物進(jìn)行接種。
本方法也可用于預(yù)防呼吸道的感染。那些例如家庭中有人患普通感冒等而處于感染危險(xiǎn)之下的人，可以施用干擾素及TNF或LT以保護(hù)防止感染。為了防止病毒傳播而用于動(dòng)物或人的施藥方法的最為慣用的途徑是用對(duì)鼻腔噴霧或小拭子而通過(guò)呼吸道的途徑。該治療方法除了須使用預(yù)先采用的干擾素組分之外，將使用已知的配方和方法，并且，系統(tǒng)的治療方法包括TNF或LT的施用。用于鼻腔的制品可選用包括諸如膽汁酸鹽或非離子型的聚氧乙烯醚作為滲透增強(qiáng)劑。配方系在PH7.4的磷酸緩沖液中含有指定劑量的干擾素及TNF或LT，甘露糖醇或其它的穩(wěn)定劑或者賦形劑以及1%重量比的增強(qiáng)劑。對(duì)其它的合適的鼻內(nèi)施用的基礎(chǔ)配方，美國(guó)專(zhuān)利4，476，116號(hào)，EP127，535A，EP122，036A，EP111，841A，及EP128，831A中作了描述。TNF及干擾素的劑量可以一起施用或分別施用。對(duì)于后者的情況，干擾素需先施用，然后在24小時(shí)內(nèi)施用TNF。本發(fā)明的范圍也包括根據(jù)病人的臨床反應(yīng)用TNF及干擾素進(jìn)行多次周期性的施用。本治療方法有效地用于對(duì)處于潛伏期的被感染細(xì)胞在進(jìn)入感染的活性階段時(shí)進(jìn)行打擊，通過(guò)外源地加入T細(xì)胞分裂素或者通過(guò)導(dǎo)致T細(xì)胞活化的偶發(fā)性感染均可。
由于用TNF及干擾素進(jìn)行的治療將使受病毒感染的細(xì)胞溶化，并引起感染性的病毒的釋放，因而在治療的過(guò)程中加入能夠中和更多的病毒感染性的物質(zhì)是有益的?？梢酝ㄟ^(guò)幾種方式來(lái)完成這一目的。其中之一，可以在治療的階段中，最好在施以TNF的同時(shí)，施用諸如單克隆或多克隆抗還原病毒的抗體。另外，對(duì)于具有免疫活性的病人可以對(duì)還原病毒進(jìn)行接種，以有效地誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。完成這一目的合適的疫苗包括HIVgp120外殼多肽。據(jù)報(bào)導(dǎo)，該疫苗誘發(fā)對(duì)HIV進(jìn)行中和的抗體，該抗體反過(guò)來(lái)能用于上述的被動(dòng)免疫方法中。其它的用于阻止?jié)撛诘尼尫挪《靖腥玖Φ乃巹┮部梢耘cTNF合用，例如與細(xì)胞表面的通常所討論的被還原病毒識(shí)別的受體相結(jié)合從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制病毒粘附到靶細(xì)胞表面的過(guò)程(對(duì)于HIV，細(xì)胞表面標(biāo)記OKT4+出現(xiàn)在幫助T細(xì)胞中)的gp120env或其片段。
TNF和/或干擾素協(xié)同抗病毒及抗腫瘤的活性通過(guò)在系統(tǒng)的治療方法和/或配合中加入能起到治療效力的足夠數(shù)量的氧自由基清除劑(包括氧保護(hù)酶及過(guò)氧化活性物質(zhì))而被進(jìn)一步加強(qiáng)。這些物質(zhì)包括過(guò)氧化氫酶、超氧化(demutase)、過(guò)氧化酶或氯過(guò)氧化酶(chloroperoxidase)，大大地增強(qiáng)TNF及干擾素的活性。盡管目前這些試劑加強(qiáng)TNF及干擾素的機(jī)制還不了解，這些酶分別催化H2O2分解成水和氧或催化H2O2+HO-R-OH→2H2O+O＝R＝O的反應(yīng)這一點(diǎn)是明確的。過(guò)氧化氫酶商業(yè)上可以大量地獲得，并能從人類(lèi)組織中諸如血紅細(xì)胞中獲得。過(guò)氧化酶普遍地是從辣根中獲得。過(guò)氧化活性物質(zhì)與TNF及干擾素的比例，非強(qiáng)調(diào)地，可以是大約從1000∶1∶0.1至100∶50∶25，但是使用的劑量及比例必須按照病人的臨床條件及施藥途徑以及根據(jù)本領(lǐng)域中工作人員熟悉的各種變化情況而作必要的調(diào)整。
TNF及干擾素可以按照同樣的途徑施用，也可通過(guò)不同的途徑獨(dú)立施用，例如通過(guò)靜脈注射或鼻腔給藥或通過(guò)肌肉注射施用。兩個(gè)成份中任一個(gè)或一起可以通過(guò)持續(xù)釋放的配方如聚交酯或聚羥基丁酸酯植入物或通過(guò)如同EP17，2007A描述的微脂粒而施用，或者通過(guò)連續(xù)輸送而施用。目前最好采用靜脈輸注的方式施用如上提及劑量的TNF及干擾素。
當(dāng)采用大劑量時(shí)，為了避免復(fù)合療法的副作用，TNF及干擾素可以通過(guò)在此稱(chēng)為可采用的免疫療法的施用于身體之外的療法。在這些方法中，將病人的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞或淋巴細(xì)胞在體外的血漿除去循環(huán)中分離出來(lái)并用內(nèi)白細(xì)胞素-2(interlenkin-2)或干擾素進(jìn)行處理然后再輸注到病人體內(nèi)。通過(guò)這樣的方法大大地刺激了病人的抵抗惡性病質(zhì)的免疫效應(yīng)。除了將外周單細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞與TNF或TNF及干擾素一起培養(yǎng)之外，對(duì)于還原病毒感染的治療方法是和通常的一樣的。被病毒感染的細(xì)胞被TNF或復(fù)合藥劑殺死。體外細(xì)胞同樣也可與一種殺傷細(xì)胞活性劑諸如淋巴細(xì)胞裂解素(例如植物血細(xì)胞凝集素)及/或內(nèi)白細(xì)胞素-2(interlenkin-2)一起培養(yǎng)。然后洗滌細(xì)胞并重新懸浮于輸注介質(zhì)中以便重新輸注到原先提供該細(xì)胞的病人身上。經(jīng)過(guò)再輸注之后接著可以施于在此另外提供的TNF及干擾素。施用的TNF或TNF及干擾素的最佳數(shù)量，及對(duì)病人淋巴進(jìn)行體外治療的最佳條件是通過(guò)測(cè)定病人的病毒效價(jià)，及對(duì)病人臨床條件改善的評(píng)價(jià)而由施藥的途徑所決定的。
等候用本發(fā)明的治療方法進(jìn)行治療的人，是那些處于受還原毒病感染的威脅的人，或那些顯示出確實(shí)受到病毒感染的征兆的人。那些處于高發(fā)病率群體中的人，如同性戀者、靜脈毒品使用者及那些接受了未對(duì)HIV抗體進(jìn)行篩選的輸血或輸入其它的血液制品的人。受還原病毒感染的證據(jù)包括產(chǎn)生抵抗HIV抗體的血清轉(zhuǎn)換，對(duì)HIV所作的血清陽(yáng)性測(cè)定，與愛(ài)滋相關(guān)綜合征(ARC)相關(guān)聯(lián)的征狀或者是明顯的愛(ài)滋病癥狀。對(duì)愛(ài)滋病人可以進(jìn)行也可以不進(jìn)行對(duì)于卡波濟(jì)氏肉瘤或其它的惡性病、偶發(fā)性的微生物感染如卡氏肺囊蟲(chóng)或真菌性口炎、神經(jīng)缺陷或惡病質(zhì)(cachexia)(wasting)的診斷。
通過(guò)下列的例子本發(fā)明將更完全地被理解。干擾素是重組體細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)物并被提純至專(zhuān)一性活性達(dá)到大約108單位/毫克的程度。TNF及LT也是由重組體獲得的，具有大約為5×107單位/毫克的專(zhuān)一的活性。
例1LT或TNF增強(qiáng)人類(lèi)干擾素-γ的抗病毒的活性在96眼的平底盤(pán)(Falcon plastics)上以每眼2×104A549細(xì)胞的密度接種于平底盤(pán)上，24小時(shí)后與連續(xù)二倍稀釋的樣品一起培養(yǎng)。樣品為濃度如圖1中指明的干擾素γ的稀釋液。該樣品還含有0.1微克/毫升的TNF或LT，存在于用5%加熱去活的小牛胎血清(FCS)、谷酰胺(2mM)、青霉素(100μ/ml)、及鏈霉素(100μg/ml)補(bǔ)充的用Dulbecco改善的Eagle(DME)培養(yǎng)基中。對(duì)照樣品含有a)無(wú)干擾素及TNF或LTb)只有TNFc)只有LT。在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)之后，培養(yǎng)物的上清液用含有2%小牛胎血清(但不含干擾素、TNF或LT)及感染復(fù)數(shù)為1的EMC病毒的新鮮的DME培養(yǎng)基進(jìn)行置換。(“MOI”，為感染性病毒/細(xì)胞的比例)。細(xì)胞致病效果(CPE)用結(jié)晶紫(Crystal violet)對(duì)生存的細(xì)胞進(jìn)行染色而測(cè)定，而滴定度用microelisa自動(dòng)閱讀器(MR580，Dynatech)通過(guò)測(cè)定數(shù)量來(lái)測(cè)定并進(jìn)一步通過(guò)肉眼觀察以確證。CPE抗病毒的效價(jià)是以能抑制50%的細(xì)胞病的稀釋度的倒數(shù)表示。同時(shí)用人類(lèi)干擾素-γ的國(guó)際對(duì)照樣品(NOGg23-901-530)作標(biāo)準(zhǔn)化。
如圖1所示，在這些干擾素濃度之下，LT及TNF的存在協(xié)同地增強(qiáng)了干擾素γ抗病毒作用在濃度大約為1ng/ml時(shí)干擾素γ的抗病毒效價(jià)增加很大。(數(shù)據(jù)未標(biāo)明)。然后當(dāng)干擾素-γ本身的濃度低而效力大大地不足時(shí)，LT或TNF對(duì)于提供靶細(xì)胞以保護(hù)是十分有用的。
例2牛干擾素γ的抗病毒活性被人類(lèi)LT或TNF增強(qiáng)本方法重復(fù)例1的方法，只作以下的改動(dòng)，TNF及LT濃度為1μg/ml而非0.1μg/ml，干擾素為牛的干擾素，靶細(xì)胞為牛MDBK而病毒為VSV。CPE測(cè)定的結(jié)果列于圖2。由于TNF或LT的存在再一次大大地增強(qiáng)了保護(hù)活性。該數(shù)據(jù)表明TNF或LT的種的來(lái)源對(duì)于提供保護(hù)作用是無(wú)關(guān)緊要的，并能用于除人之外的任何其它的哺乳的動(dòng)物。
例3保護(hù)A549細(xì)胞免受VSV感染本方法除了作以下的變動(dòng)之外重復(fù)例1的方法，試驗(yàn)病毒為VSV，人類(lèi)重組體干擾素γ及TNF分別配成一系列的10倍稀釋及2倍稀釋的溶液，TNF的起始濃度為1μg/ml、干擾素γ的起始濃度為10μg/ml。結(jié)果示于圖3，為一已經(jīng)用結(jié)晶紫(crystal violet)染色的細(xì)胞培養(yǎng)平板。在0，0001至10μg范圍的干擾素γ的濃度對(duì)于保護(hù)細(xì)胞效力是不夠的，同樣地當(dāng)TNF的濃度從1μg/ml減少至1ng/ml時(shí)也不能顯示保護(hù)細(xì)胞的效力。如圖所示，被病毒感染的及未感染的對(duì)照產(chǎn)生了預(yù)料的結(jié)果。然而，甚至當(dāng)TNF及干擾素γ的濃度分別在大約1μg/ml至1ng/ml以及10μg/ml至0.1ng/ml的范圍時(shí)，TNF與干擾素γ的復(fù)合物即能保護(hù)細(xì)胞免受VSV的感染。
例4TNF或LT對(duì)干擾素-α及干擾素β的保護(hù)增強(qiáng)作用用EMC/A549代替VSV/A549，重復(fù)例1的方法。干擾素的濃度為，干擾素α10ng/ml，干擾素β10ng/ml。如圖4a所示干擾素α及干擾素β(程度較低一些)顯示出與人類(lèi)TNF或LT的協(xié)同抗病毒作用。如圖4b所示，用MDBK/VSV及牛的干擾素α及γ得到同樣的效果。
例5對(duì)病毒復(fù)制的協(xié)同抑制將A549細(xì)胞接種于24眼的組織培養(yǎng)平板(costar)24小時(shí)后用不同濃度的人類(lèi)LT、TNF或干擾素γ處理18小時(shí)，除去培養(yǎng)基之后加入EMC、VSV、腺病毒-2(Ad-2)及單純性皰疹病毒-2(HSV-2)。EMC、VSV、Ad-2及HSV-2的感染復(fù)數(shù)分別為1、1、100及100。TNF、LT及干擾素γ的濃度在0.1ng/ml至10μg/ml的范圍內(nèi)。經(jīng)歷2小時(shí)的吸附階段之后，將上清液吸出以去除未吸附的病毒，并在37℃下在含有5%FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)之后，培養(yǎng)物(細(xì)胞及培養(yǎng)基)進(jìn)行兩次冰凍融化以溶解細(xì)胞，在400Xg下離心10分鐘之后用Rager-Zisman等在“Proc.Soc.EXP.Med.”1421174-1179(1973)中描述的空斑測(cè)定法測(cè)定病毒產(chǎn)量。胞溶產(chǎn)物的系列稀釋液與A549細(xì)胞相混合并在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。吸出上清液，在上面鋪一層含有5%FCS及0.7%瓊脂糖的培養(yǎng)基。24-28小時(shí)之后，空斑用甲醛固定用結(jié)晶紫染色。用目測(cè)測(cè)定了以形成空斑的病毒單位/毫升(PFU/ml)表示的病毒產(chǎn)量并將結(jié)果列于圖5a至5d中。這些數(shù)據(jù)表明了對(duì)抗病毒活性的協(xié)同促進(jìn)作用，尤其是在低干擾素-γ濃度時(shí)。
例6對(duì)受病毒感染的細(xì)胞的協(xié)同殺傷本方法重復(fù)例1的方法采用MOI為10的VSV并且不與干擾素、TNF或LT一起預(yù)培養(yǎng)。VSV與細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)，然后將病毒從受感染的細(xì)胞上洗去。然后，如表2所示，對(duì)這些受感染的及未受感染的細(xì)胞用0.1μg/ml的LT、干擾素γ分別或以表2所示的物質(zhì)共同處理。在37℃之下經(jīng)歷了12至18小時(shí)后，用臺(tái)盼藍(lán)或propidium碘化物進(jìn)行染色以測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果列于下面的表2中。
表2存活數(shù)量(%)細(xì)胞處理 未感染 VSV感染12小時(shí) 18小時(shí) 12小時(shí) 18小時(shí)對(duì)照 100 92 70LT 100 41 29TNF 100 38 31干擾素γ 100 91 66LT+干擾素γ 100 14 0TNF+干擾素γ 100 12 0表2顯示當(dāng)干擾素γ及TNF或LT合用時(shí)受病毒感染的細(xì)胞被協(xié)同地殺死。將以上一些例子的結(jié)果總和起來(lái)考慮，可以認(rèn)為T(mén)NF或LT加上干擾素的復(fù)合物抗病毒感染的機(jī)制有兩個(gè)其一為提供未感染的細(xì)胞以保護(hù)作用，其二為殺死受病毒感染的細(xì)胞。
例7HIV感染的預(yù)防將OKT4+陽(yáng)性人類(lèi)T細(xì)胞白血病細(xì)胞系H9、Hu T78及U937懸浮于37℃下的RPMⅠ-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)物離心從培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞并將細(xì)胞以1×106/ml密度重新懸浮于新鮮的RPMⅠ-1640培養(yǎng)基中。將足夠量TNF-α及γ干擾素加入培養(yǎng)物以達(dá)到0.1μg/mlTNF-α及0.1μg/mlγ干擾素的濃度。TNF-α及γ干擾素的復(fù)合物對(duì)未受感染的Hu T78及H9細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。培養(yǎng)物再在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入1×106CPm單位·HIV/m/l。CPm單位用逆轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)測(cè)定(31);每一單位校正到表示每一個(gè)病毒粒的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。在37℃下再培養(yǎng)3天之后，細(xì)胞通過(guò)采用鼠單克隆抗體對(duì)P24(core)HIV蛋白的及帶標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白(32)進(jìn)行間接的免疫熒光法對(duì)病毒的抗原進(jìn)行篩選。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以含有HIV抗蛋白的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)形式列于下面。
表3試劑 感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)Hu T78 H9 U9371 2 1 2 1 2對(duì)照 54 68 48 36 11 14TNF-α 27 34 32 18 7 8γ干擾素 63 51 42 41 12 11TNF-α及γ干擾素 1 8 4 3 2 1
這些結(jié)果表明了TNF與干擾素的復(fù)合物對(duì)于預(yù)防敏感的T細(xì)胞受HIV感染也高度有效。
例8HIV感染細(xì)胞的治療將含有1×105H9及RPMⅠ-1788淋巴母細(xì)胞(lymphoblastoid)/毫升的RPMⅠ1640培養(yǎng)基在有1μg/ml聚凝胺存在的情況下加入1×103CPm H IV/ml以提高細(xì)胞受H IV感染的百分率。這些細(xì)胞培養(yǎng)30天左右的時(shí)間，在此期間每隔3至5天換一次培養(yǎng)基，大約每隔一周進(jìn)行一次細(xì)胞亞培養(yǎng)(subculture)。足夠的TNF-α及γ干擾素一起同時(shí)加到含有1×106細(xì)胞/ml的培養(yǎng)物中，以建立下面的如表4所示的濃度體系。這些濃度的TNF-α及γ干擾素復(fù)合物對(duì)于未受感染的H9及RPMⅠ-1788細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)3天，然后用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4(ND＝未進(jìn)行)。
表4藥品(試劑) 濃度 存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)H9 17881 2 1 2對(duì)照 // 89 76 95 86TNF-α 1.0ng/ml ND ND 90 810.1μg/ml 73 70 81 76γ干擾素 1.0ng/ml ND ND 83 840.1μg/ml 85 74 80 82TNF-α及1.0ng/ml ND ND 68 72γ干擾素 0.1μg/ml 50 42 34 53
這些結(jié)果表明，TNF與干擾素的復(fù)合物對(duì)于病毒感染細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用以及單獨(dú)使用的TNF-α對(duì)于病毒感染細(xì)胞的程度較低的殺傷作用是受濃度的影響的。這一特性及TNF或復(fù)合物對(duì)未感染細(xì)胞的保護(hù)作用顯示了TNF或復(fù)合物療法對(duì)于治療還原病毒感染的價(jià)值。
例9TNF及復(fù)合物療法使HIV復(fù)制減少Hu T78細(xì)胞用0.1μg/mlTNF-α及γ干擾素處理，然后按照例7方法用HIV對(duì)其進(jìn)行感染。在37℃下培養(yǎng)2天之后，按下述方法將HIV感染細(xì)胞中的所有的RNA萃取出來(lái)。細(xì)胞用PBS洗滌并在0℃左右重新懸浮于含0.5%NP-40及17μl VRC(BRL)的0.35ml TSM緩沖液(10mM Tris PH7.5，0.15MNacl，2mMMgcl2)中。3至5分鐘后，離心取出溶解細(xì)胞的核。將含有m RNA的上清液加入到含有1%SDS的0.35ml的TSE緩沖液中(10mM Tris PH7.5，0.15M Nacl，5m MEDTA)并用0.7ml的苯酚∶氯仿∶異戌醇(24∶24∶1)抽提液抽提三次。苯酚用水及0.1%8-羥基喹啉平衡。RNA從含有乙醇及乙酸鈉的水層中沉淀出來(lái)Poly(A)RNA通過(guò)oligo(d T)纖維素電泳而制備(36)。按照介紹的方法使用1μg RNA/lane進(jìn)行Northen雜交(37)。圖6的結(jié)果表明用TNF-α預(yù)處理可以抑制宿主中HIVRNA的出現(xiàn)，但是當(dāng)同時(shí)使用TNF及干擾素時(shí)出現(xiàn)的RNA就遠(yuǎn)遠(yuǎn)地減少了。這些結(jié)果與列于表3中的感染數(shù)據(jù)是一致的。據(jù)觀察用或不用TNF及干擾素進(jìn)行處理時(shí)，肌動(dòng)蛋白(actin)(一種結(jié)構(gòu)蛋白)都沒(méi)有變化，表明TNF-α及干擾素的作用是針對(duì)病毒的而不是針對(duì)一般的細(xì)胞生長(zhǎng)。
例10愛(ài)滋病或愛(ài)滋相關(guān)綜合征患者治療記錄記載的案例為，HIV抗體血清陽(yáng)性的男性，對(duì)其血液作體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示出HIV的效價(jià)。這些病人一般都呈現(xiàn)出愛(ài)滋或愛(ài)滋相關(guān)綜合癥的癥狀，并且由血清轉(zhuǎn)換產(chǎn)生HIV抗體。這個(gè)治療小組根據(jù)下列的治療變異性分成若干個(gè)班1，同時(shí)或連續(xù)的用TNF及干擾素治療。
2，靜脈或肌肉注射，對(duì)于靜脈注射的情況，采用大丸劑(bolus)或者持續(xù)的輸注(1，2，5及10天)。
3，數(shù)小時(shí)的劑量系統(tǒng)治療，按以下濃度開(kāi)始，1μg/m2TNF及1μg/m2干擾素-及每一藥劑濃度都增加至5，10，25，50……μg/m2以至可以耐受的最高濃度。
4，TNF與干擾素的比例為1∶100至100∶15，重復(fù)的治療周期重復(fù)1至5次，每次間隔1、2、5或10天。
6，干擾素類(lèi)型的選擇及比例α及γ，1∶10至10∶1;β及γ，1∶10至10∶1;γ，α或β單獨(dú)使用1∶1∶1至10∶1∶1至1∶5∶5。
合適的初始療法包括對(duì)于愛(ài)滋相關(guān)綜合征病人施用TNF-α、γ干擾素及α干擾素的復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)采用一個(gè)校正的輸注泵進(jìn)行連續(xù)的靜脈輸注，輸注劑量為T(mén)NF-α∶1-10μg/m2/24小時(shí);γ-干擾素∶1-10μg/m2/24小時(shí);α-干擾素1-10μg/m2/24小時(shí)。病人施用的劑量可以在能耐受的范圍內(nèi)逐漸上升。輸注持續(xù)一周。病人休息一周之后進(jìn)行再次輸注。出現(xiàn)的發(fā)熱、寒戰(zhàn)等的副作用可以用慣常的方法治療或減少劑量。當(dāng)抗HIV抗體或g P120env作為抗病毒劑與上述的復(fù)合物聯(lián)用時(shí)，采用的抗體或env多肽的劑量按照能夠分隔由聯(lián)合療法所釋放的病毒粒的計(jì)算值來(lái)確定。這一點(diǎn)將依賴(lài)于抗體對(duì)病毒粒的親和性及其中和效價(jià)以及病人病毒的效價(jià)的確定。確定合適的劑量是專(zhuān)業(yè)人員的工作范圍。
病人的臨床條件及病毒感染性效價(jià)在治療在及治療后的記錄中作了監(jiān)測(cè)。與體外研究的例7-9一致，本治療方法的結(jié)果得到令人滿意的病人的免疫力及病毒效價(jià)的比例情況病人獲得相當(dāng)?shù)馗纳啤?br>例11過(guò)氧化氫酶增強(qiáng)干擾素γ和/或TNF-α抗病毒活性將A549細(xì)胞以每眼2×104只的密度載種于96眼的平底盤(pán)(falon plastics)，24小時(shí)之后與試樣一起培養(yǎng)。試樣如圖7所示(CAt”為過(guò)氧化氫酶)。樣品還含有Dulbecco改善的Eagle′s(DME)培養(yǎng)基并加入5%加熱去活的小牛胎血清(FCS)、谷胺酰(2mM)、青霉素(100單位/毫升)及鏈霉素，(100μg/ml)補(bǔ)充。在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)，將培養(yǎng)物上清液換以新鮮的不含干擾素、TNF或過(guò)氧化氫酶但含有2%的小牛胎血清及感染復(fù)數(shù)(“MOI”，為感染性病毒/細(xì)胞的比例)為1的DME培養(yǎng)基。用結(jié)晶紫對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行染色以測(cè)定細(xì)胞病的效果(CPE)，并用microelisa自動(dòng)閱讀器(MR580，Dynatech)作效價(jià)的定量測(cè)定并進(jìn)一步通過(guò)用目測(cè)來(lái)確證。
CPE抗病毒的效價(jià)是以能抑制50%細(xì)胞疾病的稀釋度的倒數(shù)表示，同時(shí)以人體干擾素γ(NO.Gg23-901-530)的國(guó)際對(duì)照樣品標(biāo)化。
如圖7所示，過(guò)氧化氫酶顯著地并且協(xié)同地增強(qiáng)干擾素γ及TNF-α的抗病毒作用。這種作用并非只限于EMC病毒的。已經(jīng)觀察到了許多適用的細(xì)胞及病毒。
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權(quán)利要求
1.一種配方其特征在于，該配方含有抗病毒的有效治療劑量的低于大約100，000國(guó)際單位的干擾素及LT或TNF。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的配方，其特征在于該配方為一種煙霧劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的配方，其特征在于，其中LT或TNF數(shù)量少于大約干擾素重量的10%。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的配方，其特征在于，其中所述的干擾素為γ干擾素。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的配方，其特征在于，所述的配方包括LT及TNF的混合物。
6.一種治療與預(yù)防病毒感染的方法，其特征在于所述的方法包括對(duì)于已經(jīng)被病毒感染的或處于受病毒感染的威脅之下的哺乳動(dòng)物施以抗病毒的有效數(shù)量的(a)一種干擾素及(b)一種TNF或一種LT。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，其中所述的病毒感染為呼吸道的病毒感染。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，其中所述的干擾素及TNF或LT是同時(shí)施用的。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，其中所述的干擾素及TNF或LT是通過(guò)鼻腔施用的。
10.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，其中所述的TNF或LT是以抗病毒有效劑量，大約低于5μg/kg的劑量施用的。
11.一種用以治療或預(yù)防病毒感染的方法，其特征在于，所述的方法包括對(duì)受感染的或處于被感染的威脅之下的動(dòng)物施以在治療上有效的數(shù)量的腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子及干擾素。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中的腫瘤壞死因子為腫瘤壞死因子-α。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中的干擾素為干擾素α、β或γ。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中干擾素為干擾素γ。
15.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中的所述的動(dòng)物為受HIV感染的動(dòng)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中所述的動(dòng)物沒(méi)有任何能檢測(cè)出來(lái)的惡性疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中所述的腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子及干擾素在可采用的免疫治療階段是通過(guò)體外施用的。
18.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中所述的干擾素是在施用腫瘤壞死因子之前施用的。
19.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中所述的干擾素是加上了α干擾素或β干擾素的γ干擾素的混合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，其中所述的腫瘤壞死因子及干擾素的使用劑量每一樣都為約1至25μg/m/24小時(shí)連續(xù)靜脈輸注。
21.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括對(duì)能夠中和病毒的感染性的抗體的施用。
22.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，其特征在于，其中對(duì)腫瘤壞死因子及干擾素的施用重復(fù)大約1至5個(gè)周期。
23.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括在施用腫瘤壞死因子或腫瘤壞死因子及干擾素之前進(jìn)行的對(duì)動(dòng)物進(jìn)行抗HIV的免疫步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，該方法還進(jìn)一步包括對(duì)動(dòng)物施于生理上可以接受的氧自由基清除劑物質(zhì)的抗病毒治療劑量的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求
24所述的方法，其特征在于，其中的所述的氧自由基清除劑物質(zhì)為過(guò)氧化氫酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求
25所述的方法，其特征在于，其中所述的氧自由基清除劑物質(zhì)為紅細(xì)胞過(guò)氧化氫酶。
27.一種配方，其特征在于，該配方包括一種腫瘤壞死因子、一種干擾素及一種氧自由基清除劑物質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求
27所述的配方，其特征在于，其中所述的氧自由基清除劑物質(zhì)為有過(guò)氧化作用活性的酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求
27所述的配方，其特征在于，其中所述的氧自由基清除劑物質(zhì)為人類(lèi)的紅血球過(guò)氧化氫酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求
27所述的配方，其特征在于，該配方還進(jìn)一步包括一種能夠防止(a)還原病毒的復(fù)制的物質(zhì)或(b)還原病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合的物質(zhì)。
31.一種配方，其特征為所述的配方包括一種腫瘤壞死因子、一種干擾素及能夠防止(a)還原病毒復(fù)制的物質(zhì)或(b)還原病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合的物質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求
31所述的配方，其特征在于，其中所述的能夠防止還原病毒與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合的物質(zhì)為一種直接針對(duì)于還原病毒的外殼多肽的抗體。
專(zhuān)利摘要
通過(guò)施用腫瘤壞死因子，最好是連續(xù)輸注腫瘤壞死因子及干擾素以預(yù)防或治療病毒感染。本發(fā)明的方法可以特別運(yùn)用于愛(ài)滋病及愛(ài)滋相關(guān)綜合癥的治療。
文檔編號(hào)A61K38/00GK87100480SQ87100480
公開(kāi)日1987年11月11日 申請(qǐng)日期1987年1月24日
發(fā)明者格瑞思, 新-娃王 申請(qǐng)人:基因技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan