專利名稱：脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了含有被包封的多核苷酸的脂質(zhì)體的組合物，其中的多核苷酸可編碼一種期望的多肽。該種多肽可優(yōu)選地編碼一種免疫原性的多肽，其可用于使受試個(gè)體產(chǎn)生一種期望的免疫反應(yīng)，例如用于針對(duì)感染性微生物的預(yù)防性免疫法，或用于免疫治療的治療方案。該類脂質(zhì)體優(yōu)選地包含至少一種帶正電荷的脂類，且優(yōu)選地通過一種脫水-再水化的技術(shù)制備而成。
已知可以把遺傳性物質(zhì)引入受試的人體或動(dòng)物以用于多種目的。在本世紀(jì)60年代中期，人們就知道把正常的基因序列引入攜帶缺陷的對(duì)應(yīng)基因序列的病人中用于治療一些遺傳性疾病的技術(shù)。當(dāng)前正在進(jìn)行一些應(yīng)用基因治療來治療多種遺傳性疾病的試驗(yàn)。例如，已經(jīng)進(jìn)行了針對(duì)囊性纖維化的治療的大量工作，這是通過引入了一種可以編碼囊性纖維化(CF)跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的DNA。由于該基因產(chǎn)物在肺臟中是必需的，現(xiàn)在已經(jīng)做了很多嘗試把這種基因直接或通過鼻腔送入肺中。
最近基因治療被建議用于治療癌癥。例如，人們希望通過把編碼腫瘤壞死因子(TNF)或白介素-2的基因引入淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞來誘發(fā)一種免疫反應(yīng)使腫瘤破壞。另外，人們也希望把可編碼人類1型主要組織相容性抗原(HLA-B7)的基因引入不能表達(dá)這種抗原的病人之腫瘤細(xì)胞，來誘發(fā)一種免疫反應(yīng)使腫瘤細(xì)胞破壞。
有很多載體被建議用于基因治療中核酸的輸送和表達(dá)(Mulligan,1993)。它們包括病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒)和非病毒載體(如陽離子聚合物和囊泡)。然而，這些載體都存在著缺點(diǎn)，例如整合到細(xì)胞染色體的逆轉(zhuǎn)錄病毒可產(chǎn)生副反應(yīng)，增加抗病毒蛋白的免疫反應(yīng)而不能用于長(zhǎng)期治療(Kay等，1994)；非病毒載體則可導(dǎo)致瞬時(shí)或低效率的轉(zhuǎn)染(Legendre和Szoka,1995)。但是DNA整合入非病毒載體時(shí)要相對(duì)簡(jiǎn)單一些，通常不用考慮DNA的大小和結(jié)構(gòu)，同時(shí)這些非病毒載體具有非病原性的特征，這就使這類載體非常具有吸引力?，F(xiàn)在，構(gòu)建體(由預(yù)制的陽離子囊泡和質(zhì)粒DNA組成的復(fù)合物)在體外已經(jīng)顯示了高的轉(zhuǎn)染指數(shù)(Felgner,1991)，而在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)則顯示了中低等的轉(zhuǎn)染(Alton等，1993；Zhu等，1993)。另一方面，由于這種復(fù)合物的潛在毒性(Raz等，1994)和無法與其它一些可促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)染效率的藥物整合，所以與可整合核酸的常規(guī)脂質(zhì)體相比，它們?cè)隗w內(nèi)的應(yīng)用就沒有什么前途。經(jīng)過恰當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)(在囊泡的大小、表面電荷和脂類組成等方面)，這些脂質(zhì)體可在血液循環(huán)中維持穩(wěn)定(Scherphof等，1983；Gregoriadis,1995)從而使它們的核酸內(nèi)容物避免受到血漿中核酸酶的作用，或者使核酸內(nèi)容物維持一個(gè)有利的清除率以發(fā)揮其最理想的作用(Gregoriadis,1995)。而且，在長(zhǎng)效脂質(zhì)體的表面聯(lián)接細(xì)胞特異性的配體可引導(dǎo)核酸選擇性地到達(dá)靶細(xì)胞(Gregoriadis,1995)。在含有核酸的脂質(zhì)體中整合其它試劑也可使它們發(fā)生聚合，從而更好地避免內(nèi)容物從核內(nèi)體泄露到胞漿中或促進(jìn)DNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中(Legendre和Szoka,1995)。但是，把DNA包封到脂質(zhì)體中的大多數(shù)技術(shù)都存在著不足(Gregoriadis,1993)，這些技術(shù)如果與DNA的大小或所使用的環(huán)境(如超聲處理、有機(jī)去污劑和溶劑)不相容就可破壞DNA的完整性。
WO-A-9117424(Vical,Inc)描述了可改善細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠蓭д姾珊拓?fù)電荷的脂類與活性化合物所組成的多種復(fù)合物。其指出可以克服多核苷酸包封到陽離子脂質(zhì)體中的低效率，方法是把由預(yù)先形成的帶正電荷的脂質(zhì)體和多核苷酸(帶負(fù)電荷)所組成的帶凈正電荷的復(fù)合物與一種過量的預(yù)制的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體結(jié)合，據(jù)說后者可包裹帶正電荷的復(fù)合物。但是，由于多核苷酸沒有包封在囊泡的內(nèi)部，所以認(rèn)為它能接觸到血漿中的核酸酶。
在US-A-4,897,355中，Eppstein等(Syntex)描述了由陽離子脂類所制成的脂質(zhì)體，其可用于活性化合物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。其中一種活性化合物的例子是多核苷酸，例如編碼用于酶缺乏條件下的酶，用于激素替代療法的激素、凝血因子、神經(jīng)遞質(zhì)、抗病毒化合物和抗腫瘤化合物，或者用于可選擇性抑制某些特定蛋白質(zhì)表達(dá)的反義RNA的運(yùn)輸。首先，活性化合物與預(yù)制的空脂質(zhì)體相混合，接著所形成的結(jié)合物又任選地與下一種預(yù)制的脂質(zhì)體相混合。
在1996年的靶向藥物雜志(待發(fā)表)中，Gregoriadis等描述了利用脫水-再水化方法制備帶有用于基因治療的包封DNA的脂質(zhì)體。
在1995年的“藥物的靶位治療中寡核苷酸和基因輸送的策略”會(huì)議上及隨之由G.Gregoriadis和B McCormack編輯的本次會(huì)議的會(huì)議錄(1996年出版中，Plenum出版社，紐約)中，Davis討論了在基因治療中，由于對(duì)抗導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物而導(dǎo)致的不良免疫反應(yīng)。她提出經(jīng)引入細(xì)胞內(nèi)的基因所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的研究對(duì)優(yōu)化基因治療方案和轉(zhuǎn)移基因的DNA-接種疫苗(基于DNA的免疫法)的應(yīng)用是非常重要的。她描述了與基于抗原的疫苗相比基因疫苗存在許多優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)她還描述了應(yīng)用裸露DNA進(jìn)行的基于DNA的免疫法對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
在同一次會(huì)議上，Behr描述了用于基因治療的多核苷酸序列的合成性載體，該載體是由縮合時(shí)據(jù)稱可自裝配在DNA周圍的脂多胺組成。多核苷酸旨在到達(dá)細(xì)胞核。發(fā)明者認(rèn)為這些自裝配的顆粒不由雙分子層所組成，所以它們不能被認(rèn)為是脂質(zhì)體。
在IPC的第二屆年會(huì)(于1996年10月23日至24日在美國(guó)華盛頓召開)——“基因疫苗和免疫治療策略”的準(zhǔn)備會(huì)議上，有消息說Felgner將報(bào)告應(yīng)用陽離子脂類以改進(jìn)編碼抗原的基因運(yùn)輸?shù)淖钚卵芯窟M(jìn)展。該基因通過鼻腔輸送進(jìn)入肺組織而激發(fā)粘膜免疫性。就在這一次準(zhǔn)備會(huì)議上，有人肯定Ledley將報(bào)告可控制生物利用度和DNA進(jìn)入粘膜細(xì)胞的含有陽離子脂類的基因輸送系統(tǒng)。該系統(tǒng)被期望用于誘發(fā)一種有效的免疫反應(yīng)。關(guān)于基因輸送是如何進(jìn)行的本次會(huì)議的公報(bào)并沒有給出更多的消息。
增加多核苷酸在脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)中的包封率是人們所期待的。而且，增加基因產(chǎn)物，特別是那些治療性的產(chǎn)物在動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)中的水平也是人們所期待的。增加基因到達(dá)靶細(xì)胞輸送率也是人們所期待的，其中基因產(chǎn)物在此作為一種抗原。而改善可編碼免疫原性多肽的多核苷酸的輸送率則更是人們所期待的，其中多肽可誘導(dǎo)產(chǎn)生一種期望的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的第一方面提供了一種新的組合物，它含有脂質(zhì)體和包封于脂質(zhì)體中的可編碼一種免疫原性多肽的多核苷酸，其中該多肽可誘導(dǎo)受試的人或動(dòng)物產(chǎn)生一種期望的免疫反應(yīng)。
在這份說明書中，術(shù)語“包封”是指多核苷酸位于囊泡內(nèi)。因而脂質(zhì)體應(yīng)在多核苷酸存在的情況下被制成。這和現(xiàn)有技術(shù)中由預(yù)制脂質(zhì)體和多核苷酸組成的復(fù)合物相反。
在本發(fā)明的這一方面中，基因產(chǎn)物應(yīng)是一種可誘導(dǎo)產(chǎn)生期望免疫反應(yīng)的抗原。因而，該肽類包含有一個(gè)或多個(gè)感染性微生物(如病毒、細(xì)菌或真菌)的抗原決定簇。本方法特別用于對(duì)抗細(xì)菌、真菌和病毒(特別是流感、HIV、乙型肝炎和丙型肝炎)的免疫反應(yīng)。因此，該基因產(chǎn)物可以是HBsAg和丙型肝炎核心蛋白，或者是一種流感病毒的抗原或一種抗原性的HIV肽類或片段。本發(fā)明中其它基因產(chǎn)物也很有價(jià)值，它可以是一種或多種單純皰疹病毒蛋白，一種癌癥病毒(如SV40)產(chǎn)物，或者是一種癌癥抗原，結(jié)核病抗原，甚至是多種復(fù)雜微生物(如寄生蟲瘧疾)的抗原。
在本發(fā)明中吸收脂質(zhì)體的靶組織可以是肌肉、皮膚、肝臟、將被破壞的脾臟癌細(xì)胞、粘膜細(xì)胞(例如鼻腔，肺部或腸道中)和特別是位于淋巴結(jié)的細(xì)胞?；蛞呙绲陌屑?xì)胞通常是一些抗原提呈細(xì)胞。該組合物可系統(tǒng)性施用，例如通過靜脈注射，或者直接將其施用到靶組織，例如鼻腔內(nèi)、粘膜內(nèi)或皮內(nèi)，甚至透皮或口腔給藥。本發(fā)明首次成功地通過皮下施用脂質(zhì)體而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這是本發(fā)明優(yōu)選的一方面，因此該組合物可皮下給藥。
在這份說明書中，術(shù)語“脂質(zhì)體”是指由一種雙分子層環(huán)繞而成的囊泡，該雙分子層通常由脂類成分和任選地非脂類成分組合而成。
使脂質(zhì)體的外部表面含有一種“尋靶”成分是人們所期待的，例如含有一種抗體，這有利于脂質(zhì)體識(shí)別靶組織。例如組合物被施用于循環(huán)系統(tǒng)中，外部表面附著細(xì)胞特異性配體的脂質(zhì)體將引導(dǎo)核酸到達(dá)靶細(xì)胞(Gregoriadis,1995)。
基因應(yīng)該以一種合適的形式存在從而可在靶細(xì)胞中產(chǎn)生期望的產(chǎn)物，因而優(yōu)選地，包括可促進(jìn)在靶細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因而多核苷酸應(yīng)包含一種啟動(dòng)子，及調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合的區(qū)域，且任選地也包括可增強(qiáng)基因表達(dá)的其它一些區(qū)域。
該多核苷酸可以是RNA，但是優(yōu)選DNA。通常是采用質(zhì)粒的形式，而優(yōu)選采用基本上非復(fù)制型的質(zhì)粒，因?yàn)閷?duì)本發(fā)明的這一方面來說，維持暫時(shí)的活力達(dá)幾周或幾個(gè)月通常是適合的。
在本發(fā)明的這一方面，用于制備脂質(zhì)體的脂質(zhì)體形成成分包括中性、兩性、陰離子和/或陽離子脂類成分。通常，使用相對(duì)數(shù)量的這些成分以使脂質(zhì)體的總體帶電荷，或者不甚優(yōu)選地使脂質(zhì)體總體帶電荷為零。在本發(fā)明的這一方面中，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用可使脂質(zhì)體總電荷為正電荷的脂類成分能提供改進(jìn)的結(jié)果，例如使用該脂質(zhì)體來輸送編碼抗原的基因可增加免疫反應(yīng)。另外，除了通常意義上的脂類成分(包括甘油酯和膽固醇)，脂質(zhì)體形成成分可包括一些非脂類成分(即非天然產(chǎn)生的脂類)，如非離子或陽離子表面活性劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案，新的組合物含有由一些脂質(zhì)體形成成分制備而成的脂質(zhì)體，包括至少一種帶正電荷的成分，其在數(shù)量上應(yīng)使脂質(zhì)體顯示出總體呈正電性。
據(jù)信，這是首次把多核苷酸包封到一種陽離子脂質(zhì)體中。因此本發(fā)明的第二方面，提供了一些由脂質(zhì)體形成成分制備而成的脂質(zhì)體，和編碼一種期望多肽產(chǎn)物的多核苷酸，其特征在于多核苷酸包封于脂質(zhì)體內(nèi)，其中脂質(zhì)體形成成分中包含有至少一種帶正電荷的成分。
因而，本發(fā)明在體外系統(tǒng)中證明了與其它一些使用不帶電荷的脂質(zhì)體或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體的方法相比，編碼熒光素酶標(biāo)記蛋白的DNA的包封可提高熒光素酶的表達(dá)水平。而該表達(dá)水平與應(yīng)用預(yù)制帶正電荷的脂質(zhì)體(商業(yè)上可獲得的LipofectAMINE(商標(biāo)))復(fù)合物時(shí)的表達(dá)水平相比則要低一些。人們期望通過包封可使該復(fù)合物原先體內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)核酸酶的攻擊之抗性得以改進(jìn)。另外，我們發(fā)現(xiàn)這些脂質(zhì)體不能迅速聚集，而對(duì)混合的預(yù)制脂質(zhì)體-多核苷酸系統(tǒng)來說特別是存在血清蛋白質(zhì)條件下，能夠發(fā)生這樣的聚集。多核苷酸的包封可提高在脂質(zhì)體表面上“尋靶”配體的自由度，或可使對(duì)含有活性成分的脂質(zhì)體進(jìn)行其它表面處理的自由度增加。人們期望獲得模式蛋白質(zhì)熒光素酶的高表達(dá)水平，而這樣的基因產(chǎn)物是一種可誘導(dǎo)發(fā)生一種期望免疫反應(yīng)的抗原。
上述結(jié)果已經(jīng)為一些實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，這些實(shí)驗(yàn)表明利用由脂質(zhì)體包封的pRc/CMV HBS(編碼乙型肝炎表面抗原S區(qū)，ayw亞型)通過多種途徑所接種的老鼠可產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這與老鼠是近親交配(Balb/c)還是遠(yuǎn)系繁殖(T/O)及注射的途徑(肌肉注射(im)，皮下注射(sc)，靜脈注射(iv)和腹膜內(nèi)注射(ip))無關(guān)。與同等條件下應(yīng)用裸露的DNA方法相比，本方法所產(chǎn)生的大多數(shù)免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)(請(qǐng)看下面的實(shí)施例5)。
在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，陽離子成分被整合到脂質(zhì)體中，這些成分可以是為提高轉(zhuǎn)染率而在制備脂質(zhì)體時(shí)與多核苷酸復(fù)合的任何一種物質(zhì)。這些成分可以是脂性或非脂性的化合物，且可以是合成或天然的。優(yōu)選的陽離子脂類是1、2-二(油酰氧基)-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP),1、2-二(十六烷氧基)-3-三甲基氨基丙烷(BisHOP),N-[1-(2、3-二油酰氧基)丙基]-N、N、N-三甲基氯化銨(DOTMA)和其它一些如US-A-4,897,355中的Ⅰ型結(jié)構(gòu)的脂類(此處引入作為參考)或酯類似物。其結(jié)構(gòu)如下所示
或者是上述物質(zhì)的光學(xué)異構(gòu)體。其中Y1和Y2可相同也可不同，且它們是-O-或O-C(O)-，其中羰基碳依情況可與R1或R2相連；R1和R2可以獨(dú)立地是一種含6－24個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基，R3、R4和R5可以獨(dú)立地是氫原子、1－8個(gè)碳原子的烷基、6－11個(gè)碳原子的芳基或芳烷基；或者，R3、R4和R5中的兩個(gè)或三個(gè)與帶正電荷的氮原子接合而形成一個(gè)含有5－8個(gè)原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；環(huán)狀結(jié)構(gòu)中除了帶正電荷的氮原子外，還有碳原子，且還可包括氧、氮或硫原子；n為1－8；且X是一種陰離子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物中R1和R2各自有0－6個(gè)不飽和鍵，結(jié)構(gòu)如下CH3－(CH2)a－(CH=CH－CH2)b－(CH2)c-其中，a與c之和從1－23；且b為0－6。最優(yōu)選的，R1和R2均是油?；?。特別優(yōu)選的實(shí)施方案中組合物所含的長(zhǎng)鏈烷基基團(tuán)為脂肪酸，即Y1和Y2相似，均為-O-C(O)-。
或者，我們可使用或US-A-5,459,127中所示的Ⅰ型通式結(jié)構(gòu)的或Ⅱ型通式結(jié)構(gòu)的陽離子脂類(此處引入作為參考)。
其它一些合適的陽離子化合物是非脂類成分硬脂酰胺(SA)和3β[N-(N’N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)(一種脂性成分)。
除了含有陽離子成分外，脂質(zhì)體通常也含有一些非離子和/或兩性離子的成分，包括脂成分，其可以是磷脂類或其它一些不含有磷脂?；鶊F(tuán)的脂類。優(yōu)選地，這些脂類應(yīng)包含有磷脂，如任何一種天然或合成的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸，任一這些磷脂的長(zhǎng)鏈烷基基團(tuán)(可通過酯鍵或醚鍵連接)可以是飽和或不飽和的。優(yōu)選地，甘油酯的?；鶊F(tuán)是不飽和的。這樣的成分包括一些非脂性成分，如非離子的表面活性劑[如山梨聚糖的脂肪酸單酯，和/或乙氧基脂肪酸或其它一些類似物(如乙氧基羊毛脂)]。
如果脂質(zhì)體含有聚集性的脂類成分則可以獲得最好的結(jié)果，該類成分通常是一些含不飽和?；鶊F(tuán)的磷脂酰乙醇胺。膽固醇也應(yīng)屬于此類成分，盡管就使多核苷酸充分輸運(yùn)進(jìn)到靶細(xì)胞而言它看起來可使脂質(zhì)體過于穩(wěn)定。
陽離子成分的數(shù)量?jī)?yōu)選的占到脂質(zhì)體形成成分總摩爾數(shù)的5－50％，優(yōu)選地，應(yīng)占到10－25％摩爾數(shù)。
脂質(zhì)體組合物通常為一種水性懸浮液的形式，例如一種生理性緩沖液?；蛘撸部墒且环N用于再水化的干組合物。
脂質(zhì)體可應(yīng)用任一常規(guī)制備脂質(zhì)體的技術(shù)來獲得。脂質(zhì)體產(chǎn)物可以是多層或單層囊泡，且可以相對(duì)大一些(囊泡直徑范圍為300－2000nm，優(yōu)選的平均直徑為500－1000nm)，或小一些(囊泡直徑范圍為100－400nm，優(yōu)選的平均直徑為200-300nm)。優(yōu)選地，這些脂質(zhì)體的平均直徑不超過500nm，且優(yōu)選的基本上直徑都小于2000nm。
該類脂質(zhì)體優(yōu)選的通過如下的方法來制備，形成囊泡后與要被包封的核苷酸混合，再進(jìn)行脫水處理，優(yōu)選為冷凍干燥。接著，應(yīng)在水溶液組分中進(jìn)行再水化以制備脫水-再水化囊泡(DRV)，然后優(yōu)選地再經(jīng)過微流態(tài)化處理以減小囊泡的平均粒徑。優(yōu)選地，在進(jìn)行再水化和/或微流態(tài)化處理之后，應(yīng)通過離心或分子篩色譜的方法把沒有被包封的材料與脂質(zhì)體分離。
本發(fā)明提出了使用DRV可增加多核苷酸的包封水平的方法。如本發(fā)明的第一方面的方法提供了一種把多核苷酸包封到脂質(zhì)體中的方法，包括步驟1．制備一種水性懸浮液，其中含有裸露的多核苷酸和預(yù)制的脂質(zhì)體，該多核苷酸有效地編碼一種免疫原性多肽，該多肽可誘發(fā)受試的人或動(dòng)物產(chǎn)生一種期望的免疫反應(yīng)，2．將該懸浮液冷凍干燥，3．將第二步的產(chǎn)物進(jìn)行再水化，4．將由第三步所得的脫水-再水化囊泡的水性懸浮液進(jìn)行微流態(tài)化處理；且5．任選地將沒有被包封的多核苷酸從脂質(zhì)體中分離。
如本發(fā)明的第二方面的方法提供了一種把多核苷酸包封到脂質(zhì)體中的方法，包括步驟1．制備一種水性懸浮液，其中含有裸露的多核苷酸和預(yù)制的陽離子脂質(zhì)體，
2．將制得的懸浮液冷凍干燥，3．將第二步的產(chǎn)物進(jìn)行再水化，4．任選地將由第三步所得的脫水-再水化囊泡的水性懸浮液進(jìn)行微流態(tài)化處理；且5．將沒有被包封的多核苷酸從脂質(zhì)體中選擇性地分離。
本發(fā)明兩種方法中的脫水-再水化處理基本上與1984年Kirby和Gregoriadis所報(bào)告的方法一樣(該方法的內(nèi)容此處引入作為參考)。因而分別地，由步驟1中所得的是小單層脂質(zhì)體(SUV)，而由步驟3中得到的多為多層脂質(zhì)體(MLV)。步驟3所得的脂質(zhì)體產(chǎn)物通常被稱為脫水再水化囊泡(DRV)。DRV的微流態(tài)化處理基本上與WO-A-92/04009所報(bào)告的方法一樣，該方法于1990年由Gregoriadis等人公開(此處引入作為參考)。
通過應(yīng)用DRV技術(shù)，本發(fā)明人已經(jīng)建立了能使整個(gè)溶質(zhì)的包封率達(dá)到10％以上的方法。本發(fā)明人也建立了能把高達(dá)90％甚至更多的存在于水性懸浮液中的多核苷酸經(jīng)過冷凍干燥處理包封到脂質(zhì)體中的方法。而且，盡管微流態(tài)化可導(dǎo)致被整合的多核苷酸的百分?jǐn)?shù)減少，但仍然可使多核苷酸的包封率超過10％，例如高達(dá)50％。多核苷酸包封到脂質(zhì)體組合物中的水平優(yōu)選是0.05－5μg/μmol脂類的范圍，更優(yōu)選的為0.1－1.0μg/μmol，更優(yōu)選為0.2－0.5μg/μmol脂類(或者0.1－10μgDNA/mg脂類)。
本發(fā)明的這一方面可優(yōu)選用來制備頭兩方面的脂質(zhì)體。
本發(fā)明第二方面中，作為另一種產(chǎn)物，盡管多核苷酸優(yōu)選編碼免疫原性的多肽，其可使受試個(gè)體產(chǎn)生期望的免疫反應(yīng)，但脂質(zhì)體也可用來輸送具有其它用途的基因，例如可用來進(jìn)行基因替代療法、基因增加療法、基因免疫療法(如可用于癌癥治療)、引入編碼具有治療作用的活性多肽基因和引入編碼細(xì)胞毒素的基因(即對(duì)細(xì)胞具有毒性作用的化合物，如可用于殺死癌細(xì)胞)。
本發(fā)明也包括一些新的脂質(zhì)體的使用或應(yīng)用本發(fā)明的一些新方法制備的脂質(zhì)體，它們可應(yīng)用于制備用于治療或預(yù)防方法中的組合物。例如其方法可以是通過免疫法(接種疫苗)使受試的人或動(dòng)物避免受到感染性微生物的感染?；蛘?，可用于免疫治療的基因產(chǎn)物所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，例如用于治療癌癥。另外，多核苷酸可用于在基因增加或基因替代療法。
本發(fā)明也提供了由第一方面或第二方面的一種新的組合物在體外的一個(gè)新用途，或是提供了本發(fā)明方法的產(chǎn)物在進(jìn)行人或動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的一個(gè)新用途。這些細(xì)胞可隨后在體外進(jìn)行培養(yǎng)，且/或可隨之被植入到提供這些細(xì)胞的病人體內(nèi)。因而本發(fā)明包括一種離體移植方法，例如在WO-A-93/14778中所描述的方式，其內(nèi)容此處引入作為參考。
本發(fā)明也提供了一種新的藥物組合物和一種藥物可接受的載體，該組合物包括如第一方面的脂質(zhì)體組合物或第二方面的產(chǎn)物。該組合物可適合通過注射給藥，如靜脈注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)、腹膜內(nèi)注射(i.p.)、口服或皮下注射(s.c.)?；蛘?，該組合物適合通過吸入方式經(jīng)鼻腔給藥或直接輸送到肺部，或者適合透皮輸送?？梢允褂贸Ｒ?guī)的適于脂質(zhì)體給藥的藥用載體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明允許使用肌肉注射的方法來注射使用cDNA，然而，對(duì)過去用作疫苗的裸露的DNA，人們必須遵守特別高度控制的注射方法以避免對(duì)肌肉組織的損害，且要注意在完全相同的部位進(jìn)行注射以得到可靠的可比性結(jié)果。例如，已發(fā)現(xiàn)肌肉再生藥物必須提前給藥以增強(qiáng)反應(yīng)。
本發(fā)明也提供了一種新的治療方法，該方法中把新的藥物組合物施用于受試的人或動(dòng)物。因而該方法是一種通過多核苷酸編碼的一種抗原(例如一種感染性微生物的抗原)來誘發(fā)一種免疫反應(yīng)的方法?；蛘?，該方法是一種可用于免疫治療、用于基因替代或基因增加治療的方法，例如用于癌癥治療或用來施用編碼具有藥用多肽的多核苷酸。
下面的實(shí)施例闡明了本發(fā)明。在一些實(shí)施例中，編碼熒光素酶的DNA被作為一種模式多核苷酸，而熒光素酶則是一種模式基因產(chǎn)物。
附圖則展示了一些實(shí)施例的結(jié)果

圖1是一系列直方圖，顯示了實(shí)施例2和圖表4的結(jié)果。
圖2是一系列直方圖，顯示了實(shí)施例3的結(jié)果。
圖3是一系列直方圖，顯示了實(shí)施例4的結(jié)果。
圖4～8是一系列直方圖，顯示了實(shí)施例5的結(jié)果。
實(shí)施例1——編碼熒光素酶的DNA的包封和復(fù)合及細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染材料卵磷脂酰膽堿(PC)、硬脂酰胺(SA)和1、2-二(十六烷氧基)-3-甲基氨基丙烷(BisHOP)的來源和級(jí)別已有描述(Tan和Gregoriadis,1989)。N-[1-(2、3-二油酰氧基)丙基]-N、N、N-三甲基氯化銨(DOTMA)由GeneMedicine贈(zèng)送(休斯頓，德克薩斯，美國(guó))。磷脂酰絲氨酸(PS)和二油?；字Ｒ掖及?DOPE)來自Sigma化學(xué)公司(Poole,Dorset，英國(guó))。用于表達(dá)由SV40啟動(dòng)子開始的熒光素酶報(bào)告基因的pGL2對(duì)照(約3.99×106道爾頓)的真核細(xì)胞表達(dá)載體是從Promega(南安普頓，英國(guó))購(gòu)買。使用前按15∶1(wt∶st)比例，在含有GLUTAMAX1(Gibco BRL)的OptiMEM 1減少的血清培養(yǎng)基中，把陽離子LipofectAMINE(獲自Gibco BR,Paisly，英國(guó))與pGL2相混合。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(牛的胰臟，Ⅱ型，比活性2500Kunitz單位/mg蛋白)從Sigma化學(xué)公司購(gòu)買。RQ1脫氧核糖核酸酶(1單位/μl)和熒光素酶檢測(cè)體系試劑盒從Promega購(gòu)買。pGL2質(zhì)粒DNA用35S-dATP(37kBq；ICN Flow,Thame，英國(guó))應(yīng)用Wheeler和Coutelle方法(1995)進(jìn)行放射性標(biāo)記。所有的其它試劑均為分析純。方法質(zhì)粒DNA整合到脂質(zhì)體中將pGL2質(zhì)粒DNA摻入到脂質(zhì)體中時(shí)應(yīng)用了脫水-再水化的方法(Kirby和Gregoriadis,1984)。簡(jiǎn)而言之，2ml小單層囊泡(SUV)分別含有PC(16μmol)和DOPE(摩爾比為1∶1)；PC(16μmol)、DOPE和PS(摩爾比為1∶1∶0.5，帶負(fù)電荷)；PC(16μmol)、DOPE和SA或BisHOP(摩爾比為1∶1∶0.5，帶正電荷)；PC(16μmol)、DOPE和DOTMA(摩爾比為1∶1∶0.25，帶正電荷)；和DOPE(16μmol)和DOTMA(摩爾比為1∶0.25，帶正電荷)。應(yīng)用已知方法(Kirby和Gregoriadis,1984)進(jìn)行制備這些小單層囊泡，隨之與10－100μg(10－100μl)已預(yù)先加入了痕量35S標(biāo)記的質(zhì)粒DNA pGL2(6×104－7×104dpm)的pGL2相混合，冷凍干燥過夜。隨之進(jìn)行可以控制的再水化處理(Kirby和Gregoriadis,1984)，從而得到多層脫水-再水化囊泡(DRV)(Gregoriadis等，1993)，然后以40000xg離心25分鐘以除去沒有摻入的DNA。這些脂質(zhì)體小球懸浮在含有0.9％的NaCl,pH為7.2的0.1M的磷酸鈉緩沖液(PBS)中，再次離心。把清洗過的小球再次懸浮于PBS中，并在4℃儲(chǔ)存待用。在分離實(shí)驗(yàn)中，把混有游離未摻入的DNA之如上含有DNA的DRV用M110S型微流態(tài)化儀(Microfluidics,Newton,MA，美國(guó))進(jìn)行微流態(tài)化處理，一共進(jìn)行3個(gè)循環(huán)或1、2、3、5和10個(gè)循環(huán)(僅僅針對(duì)PC∶DOPE∶DOTMA型脂質(zhì)體)。從微流態(tài)化處理的脂質(zhì)體中把摻入的DNA與游離的DNA分離可采用上述離心的方法(1、2、3和5個(gè)循環(huán))，或者使用分子篩色譜法(10個(gè)循環(huán))。色譜法中，使用了Sepharose 4B CL柱(Pharmacia)(Gregoriadis等，1990)。在一些實(shí)驗(yàn)中，預(yù)制的DRV(不含DNA)與10或50μgDNA混合，隨之將混合物在20℃溫育20小時(shí)或進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的微流態(tài)化處理。對(duì)這兩種情況，均采用上述離心的方法把吸收的DNA從未被吸收的DNA中分離。根據(jù)從懸浮小球(非微流態(tài)化處理的DRV和進(jìn)行1、2、3或5個(gè)循環(huán)微流態(tài)化處理的DRV)或色譜法中的洗脫級(jí)分(進(jìn)行10個(gè)循環(huán)微流態(tài)化處理的DRV)所回收得到35S的放射活性可以估計(jì)DNA摻入到脂質(zhì)體中或吸收到脂質(zhì)體表面的數(shù)量。光子相關(guān)色譜法應(yīng)用Malvern Autosizer IIc測(cè)量非微流態(tài)化的和微流態(tài)化處理的DRV的Z-平均粒徑，該方法在其它地方已有報(bào)道(Gregoriadis等，1993；Gregoriadis等，1990)。含有脫氧核糖核酸酶的脂質(zhì)體的溫育在1mIPBS中，把整合有pGL2質(zhì)粒DNA(0.75－22.5μg)和痕量35S標(biāo)記的pGL2質(zhì)粒DNA之經(jīng)微流態(tài)化處理(3個(gè)循環(huán))和未經(jīng)微流態(tài)化處理的DRV與100個(gè)單位的脫氧核糖核酸酶Ⅰ相混合，并在37℃溫育10分鐘。用1μl的0.5M的EDTA(pH8)終止反應(yīng)，再采用離心的方法把經(jīng)消化的脂質(zhì)體DNA從未消化的脂質(zhì)體DNA中分離出來。根據(jù)上清液中釋放出的放射活性可以估計(jì)出消化的DNA。預(yù)實(shí)驗(yàn)已證明在同等條件下100μg的裸露pGL2可以被完全降解。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，含有2μgDNA的相似的脂質(zhì)體樣品用一種含50mM二硫蘇糖醇和50μg/ml牛血清白蛋白(組分V,Sigma化學(xué)公司)的緩沖液稀釋到100μl，再與1個(gè)單位的RQ1脫氧核糖核酸酶(Promega)相混合且在37℃溫育30分鐘。加入1μl的0.5M的EDTA(pH8)終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳把非微流態(tài)化處理或進(jìn)行微流態(tài)化處理的包封有DNA的DRV樣品采用上述方法和或不和RQ1脫氧核糖核酸酶一起溫育，然后用苯酚-氯仿混合物萃取兩次以除去脂類物質(zhì)。加入乙醇使水層中的DNA沉淀出來，把沉淀物重懸于20μl的TE緩沖液(10mM的Tris-Cl,pH8；1mM的EDTA,pH=8)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析以測(cè)定DNA的完整性。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)在含有200mM的FLUTAMAX I(含有10％的胎牛血清)的Dulbecco’s修飾過的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)猴腎臟COS-7上皮細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化處理收獲細(xì)胞，隨之種植到24孔平板上(Falcon,5×104個(gè)細(xì)胞/每孔)，并溫育18－24小時(shí)。對(duì)含有鋪滿程度達(dá)70－80％的粘附細(xì)胞的小孔采用Dulbecco’s磷酸緩沖鹽液(不含鈣或鎂，pH=7.2,GibcoBRL)進(jìn)行沖洗，然后與1μg(6－18μl)脂質(zhì)體包封1μg的pGL2 DNA或復(fù)合有1μg的pGL2 DNA的LipofectAMINE(約24μg脂質(zhì))于0.5ml的含有GLUTAMAX I的OptiMEM 1減少的血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。在37℃溫育4－6小時(shí)后，移出轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。用1ml DMEM完全培養(yǎng)基所取代。細(xì)胞總共溫育48小時(shí)，再刮到200μl的細(xì)胞裂解緩沖液(Promega)中進(jìn)行細(xì)胞裂解處理(用干冰進(jìn)行一輪冷凍-融解處理可增強(qiáng)細(xì)胞的裂解)，然后將該混合物于12000xg離心5分鐘，獲得澄清的上清液。該上清液平均分為三份后用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定，使用LKB 1251型發(fā)光計(jì)，且記錄光發(fā)射的總時(shí)間超過60秒。應(yīng)用Bradford方法(1976)測(cè)定了每個(gè)細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，該方法使用了Bio-Rod蛋白分析液。熒光素酶活性以每毫克蛋白所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光單位來表示(RLU/mg)。結(jié)果質(zhì)粒DNA摻入到直徑為710－843nm的中性DRV中[實(shí)施例1.1.(1－6)]，該DRV使用了一種非常好的磷脂(含有PC和DOPE,Legendre和Szoka,1995)以幫助轉(zhuǎn)染；或摻入補(bǔ)加負(fù)電性的兩性物質(zhì)[590－871nm，實(shí)施例1.2.(1－5)]或正電性的兩性物質(zhì)[為647－899nm，實(shí)施例1.3.(1－6)、1.4.(1－4)和1.5.(1－2)]的相似的脂質(zhì)體。帶電囊泡的雙分子層表面已知可使雙分子層之間含有更多體積的液體(Bangham等，1974)，因而這可溶解更多的溶質(zhì)。對(duì)于帶負(fù)電的DNA，由于靜電相互作用可進(jìn)一步改善它和帶正電的脂質(zhì)體(陽離子DRV)的摻入。表1顯示在中性DRV中摻入的DNA相當(dāng)可觀(44－55％)；在負(fù)電性DRV中，多種量的DNA(10－100μg)的摻入仍然可達(dá)到45－63％[實(shí)施例1.1.(1－6)和1.2.(1－5)]。而且，絕大多數(shù)DNA被吸收到脂質(zhì)體表面而不是摻入到其內(nèi)部的概率不大。預(yù)制DRV和裸露的DNA共同溫育，經(jīng)離心回收時(shí)僅僅可導(dǎo)致中等程度的DRV(12－13％)被回收[實(shí)施例1.1.7和1.2.(6－7)]。在存在未摻入的(游離)DNA的情況下對(duì)類似的含有DNA的DRV進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的微流態(tài)化處理可使中性DRV中較小粒徑的(209－329nm)脂質(zhì)體DNA的含量顯著減少(達(dá)到10－20％)，而對(duì)電負(fù)性的脂質(zhì)體則減少得較少(達(dá)到37－51％)[實(shí)施例1.1.(1－6)和1.2.(1－5)]。另外，在存在游離DNA的情況下對(duì)預(yù)制的DRV進(jìn)行微流態(tài)化處理時(shí)，只有非常少量的(6％和10％)DNA與脂質(zhì)體被回收[實(shí)施例1.1.7和1.2.(6－7)]。
和預(yù)計(jì)的一樣，DNA在陽離子SA、BisHOP和DOTMA等DRV中的摻入是非常高的(62－92％)，且經(jīng)微流態(tài)化處理的DRV[269－383nm，實(shí)施例1.3.(1－6)、1.4.(1－4)和1.5.(1－2)]其值仍然很高(50－83％)。但是，帶有裸露的DNA的預(yù)制陽離子DRV(SA)經(jīng)溫育或微流態(tài)化處理后，大約40－60％的材料和脂質(zhì)體一起被回收，這可能是囊泡表面的結(jié)合[實(shí)施例1.3.(7－9)]。脂質(zhì)體DNA和脫氧核糖核酸酶共同溫育表1顯示了摻入中性脂質(zhì)體的DNA(45－72％)、摻入負(fù)電性脂質(zhì)體的DNA(58－69％)或摻入正電性脂質(zhì)體的DNA(68－86％)不會(huì)被DNA酶所降解。相反，接觸該酶的吸收在中性或負(fù)電性脂質(zhì)體表面的DNA的回收率卻較低(18％)(實(shí)施例1.1.7和1.2.6)。但是，相當(dāng)量的吸收在正電性脂質(zhì)體(SA)表面的DNA(41－58％)卻不會(huì)被該酶所降解[實(shí)施例1.3.(7－8)]。這可能是由于陽離子囊泡可使DNA呈濃縮狀態(tài)進(jìn)而對(duì)DNA酶具有抵抗力(Legendre和Szoka,1995)。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，在摻入過程結(jié)束時(shí)DNA摻入在陽離子脂質(zhì)體中的比例(與吸附在其表面相對(duì))很困難精確估計(jì)。
通過將裸露的DNA或脂質(zhì)體DNA接觸RQ1脫氧核糖核酸酶及隨之進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，可以證實(shí)脂質(zhì)體DNA對(duì)DNA酶的脆弱性的結(jié)果。根據(jù)染色的強(qiáng)度和是否出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，我們可以看到裸露的質(zhì)粒DNA可被完全消化，而包封在陽離子脂質(zhì)體中的DNA卻被充分保護(hù)。另一方面，通過DNA酶消化的樣品的較輕區(qū)帶和未被消化的樣品相比所鑒定，也可發(fā)現(xiàn)在中性和負(fù)電性DRV中的DNA不能被很好保護(hù)。用脂質(zhì)體pGL2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染用摻入在非微流態(tài)化處理的DRV脂質(zhì)體中的pGL2質(zhì)粒DNA對(duì)COS-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)中，或者用與LipofectAMINE復(fù)合的pGL2質(zhì)粒DNA對(duì)COS-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，其中LipofectAMINE是一種對(duì)照，且對(duì)每種形式的DRV制劑都進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察在背景上顯示熒光素酶活性的顯著水平。但是，陽離子DRV(DOPE∶DOTMA、PC∶DOPE∶DOTMA和PC∶DOPE∶SA)中熒光素酶的活性大約比中性(PC∶DOPE)和負(fù)電性(PC∶DOPE∶PS)及同為陽離子的PC∶DOPE∶BisHOP脂質(zhì)體中該酶活性高10倍(見表2)。由于脂質(zhì)體的粒徑可能與轉(zhuǎn)染效率有關(guān)，所以對(duì)摻入經(jīng)微流態(tài)化處理(1、2、3、5或10個(gè)循環(huán))的DRV中的DNA也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而產(chǎn)生了粒徑持續(xù)變化的小粒徑囊泡(Z-平均直徑分別為386、319、262、235和123nm，結(jié)果沒有顯示)。表2表明PC∶DOPE∶DOTMA的DRV的微流態(tài)化處理(3個(gè)循環(huán))可提高它們的轉(zhuǎn)染率約10倍。但是，經(jīng)5或10個(gè)循環(huán)微流態(tài)化處理的PC∶DOPE∶TOTMA、DOPE∶DOTMA、PC∶DOPE和PE∶DOPE∶PS脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并沒有顯示出顯著的熒光素酶活性(結(jié)果沒有顯示)，這可能是由于微流態(tài)化處理可誘導(dǎo)DNA產(chǎn)生漸變的彌散。
在所有測(cè)檢的DRV制劑中，正電性的SA和DOTMA DRV比其它類型的DRV更加有效，其中微流態(tài)化處理的制劑(DOTMA)顯示了最高的轉(zhuǎn)染率。但是，即使這種制劑的轉(zhuǎn)染率與對(duì)照組的LipofectAMINE相比約小10－15倍。
表1
BH=BisHOP
表2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光素酶的活性
Mfx3-微流態(tài)化處理3個(gè)循環(huán)實(shí)施例2——體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的免疫反應(yīng)應(yīng)用如上所述及實(shí)施例1來源的材料(及來自C Kirby博士的3β[N-(N’N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲?；鵠-膽固醇和DC-CHOL以及DOTAP(1、2-二油?；趸?3-三甲基銨丙烷)，進(jìn)行一些實(shí)驗(yàn)以測(cè)定體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的免疫反應(yīng)。多核苷酸是表達(dá)乙型肝炎表面抗原的質(zhì)粒DNA[ayw型的pRc/CMV-HBS質(zhì)粒的S區(qū)(Davis HL等)]。用16毫摩爾(12mg)的PC與多種陽離子脂類(如表所述)按照表中的比例相混合而制成相應(yīng)的脂質(zhì)體。通過將上述成分混合在水性懸浮液中(參照上述Eppstein所提供的現(xiàn)有技術(shù))，采用實(shí)施例1所用方法可以把質(zhì)粒DNA包封在脂質(zhì)體中(所用數(shù)量如表所述)，或者制成預(yù)制陽離子脂質(zhì)體與DNA的復(fù)合物。
隨后，把包封有DNA的脂質(zhì)體、所制成的復(fù)合物和裸露的DNA施用于小鼠進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。以施用μg DNA的量的制劑對(duì)分為3到4組的小鼠肌肉內(nèi)注射(后腿)。質(zhì)粒DNA或用實(shí)施例1的方法包封到脂質(zhì)體中(用量如表所示)，或與預(yù)制的陽離子脂質(zhì)體及DNA復(fù)合，方法是與水性懸浮液中的組分混合(利用與先有技術(shù)Eppstein(見前述)相似的方法)。
隨后，把包封有DNA的脂質(zhì)體、制成的復(fù)合物和裸露的DNA施用于小鼠進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表4中所示的多種DNA的水平，將上述制劑以肌肉內(nèi)(后腿)注射的方式注射到分為三或四組的Balb/c小鼠體內(nèi)。對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)來說，注射到小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)體制劑中脂類的數(shù)量基本上是固定的，范圍約為1～2mg的總PC脂類。
接著從小鼠取血并用ELISA技術(shù)對(duì)血清進(jìn)行免疫反應(yīng)測(cè)定。在這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了ayw型乙型肝炎的S區(qū)抗原，按Davis等人所報(bào)道的方法進(jìn)行的ELISA實(shí)驗(yàn)。利用實(shí)驗(yàn)測(cè)定了抗-HBS Ag(ayw型的S區(qū))的IgG1、IgG2a和IgG2b。獲得免疫反應(yīng)以血清稀釋直至吸收度讀數(shù)(在辣根過氧化酶ELISA實(shí)驗(yàn)中)為0.200的血清稀釋度的常用對(duì)數(shù)(log10，均值±標(biāo)準(zhǔn)差)來表示[。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表4，在第0、10、20、27和37天對(duì)小鼠進(jìn)行注射并在第26、34和44天進(jìn)行取血。在表5所示結(jié)果中，在第0、7、14、21和28天對(duì)小鼠進(jìn)行注射并在第21和28天取血。結(jié)果和討論表3質(zhì)粒DNA在脂質(zhì)體中的包封率
>
表4應(yīng)用游離或脂質(zhì)體包封的DNA進(jìn)行免疫的小鼠的免疫反應(yīng)*(ELISA結(jié)果±SD)<
ND意思是沒有測(cè)定*ELISA實(shí)驗(yàn)中讀數(shù)約為0.200時(shí)稀釋倍數(shù)的常用對(duì)數(shù)(log10)參見圖1，其中A表示含有DOTAP的脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B表示含有DC-Chol的脂質(zhì)體的結(jié)果，C表示含有等量硬脂酰胺的脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表中未顯示)，D表示應(yīng)用裸露DNA所對(duì)應(yīng)的結(jié)果，每種情況下，施用5MgDNA白色條對(duì)應(yīng)IgG1的值，黑色條對(duì)IgG2a的值，斑點(diǎn)條對(duì)應(yīng)TgG2b的值。
表5應(yīng)用裸露，復(fù)合和包封的DNA進(jìn)行免疫的小鼠的免疫反應(yīng)(ELISA結(jié)果±SD)
上表中P列顯示了所示結(jié)果與其它不同的置信水平的學(xué)生配對(duì)T-檢驗(yàn)的結(jié)果。
表3顯示了含有陽離子脂類的脂類組合物的包封百分?jǐn)?shù)特別高。預(yù)制脂類與質(zhì)粒DNA的復(fù)合率也是非常高的。在每種情況下，使用100μg或150μg的DNA對(duì)包封率百分?jǐn)?shù)/復(fù)合率并沒有影響。
表4和圖1顯示了，與應(yīng)用裸露DNA引起的免疫反應(yīng)相比，使用包封的編碼HBsAg的DNA免疫小鼠所引起的免疫反應(yīng)要高很多。這種作用從實(shí)驗(yàn)的第26天開始就一直很明顯，并且隨實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)而更加顯著。從全部血樣中來看，這一作用對(duì)于IgG1最為顯著，與應(yīng)用裸露的DNA傳遞相比，這種作用也可使IgG2a和IgG2b的水平有增加。
表5的結(jié)果顯示對(duì)裸露的DNA來說，甚至在首次注射DNA28天以后，仍然沒有觀察到反應(yīng)。
對(duì)于包封在中性脂質(zhì)體(PC、DOPE)中的DNA，在第21天免疫反應(yīng)仍沒有增加，但高劑量的DNA注射28天后可使反應(yīng)有輕微增加。與施用裸露的DNA后的反應(yīng)相比，這樣的增加十分明顯。
對(duì)于由預(yù)制陽離子脂質(zhì)體和DNA組成的復(fù)合物，從實(shí)驗(yàn)開始的第28天起，兩種施用DNA的水平引起的免疫反應(yīng)看起來有所發(fā)展，并且與使用裸露的DNA相比，所引起的免疫反應(yīng)要更加顯著。但是，免疫反應(yīng)沒有與用包封在陽離子脂質(zhì)體中的DNA引起的免疫反應(yīng)那么高。
對(duì)包封有DNA的陽離子脂質(zhì)體，首次注射21天后(注射的DNA為10μg)，其免疫反應(yīng)就高于其它任何一個(gè)實(shí)施例；但是注射1μg包封在陽離子脂質(zhì)體中的DNA所引起的免疫反應(yīng)與其它實(shí)施例中施用1μgDNA的結(jié)果沒有顯著差異。28天后，與應(yīng)用高或低水平的裸露DNA相比，這種低劑量(1μg)的DNA施用可使免疫反應(yīng)顯著增加。但是，對(duì)于與陽離子脂質(zhì)體復(fù)合的DNA和包封在中性脂質(zhì)體中的DNA來說，應(yīng)用這種低劑量時(shí)所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)并沒有顯著差異。對(duì)于應(yīng)用了較高劑量(10μg)的包封在陽離子脂質(zhì)體中的DNA,28天后的免疫反應(yīng)明顯要高于其它任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3——使用裸露、復(fù)合或脂質(zhì)體包封的質(zhì)粒DNA免疫小鼠后其脾臟中細(xì)胞因子的水平在實(shí)驗(yàn)的第0、7、14、21和28天，以肌肉注射的方式分別對(duì)分為四組的Balb/c小鼠(與實(shí)施例2相同的方法和實(shí)驗(yàn))給予了1μg(白色條)或10μg(黑色條)pRc/CMV HBS,pRc/CMV HBS分別為下述形式包封在由PC、DOPE和DOTAP組成的正電性脂質(zhì)體中(A)、包封在由PC和DOPE組成的不帶電脂質(zhì)體中(B)、與預(yù)制陽離子DOTAP脂質(zhì)體所組成的復(fù)合物(C)或裸露的形式(D)?！皩?duì)照組”是指正常的未進(jìn)行免疫處理的小鼠中的細(xì)胞因子水平。末次注射后三周，處死小鼠，其脾臟用于細(xì)胞因子分析。應(yīng)用Nakane等人的方法如已被由deSouza等人的修改測(cè)定了脾臟中內(nèi)源性IFN-γ和IL-4的水平。將小鼠脾臟分別稱重，于含有1％的3-[(膽堿酰丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸酯(CHAPS,Sigma)的冰浴的RPMI中在Dounce組織勻漿器中進(jìn)行勻漿處理，制得10％(wt/vol)的勻漿液。把勻漿液置于冰上放置1小時(shí)，然后以2000xg離心20分鐘除去不溶的碎屑。澄清的上清液于-70℃保存。細(xì)胞因子分析聯(lián)合使用了標(biāo)準(zhǔn)捕獲式ELISA與單克隆抗體對(duì)及Maxisorp板(NUNC，英國(guó))。應(yīng)用了抗IFN-γ(R46A2)和IL-4(11B11)的初級(jí)單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗-鼠IL-4(BVD6-24G2)和抗-鼠IFN-γ(XMG1.2)的次級(jí)單克隆抗體，還使用了鏈親和素過氧化酶(Dako，丹麥)和鄰苯二胺(Sigma)作為底物。重組的IFN-γ和IL-4標(biāo)準(zhǔn)品來自Pharmigen。結(jié)果(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，)以每個(gè)脾臟對(duì)應(yīng)多少納克細(xì)胞因子來表示(ng/脾臟)，這些結(jié)果至少來自4只小鼠。圖2顯示了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在圖中，每條均代表了4只小鼠每組的均值±SE(a-d代表了上述四種脂質(zhì)體)。
圖2的數(shù)據(jù)顯示脂質(zhì)體包封的DNA要比裸露或復(fù)合的DNA對(duì)Th1和Th2亞組的活性更強(qiáng)。體外進(jìn)行的抗HBsAg抗原的初級(jí)T細(xì)胞增殖分析也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。因此，用脂質(zhì)體包封的質(zhì)粒DNA進(jìn)行的免疫接種可以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫。實(shí)施例4——單次注射質(zhì)粒DNA后小鼠的免疫反應(yīng)大多數(shù)關(guān)于裸露DNA進(jìn)行接種的報(bào)道要求采用多次注射方案，但是單次注射也可產(chǎn)生對(duì)編碼的抗原的體液反應(yīng)(Davis等，人類基因治療，1993；Raz等，PNAS,1994)。例如，對(duì)裸露pRc/CMV HBS的總IgG反應(yīng)在注射1－2周后可以檢測(cè)到，4－8周時(shí)則可到達(dá)峰值(Davis等人，1996)。
以肌肉注射的方式分別對(duì)分為四組的Balb/c小鼠給予了一次2μg(圖3中白色條)或10μg(黑色條)pRc/CMV HBS,pRc/CMV HBS分別以下述形式包封在由PC、DOPE和DOTAP組成的正電性脂質(zhì)體中(A)、包封在由PC和DOPE組成的非電性脂質(zhì)體中(B)、與預(yù)制陽離子DOTAP脂質(zhì)體所組成的復(fù)合物(C)或裸露的形式(D)。注射后，對(duì)按照時(shí)間間隔獲得的血清中抗-HBsAg的IgG1反應(yīng)進(jìn)行了分析(ELISA)。以注射脂質(zhì)體包封DNA的全部小鼠來計(jì)量免疫反應(yīng)，但是免疫反應(yīng)僅在第20～27天可以檢測(cè)到。其它實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和實(shí)施例2相同。用陽離子脂質(zhì)體DNA免疫的小鼠和用裸露DNA免疫的小鼠的常用對(duì)數(shù)值(log10)(上述兩種劑量；所有的時(shí)間間隔)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.0001－0.002)。對(duì)于用10μg陰離子脂質(zhì)體包封的(由PC、DOPE和PS組成，制備方法見實(shí)施例1)pRc/CMV HBS進(jìn)行免疫處理的第五組4只小鼠，第21和29天的IgG1反應(yīng)(log10)分別是2.25±0.0和2.73±0.0。
在應(yīng)用更低劑量的pRc/CMV HBS(2和10μg)進(jìn)行的單次免疫條件下，甚至在第7周仍然不能檢測(cè)到對(duì)裸露和復(fù)合DNA所產(chǎn)生的抗-HBsAg IgG1反應(yīng)。相反，包封在陽離子脂質(zhì)體中的DNA，則可以較早地檢測(cè)到顯著的IgG1反應(yīng)，而中性或陰離子脂質(zhì)體包封的DNA仍然可產(chǎn)生顯著的反應(yīng)，但要遲一些(圖3)。實(shí)施例5——用脂質(zhì)體包封的乙型肝炎抗原注射近親交配和遠(yuǎn)系繁殖小鼠所產(chǎn)生的體液和細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)分組的小鼠(每組4－5個(gè))在第0和7天兩次注射(im、ip、iv或sc)10μg包封在陽離子DRV脂質(zhì)體中pRc/CMV HBS(ayw亞型；編碼HBsAg的S區(qū))或10μg裸露的pRc/CMV HBS(均保存在PBS中)，這種脂質(zhì)體是由卵磷脂(PC)、二油?；柞ヵＤ憠A(DOPE)和1,2，一二油酰基(三甲基銨)丙烷(DOTAP)組成(摩爾比為1∶5.5∶0.25)(采用實(shí)施例1中所描述的常規(guī)材料和技術(shù)制備而成)。按照時(shí)間間隔對(duì)動(dòng)物進(jìn)行取血，并應(yīng)用ELISA測(cè)定血漿中的IgG1、IgG2a和IgG2b。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(首次注射后的第38天)將動(dòng)物殺死，采用上述方法(參考其它實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)請(qǐng)看Gregoriadis等，1997)對(duì)脾臟中的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4進(jìn)行測(cè)定。對(duì)對(duì)照(完整)小鼠也進(jìn)行脾臟中細(xì)胞因子的測(cè)定。結(jié)果實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，對(duì)這兩種株系的小鼠，僅在首次注射的第21天后(IgG1；圖4)或28天后(IgG2a和IgG2b；分別對(duì)應(yīng)圖5和6)才可檢測(cè)到免疫反應(yīng)(均值±SD)。對(duì)脂質(zhì)體DNA的反應(yīng)(黑色條)通常要比對(duì)裸露DNA產(chǎn)生的反應(yīng)(斑點(diǎn)條)更加顯著(兩種株系；所有的注射途徑，尤其是im、sc和iv)。反應(yīng)顯著性水平(P＜0.05)以下列順序遞增+、*、**、***。
對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ(圖7)(Th1反應(yīng))和IL-4(Th2反應(yīng))(圖8)的分析可以看到對(duì)脂質(zhì)體DNA，通過肌肉和皮下途徑注射的這兩種株系的小鼠比通過靜脈途徑注射的T/o型小鼠所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)明顯要高。通過腹膜內(nèi)途徑注射時(shí)，脂質(zhì)體包封的DNA和裸露的DNA所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)沒有差異。實(shí)施例6——六種不同的質(zhì)粒DNA的包封率使用實(shí)施例1的方法可使35S標(biāo)記的質(zhì)粒DNA(10－500μg)摻入到中性、陰離子或陽離子、脫水再水化囊泡(DRV)中或與之混合。所用的質(zhì)粒DNA如下所列pGL2——如實(shí)施例1所述，可編碼熒光素酶；pRc/CMV HBS——如實(shí)施例2所述，乙型肝炎表面抗原的S區(qū)；pRSVGH——編碼人生長(zhǎng)激素，一種治療性蛋白；pCMV4.56——生物麻風(fēng)蛋白，一種抗原；pCMV4.EGFP——熒光綠蛋白；VR1020——血吸蟲蛋白，一種抗原。
所用的脂類包括中性的脂類PC和DOPE(如實(shí)施例1所述)，陰離子脂類、PS、磷脂酰絲氨酸(如實(shí)施例1所述)或磷脂酰膽堿(PG)和陽離子化合物硬脂酰胺(SA)、BisHOP和DOTMA(如實(shí)施例1所述)及DC-Chol和DOTAP(如實(shí)施例2中所用)，另外還包括1、2-二油?；?3-二甲基銨基丙烷(DODAP)。
下表指出了質(zhì)粒DNA是否被摻入[即包封到(a)DRV中或與DRV混合(b)]。該表進(jìn)一步指出了脂類成分和DNA的摻入率。以前的實(shí)驗(yàn)已指出對(duì)多種形式的DRV制劑對(duì)使用不同數(shù)量的DNA的摻入率沒有顯著影響。因此，結(jié)果如下所示，且表中的整合率是3－5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值。
表6脂質(zhì)體中質(zhì)粒DNA的摻入摻入的質(zhì)粒DNA(占使用DNA的百分?jǐn)?shù))脂質(zhì)體pGL2 pRc/CMVpRSVGH pCMV4.65 pCMV4.VR1020HBS
上述結(jié)果顯示通過包封DNA，對(duì)于帶負(fù)電荷的脂類所獲得的摻入率特別高。而使用帶正電荷的脂類，包封和物理混合之間的摻入率看起來沒有什么顯著差異，雖然對(duì)于陽離子成分是非脂類化合物(硬脂酰胺)的包封所獲得的摻入率更高些。實(shí)施例7——陽離子脂質(zhì)體的有效脂類成分對(duì)應(yīng)答由包封pRc/CMVHBS編碼的HBsAg抗原的免疫反應(yīng)的作用使用上述常規(guī)的技術(shù)可把質(zhì)粒DNA包封到各種陽離子脂質(zhì)體中。使用的脂類及摩爾比如表7所示。這些脂類如在先前的實(shí)施例中使用，且附加的PE是磷脂酰乙醇胺帶有卵脂和DSPC，二硬脂酰磷脂酰膽堿(一種飽和脂類)。對(duì)5組的Balb/c小鼠通過肌肉注射給予10μg游離或脂質(zhì)體包封的質(zhì)粒DNA，注射在第0、2和5周進(jìn)行。在第8、10和13周對(duì)小鼠進(jìn)行取血，并用ELISA方法分析血清中抗-HBsAg(S區(qū))IgG1抗體。使用方法如實(shí)施例5所述。結(jié)果如表7所示。
表7
結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析(非成對(duì)T-檢驗(yàn))表明(a)在所有的脂質(zhì)體DNA制劑和游離的DNA之間(P＜0.0001－0.0441，所有的時(shí)間間隔)，PC∶DOPE∶DOTAP和PC∶DOTAP之間(P＜0.0036－0.0357，所有的時(shí)間間隔)，PC∶PE∶DOTAP和PC∶DOTAP之間(P＜0.0095－0.0385，第10和13周)，PC∶DOPE∶DOTAP和DSPC∶DOPE∶DOTAP之間(P＜0.0001－0.0138，第8和13周)，PC∶DOPE∶DOTAP和PC∶CHOL∶DOTAP之間(P＜0.0158，第13周)均存在著顯著性差異。
結(jié)果表明就脂質(zhì)體促進(jìn)免疫反應(yīng)效率而言，(a)PE可取代DOPE而不造成脂質(zhì)體效率的損失(DOPE和PE均為不飽和脂類)；(b)與不含有磷脂酰乙醇胺的脂類相比，磷脂酰乙醇胺(PE和DOPE)更有效；(c)飽和的DSPC取代PC可降低脂質(zhì)體效率；(d)含有磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)體與含有膽固醇而不含磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)體的效率幾乎一樣，但這僅僅發(fā)生在第8和10周。實(shí)施例8——pRc/CMV HBS在非磷酸脂類脂質(zhì)體中的包封率在本實(shí)施例中，多種除了磷脂之外的脂質(zhì)體形成成分用于包封前述實(shí)施例中乙型肝炎抗原。該脂質(zhì)體的形成成分包括甘油酯、Monopal、1-單棕櫚酰外消旋-甘油、非離子化的表面活性劑，Span 60(山梨聚糖單硬脂酸酯)和Solulan 24(由羊毛脂醇和相關(guān)脂肪酸組成的一種24摩爾乙氧基化的復(fù)和物)(Span 60和Solulan 24均是商標(biāo))。脂質(zhì)體形成成分的摩爾比如下表所示。其它一些成分可見上述實(shí)施例。
結(jié)果表明使用不含有磷脂的脂質(zhì)體形成成分可以獲得足夠的包封率。非離子化的表面活性劑任選性地與非其它磷脂類成分(如膽固醇)組合使用可以獲得足夠的包封率。由于實(shí)施例8.4、8.5、8.6和8.8中制得的脂質(zhì)體可持續(xù)沉淀，因此它們不是好的組合物。
包封率如下述表8所示。表8<
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權(quán)利要求
1．一種含有脂質(zhì)體和包封在脂質(zhì)體中的多核苷酸的組合物，其中脂質(zhì)體由脂質(zhì)體形成成分制成，多核苷酸是有效編碼一種能誘導(dǎo)受試人或動(dòng)物發(fā)生期望免疫反應(yīng)的免疫原性多肽。
2．一種權(quán)利要求1的組合物，其中的多核苷酸是雙鏈DNA。
3．一種權(quán)利要求2的組合物，其中的多核苷酸以質(zhì)粒的形式存在，質(zhì)粒中含有啟動(dòng)子且任選地含有核糖體結(jié)合序列。
4．一種權(quán)利要求1的組合物，其中的多核苷酸是RNA，優(yōu)選為mRNA。
5．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其中的免疫原性多肽含有一種抗原或一種感染性微生物抗原的片段。
6．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其中的脂質(zhì)體形成成分經(jīng)選擇以使脂質(zhì)體總體上不帶電荷。
7．一種權(quán)利要求1～5的組合物，其中的脂質(zhì)體形成成分包括至少一種帶正電荷的脂質(zhì)體形成成分，所用的量應(yīng)可使脂質(zhì)體形成成分總體上帶正電荷。
8．一種組合物，它含有由脂質(zhì)體形成成分制成的脂質(zhì)體和可編碼一種期望多肽產(chǎn)物的多核苷酸，其中脂質(zhì)體形成成分包含至少一種一定數(shù)量的帶正電荷的成分，籍此脂質(zhì)體形成成分總體上帶正電荷，該組合物的特征在于多核苷酸包封于脂質(zhì)體中。
9．一種權(quán)利要求7或8的組合物，其中的陽離子成分是一種甘油酯，其通用分子式如下
或者是其光學(xué)異構(gòu)體，其中Y1和Y2可相同或不同，且它們是-O-或O-C(O)-，其中羰基碳依情況與R1或R2相連；R1和R2獨(dú)立地是一種含6－24個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基，R3、R4和R5獨(dú)立地是氫原子、含1－8個(gè)碳原子的烷基、6－11個(gè)碳原子的芳基或芳烷基；或者，R3、R4和R5中的兩個(gè)或三個(gè)與帶正電荷的氮原子接合而形成一個(gè)含有5－8個(gè)原子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)中除了帶正電荷的氮原子外，結(jié)構(gòu)中的原子是碳原子，且可以包括氧、氮或硫原子；n為1－8；且X是一種陰離子。
10．一種權(quán)利要求9的組合物，其中R1和R2各自有0－6個(gè)不飽和位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)如下CH3－(CH2)a－(CH=CH－CH2)b－(CH2)c－其中，a和c的總和從1－23；且b為0－6。
11．一種權(quán)利要求7或8的組合物，其中的陽離子成分選自DOTAP、BisHOP、DC-Chol和硬脂酰胺。
12．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其中脂質(zhì)體形成成分包括一種聚合性成分，優(yōu)選是磷脂酰乙醇胺。
13．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其中通過脫水-再水化方法來制備脂質(zhì)體，優(yōu)選地后面進(jìn)行一步微流態(tài)化處理或“擠出”處理步驟。
14．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其中脂質(zhì)體的平均直徑范圍為100～1000nm，優(yōu)選為200－500nm。
15．一種上述任何一個(gè)權(quán)利要求的組合物，其包括每毫克脂質(zhì)體形成成分中含0.1－10μg的多核苷酸。
16．上述任何一個(gè)權(quán)利要求中定義的脂質(zhì)體在制造組合物中的用途，該組合物用于一種通過治療或預(yù)防而用于人類或動(dòng)物的治療方法。
17．權(quán)利要求16的用途，其中該方法是通過接種而產(chǎn)生針對(duì)感染性微生物或腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
18．權(quán)利要求16或17的用途，其中組合物通過肌肉內(nèi)注射方式施用。
19．一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1－15中的脂質(zhì)體制劑和藥學(xué)可接受的賦形劑。
20．一種治療需要此種治療的受試人或動(dòng)物的方法，其中權(quán)利要求19的藥物組合物施用于受試的人或動(dòng)物，籍此多核苷酸的多肽產(chǎn)物在靶細(xì)胞中表達(dá)。
21．一種權(quán)利要求20的方法，其中藥物組合物以肌肉內(nèi)注射方式施用。
22．一種權(quán)利要求20的方法，其中藥物組合物以皮下注射方式施用。
23．一種權(quán)利要求20的方法，其中藥物組合物以靜脈內(nèi)注射方式施用。
24．一種權(quán)利要求20的方法，其中藥物組合物以腹膜內(nèi)注射方式施用。
25．一種從受試人或動(dòng)物所獲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，其中把這些細(xì)胞與一種權(quán)利要求1－15中任一脂質(zhì)體組合物相接觸，并且培養(yǎng)細(xì)胞，由此發(fā)生了細(xì)胞轉(zhuǎn)染、多核苷酸的表達(dá)和多核苷酸的多肽產(chǎn)物的合成。
26．一種權(quán)利要求25的方法，其中培養(yǎng)的細(xì)胞隨之被移植到宿主動(dòng)物或人，由此在體內(nèi)發(fā)生了多肽的表達(dá)。
27．一種權(quán)利要求20－24中任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)的多核苷酸誘導(dǎo)一種期望的免疫反應(yīng)，優(yōu)選為對(duì)一種感染性微生物或一種腫瘤細(xì)胞抗原的反應(yīng)。
28．一種把多核苷酸包封到脂質(zhì)體中的方法，包括下述步驟1)．制備一種含有裸露多核苷酸和預(yù)制脂質(zhì)體的水性懸浮液，該多核苷酸有效地編碼一種能誘發(fā)受試人或動(dòng)物產(chǎn)生期望免疫反應(yīng)的免疫原性多肽，2)．冷凍干燥該懸浮液，3)．把步驟2的產(chǎn)物進(jìn)行再水化處理，4)．把步驟3的脫水再水化囊泡的水性懸浮液進(jìn)行微流態(tài)化處理；且5)．任選地從脂質(zhì)體中分離未經(jīng)包封的多核苷酸。
29．一種權(quán)利要求28的方法，其中脂質(zhì)體為陽離子脂質(zhì)體。
30．一種把多核苷酸包封到脂質(zhì)體中的方法，包括下述步驟1)．制備一種含有裸露多核苷酸和預(yù)制陽離子脂質(zhì)體的水性懸浮液，2)．冷凍干燥該懸浮液，3)．把步驟2的產(chǎn)物進(jìn)行再水化處理，4)．把步驟3的脫水再水化囊泡的水性懸浮液進(jìn)行微流態(tài)化處理；且5)．任選地從脂質(zhì)體中分離未被包封的多核苷酸。
31．一種權(quán)利要求28－30中任一項(xiàng)的方法，其中步驟1－4中多核苷酸的包封率范圍為10－90％，優(yōu)選地步驟1中懸浮液中的多核苷酸的包封率范圍為20－85％。
32．一種權(quán)利要求28－31中任一項(xiàng)的方法，其中終產(chǎn)物中多核苷酸水平范圍為每毫克脂質(zhì)體形成成分中有0.1－20μg多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明描述了帶有包封到其囊泡中的多核苷酸的陽離子脂質(zhì)體。該類脂質(zhì)體含有陽離子的成分,如陽離子脂類(如DOTAP)。優(yōu)選的形成脂質(zhì)體的方法為在多核苷酸存在的情況下應(yīng)用脫水－再水化的方法。優(yōu)選地該類多核苷酸可有效地編碼一種能誘發(fā)一種期望的免疫反應(yīng)的抗原,也就是說該類多核苷酸是一種基因疫苗。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1237102SQ9719967
公開日1999年12月1日 申請(qǐng)日期1997年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月13日
發(fā)明者G·格里克里阿德 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)藥學(xué)院