專利名稱：用京尼平對生物醫(yī)學(xué)材料進(jìn)行化學(xué)改性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用天然交聯(lián)試劑--京尼平(genipin)對生物醫(yī)學(xué)材料進(jìn)行化學(xué)改性，例如膠原、脫乙酰殼多糖和血紅蛋白，本發(fā)明還涉及與京尼平交聯(lián)或聚合的生物適合性材料，該材料可用于生物植入物、粘合劑、傷口敷料和血液替代品。
參考文獻(xiàn)Buchi,G.等人，J.Am.Chem.Soc.89:2776-7(1967).
Chanda,J.等人，Artif.Organs 18(10):752-7(1994).
Chandy,T.等人，Proc.South.Biomed.Eng.Conf.,14th(1995),pub.byIEEE,New York,NY.
Chandy,T.等人，Biomater.,Artif. Cells,Artif. Organs 18(1):1-24(1990).
Chang,T.M.S.等人，Biomater.Artif. Cells Immobilization Biotech.20:159-179(1992).
Fujikawa,S.等人，Biotechnol.Lett.9:697-702(1987).
Hilben,S.L.等人，Med.Prog.Technol.14(3-4):115-63(1988).
Keipert.P.E.等人，Transfusion 29:768-773(1989).
Khor,E.,Biomaterials 18(2):95-105(1997).
Kometani,T.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.57:1185-7(1993).
Li,S.T.,in Biotechnol.Polym.,Gebelein,C.G.ed..,Technomic,Lancaster,PA,1993,pp.66-81.
Oka,H.等人，ACS Symp.Series 593(Modem CountercurrentChromatography),92-106(1995).
Okada,S.等人，JP Kokai No.5-276971(1993).
Oliver,R.F.,in Biocompat.Tissue Analogs,Vol.I,Williams,D.F.,ed..,CRC Press,Boca Raton,FL,1985,pp117-34.
Olsen,R.等人，Proc.Int.Conf.Chitin Chitosan,4th(1988),Skjaak-Braek,G.et al.,eds.,Elsevier,London(1989).
Sabelman,E.E.,in Biocompat.Tissue Analogs,Vol.I,Willams,D.F.,ed..,CRC Press,Boca Raton,FL,1985,pp.27-66.
Stenzel.K.H.等人，Polym.Sci.Techn.8:109-18(1975).
Tanaka,M.等人，JP Kokai No.2-300183(1990).
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，為達(dá)到最佳的效果通常希望進(jìn)行生物分子的交聯(lián)。例如，膠原構(gòu)成生物組織的結(jié)構(gòu)框架，其已被廣泛用于制造生物替代品和其他植入結(jié)構(gòu)，如血管移植物，膠原在此是細(xì)胞過濾和增殖的最佳介質(zhì)。膠原片還被用作傷口敷料，其優(yōu)點(diǎn)是對水蒸氣有高度的透過性，并快速愈合傷口。未交聯(lián)膠原的缺點(diǎn)包括抗拉強(qiáng)度低，而且易于被膠原酶降解。膠原性組織的固定或交聯(lián)可增加機(jī)械強(qiáng)度，降低被膠原酶降解，并降低抗原性和免疫原性。
脫乙酰殼多糖是殼多糖的脫乙?；苌铮浒坞x氨基，該氨基也可被例如戊二醛交聯(lián)(Jameela)，并已被用于或者被提議用于植入的藥物遞送裝置、皮膚替代品、傷口敷料、和其他生物材料。當(dāng)將脫乙酰殼多糖涂敷在其他植入材料上時(shí)，其顯示出降低鈣化的有益性質(zhì)(Chanda)。
已使用各種交聯(lián)劑對含胺的生物醫(yī)學(xué)材料進(jìn)行化學(xué)改性。最常見的是合成化學(xué)品，如甲醛、戊二醛、二醛淀粉、乙醇醛、氨基氰、二酰亞胺、和二異氰酸酯。其中，戊二醛快速與蛋白質(zhì)反應(yīng)，是最常使用者。
交聯(lián)膠原所遇到的問題是在植入時(shí)會鈣化，這導(dǎo)致植入物周圍僵硬，最終降解，并重新吸收入周圍組織中，以及與交聯(lián)劑的毒性反應(yīng)。已知戊二醛具有過敏原性，其導(dǎo)致職業(yè)性皮炎，而且在高于10-25ppm、在組織培養(yǎng)物中低至3ppm時(shí)，具有細(xì)胞毒性。
交聯(lián)生物材料的另一個(gè)應(yīng)用是作為血液替代品。無細(xì)胞的血紅蛋白--血液替代品可用于無抗原血液輸注，但在循環(huán)期間易于從四聚體轉(zhuǎn)化為二聚體。高氧親和性和短的半衰期是這種材料的另外限制。這些問題可通過用交聯(lián)劑化學(xué)改性血紅蛋白來克服(參見例如Chang,Keipert)。增加血紅蛋白在循環(huán)中的半衰期并降低其氧親和性可通過分子間和分子內(nèi)交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。但是，已發(fā)現(xiàn)用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)可導(dǎo)致在血紅蛋白聚合期間形成二聚體。
因此，希望提供一種適合于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑具有低毒性，形成穩(wěn)定的、生物適合性的交聯(lián)產(chǎn)品，并在植入時(shí)保持其穩(wěn)定性。
發(fā)明概述在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供生物適合性的植入物或者傷口敷料。該植入物或敷料是一種包括生物適合性的、經(jīng)交聯(lián)的、含胺的生物分子的材料，所述生物分子選自于脫乙酰殼多糖或結(jié)締組織，其中，該生物分子與京尼平交聯(lián)。如果生物分子是結(jié)締組織蛋白，則該蛋白優(yōu)選是膠原。本發(fā)明還提供生物適合性的粘合劑，其包括生物適合性的、經(jīng)交聯(lián)的明膠，該明膠得自于膠原性物質(zhì)，其中，所述明膠與京尼平交聯(lián)。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供制造生物適合性的植入物或傷口敷料的方法。該方法包括以下步驟將包括含胺之生物分子的材料制成適合于植入物或敷料的結(jié)構(gòu)，所述生物分子選自于脫乙酰殼多糖或結(jié)締組織蛋白，然后用京尼平交聯(lián)上述材料。如果所述材料包括結(jié)締組織蛋白，則該蛋白優(yōu)選是膠原。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供適合用于血液替代品的組合物，該組合物包括與京尼平交聯(lián)的血紅蛋白，還提供制備所述組合物的方法，其是用一定量的京尼平處理血紅蛋白，以有效地交聯(lián)血紅蛋白。優(yōu)選的是，經(jīng)交聯(lián)的血紅蛋白具有大于1至小于約9的平均聚合度。
附圖簡述

圖1A-H是對未交聯(lián)或新組織(1A-B)、以及與戊二醛(GA)(1C-D)、環(huán)氧化物(EX-810)(1E-F)、和京尼平(1G-H)交聯(lián)的組織分別在膠原酶降解之前和之后進(jìn)行顯微照相(×200)得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象；圖2和3顯示了圖1之測試樣品分別在膠原酶或鏈霉蛋白酶降解之前或之后的變性溫度；圖4顯示了新的、戊二醛固定的、環(huán)氧化物固定的、和京尼平固定的組織在膠原酶降解之前和之后的抗拉強(qiáng)度；圖5顯示了在發(fā)育鼠模型中新的、戊二醛固定的(GA)、環(huán)氧化物固定的(EX-810)、和京尼平固定的組織在皮下植入之前(t=0)和之后(t=1周；t=4周)的變性溫度；圖6顯示了圖5之樣品在植入之前和之后的抗拉強(qiáng)度；圖7顯示了圖5之樣品在植入之前和之后的鈣含量；圖8A-8D是對在(A)對照培養(yǎng)基和添加有(B)1ppm戊二醛、(C)5ppm環(huán)氧化物和(D)1000ppm京尼平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行顯微照相(×100)得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象；圖9A-9H是對植入前的(A)新組織、(B)戊二醛固定的組織、(C)環(huán)氧化物固定的組織、和(D)京尼平固定的組織，(E)植入后1周時(shí)回收的新組織，植入后12周時(shí)回收的(F)戊二醛固定的組織、(G)環(huán)氧化物固定的組織和(H)京尼平固定的組織進(jìn)行掃描電子顯微照相(×1500)得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象；
圖10A-C是對植入后12周時(shí)回收并用蘇木紫和曙紅染色的(A)戊二醛固定的組織、(B)環(huán)氧化物固定的組織、(C)京尼平固定的組織進(jìn)行顯微照相(×200)得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象；和圖11顯示了聚合和未聚合的血紅蛋白的HPLC色譜圖。
發(fā)明詳述Ⅰ、定義除非另有說明，以下術(shù)語具有以下意思。
“京尼平”是指如結(jié)構(gòu)式Ⅰ所示的天然化合物以及其立體異構(gòu)體和它們的混合物。
“膠原性材料”或“膠原性物質(zhì)”是指大部分由膠原構(gòu)成的材料，例如結(jié)締組織，其適合于制造生物替代品、植入物、移植物、或傷口敷料。
“生物植入物”是指插入在或者移植在身體組織上并保持一段時(shí)間的生物醫(yī)學(xué)裝置，如持續(xù)釋放藥物裝置、血管或皮膚移植物、或者替代品。
“交聯(lián)血紅蛋白”是指包含分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白而且交聯(lián)存在于四聚體分子的單個(gè)鏈之間的血紅蛋白，和/或四聚體分子連接在一起的分子間交聯(lián)血紅蛋白或多聚血紅蛋白。
“聚合度”是指在交聯(lián)血紅蛋白中連接在一起的血紅蛋白分子的數(shù)量。例如，Hb2是指通過分子間交聯(lián)連接在一起的兩個(gè)血紅蛋白單元；它們也可是分子內(nèi)交聯(lián)的。Ⅱ、京尼平的制備和性質(zhì)京尼平具有以下結(jié)構(gòu)Ⅰ，其是存在于果實(shí)(Gardenia jasmindides Ellis)中的環(huán)烯醚萜苷。其可從結(jié)構(gòu)Ⅱ的母化合物京尼平苷得到，后者可從例如在Oka、Okada、或Kometani描述的天然物質(zhì)中分離出來。京尼平是京尼平苷的糖苷配基，其可通過氧化、還原和水解(Tanaka)或者通過酶解(Fujikawa)由京尼平苷制備。另外，外消旋京尼平可合成制備，例如根據(jù)Buchi的方法。
雖然結(jié)構(gòu)Ⅰ顯示了京尼平的天然構(gòu)型，但是根據(jù)本發(fā)明，京尼平的任何立體異構(gòu)體或者京尼平之立體異構(gòu)體的混合物也可用作交聯(lián)劑。
京尼平具有低的急性毒性，在鼠中的LD50i.v.是382mg/k。因此，比戊二醛和許多其他常用合成交聯(lián)劑的毒性低得多。
如以下所述，京尼平對于體內(nèi)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的生物材料處理是一種有效的交聯(lián)劑，如替代品和其他植入物、傷口敷料、和血液替代品。Ⅲ、用京尼平交聯(lián)生物結(jié)構(gòu)化合物交聯(lián)的生物化合物優(yōu)選包括結(jié)締組織蛋白如膠原和彈性蛋白，或者從這些蛋白得到的材料，如明膠，其是通過水解膠原或膠原性組織得到的。其他含胺的結(jié)構(gòu)化合物如脫乙酰殼多糖也可用京尼平處理，來制備生物適合性的交聯(lián)材料。
用或不用交聯(lián)將此等材料、特別是膠原制成醫(yī)療裝置如生物替代品、皮膚和血管移植物、以及傷口敷料的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。例如參見“Prosthetic and Biomedical Devices”,Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Science&Technology,John Wiley&Sons,1995中的討論，其他參考文獻(xiàn)見Hilbert、Khor、Li、Oliver、Sabelman、和Stenzel。脫乙酰殼多糖在此等應(yīng)用中的參考文獻(xiàn)例如參見Chandy(1990,1995)、Jameela、和Olsen。
提供阻斷血流和支持血液凝固的生物適合性的表面，京尼平交聯(lián)的膠原性組織由此也可用于體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。通過用一定量的京尼平交聯(lián)由水解膠原或者水解處理含膠原組織而得到的明膠，可制備生物適合性的粘合劑，所述量應(yīng)有效地產(chǎn)生所希望的粘性。
交聯(lián)膠原性組織時(shí)，如實(shí)施例1所述，對于6×6cm的組織片，京尼平的有效量約為200ml的5％溶液。所用交聯(lián)劑的量取決于所希望的交聯(lián)密度。類似地，交聯(lián)明膠或脫乙酰殼多糖時(shí)，可用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來測定對于最終產(chǎn)品之希望性質(zhì)來說是合適的試劑量。
如以下所述，京尼平固定的膠原性組織對于膠原酶或鏈霉蛋白酶具有高度的耐受性，而且在皮下植入物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了它們的生物適合性。以下部分描述了與京尼平交聯(lián)的膠原組織樣品的性質(zhì)，包括酶耐受性、機(jī)械性質(zhì)的保持、以及低毒性，并與用其他常規(guī)試劑交聯(lián)的樣品進(jìn)行比較。
A、對降解酶的穩(wěn)定性為確定用各種交聯(lián)劑處理的膠原性纖維的穩(wěn)定性，如以下實(shí)施例1所述，用所述試劑處理組織樣品，經(jīng)受膠原酶或鏈霉蛋白酶的降解作用，然后檢查。
圖1A-H是對未交聯(lián)或新組織(1A-B)、以及戊二醛固定的(1C-D)、環(huán)氧化物固定的(1E-F)、和京尼平固定的(1G-H)的組織分別在膠原酶降解之前和之后進(jìn)行顯微照相得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象。降解后，新組織崩解成碎片(圖1B)。相反的是，戊二醛固定的和京尼平固定的組織的膠原纖維結(jié)構(gòu)在膠原酶降解后仍保持不變(圖1D和1H)，而環(huán)氧化物固定的組織的膠原纖維僅觀察到輕微的崩解(圖1F)。
用Perkin Elmer差示掃描熱量計(jì)(Model DSC7,Norwalk,Connecticut,USA)測量各測試樣品的變性溫度。圖2和3給出了上述測試樣品分別在膠原酶和鏈霉蛋白酶降解之前和之后的變性溫度。由于新(未交聯(lián))組織樣品已完全崩解，沒有測定其在膠原酶或鏈霉蛋白酶降解之后的變性溫度。如圖中所示，京尼平固定的組織的變性溫度下降(＜2％)低于戊二醛固定的和環(huán)氧化物固定的組織的下降(3-10％)。
京尼平固定的組織還表現(xiàn)出優(yōu)異的抗拉強(qiáng)度保持。在體外降解作用之前和之后從各測試樣品中切取組織條用于抗拉強(qiáng)度測定。使用InstronUniversal Testing Machine(Model 4302)在50mm/min的恒定速度下通過單軸測量來確定組織條的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。圖4顯示了新的、戊二醛固定的、環(huán)氧化物固定的、或者京尼平固定的組織在膠原酶降解之前和之后的拉伸應(yīng)力測量結(jié)果。降解后，新組織的拉伸應(yīng)力記錄為零，這也是因?yàn)樵摌悠吠耆澜?。如圖所示，京尼平固定的組織的拉伸應(yīng)力下降最小(＜1％)，明顯低于戊二醛固定的和環(huán)氧化物固定的組織的下降(分別為31％和25％)。
上述結(jié)果表明，京尼平固定的膠原性組織具有與戊二醛固定的組織類似的熱穩(wěn)定性和抗拉強(qiáng)度，而且它們在用膠原降解酶處理時(shí)仍保持抗拉強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，明顯大于戊二醛和環(huán)氧化物固定的組織。
B、皮下植入時(shí)的穩(wěn)定性1、短期研究(4周)使用發(fā)育鼠模型進(jìn)行皮下植入研究，以評估在用京尼平交聯(lián)的植入的心包組織中的穩(wěn)定性(變性溫度和抗拉強(qiáng)度的變化)和鈣沉積濃度。還測試了新(未交聯(lián))的、戊二醛固定的、和環(huán)氧化物固定的組織。
如實(shí)施例2所述制備組織樣品。在6周齡的雄性Wistar鼠中進(jìn)行皮下植入研究，植入物在植入后1周和4周時(shí)回收。
植入后1周時(shí)，新樣品通常薄于經(jīng)交聯(lián)的樣品，并在4周時(shí)完全被降解。在第4周時(shí)，在京尼平固定的樣品中觀察到宿主組織薄層，但在戊二醛或環(huán)氧化物固定的樣品中沒有觀察到。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，京尼平固定的樣品是最具有生物適合性的。
如以上所述，測定樣品在植入之前和之后的變性溫度和抗拉強(qiáng)度。如圖5所示，京尼平固定的樣品和戊二醛固定的樣品的變性溫度是相似的，而且明顯高于環(huán)氧化物固定的樣品的變性溫度。這說明在京尼平固定的和戊二醛固定的組織中有更高的交聯(lián)密度。在所有情況下，在植入后的四周時(shí)幾乎都沒有觀察到變性溫度下降。
如圖6所示，京尼平固定的樣品的抗拉強(qiáng)度在所有階段都優(yōu)于環(huán)氧化物固定的樣品。植入前和植入后1周時(shí)，京尼平固定的樣品和戊二醛固定的樣品的抗拉強(qiáng)度是相似的。但是在植入后4周時(shí)，京尼平固定的樣品的抗拉強(qiáng)度大大高于戊二醛固定的樣品。
圖7顯示了在植入期間沉積的鈣量，其是通過實(shí)施例3中所述的原子吸收光譜法測定的。如該圖所示，對于京尼平和環(huán)氧化物固定的樣品，鈣沉積是非常類似的，而且在1周時(shí)，低于未交聯(lián)的樣品。在1周時(shí)，戊二醛固定的樣品中的鈣沉積量大大高于另外兩個(gè)固定樣品，但在第4周時(shí)類似。
以上結(jié)果表明，與京尼平交聯(lián)的膠原性組織具有與戊二醛交聯(lián)的組織類似或更優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物適合性，而無戊二醛和相關(guān)化合物的毒性。
2、長期研究(12周)如上述短期研究所述，將新(未交聯(lián))的、戊二醛固定的、環(huán)氧化物固定的、和京尼平固定的豬心包無菌樣品皮下植入在麻醉情況下的發(fā)育鼠模型(6周齡雄性Wistar)中。每個(gè)研究組中取一個(gè)樣品，將四個(gè)樣品植入在動物模型的上背部；再從每個(gè)研究組中取一個(gè)樣品，將這四個(gè)樣品按相反順序植入在下背部。各測試樣品約為0.5cm寬、2cm高。各排中的測試樣品次序按動物輪換。植入的樣品在手術(shù)后的第1周(n=4)、4周(n=4)和12周(n=8)時(shí)回收。
在回收時(shí)，對各回收的樣品進(jìn)行檢測和照相。注意到，經(jīng)回收的新組織明顯薄于戊二醛、環(huán)氧化物和京尼平固定的對應(yīng)樣品。在手術(shù)后的第4周時(shí)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)植入的新組織樣品中有6個(gè)完全降解，而其他兩個(gè)新樣品被宿主組織吸收。相反的是，戊二醛、環(huán)氧化物和京尼平固定的組織在整個(gè)研究期間都保持完整。
用掃描電子顯微鏡(SEM)檢查各回收樣品的表面形態(tài)。用于SEM檢查的樣品首先用2％戊二醛之0.1M二甲胂酸鈉溶液(pH7.4)固定，然后用1％四氧化鋨進(jìn)行后固定。接著，樣品在一系列濃度的乙醇溶液中脫水，用二氧化碳進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，最后用金膜濺射。用Hitachi ModelS-800掃描電子顯微鏡進(jìn)行檢查。
圖9A和9E顯示了對植入前和手術(shù)后1周時(shí)回收的新組織進(jìn)行SEM顯微照相得到的計(jì)算機(jī)生成圖象。如圖9E所示，在手術(shù)后1周時(shí)回收的新組織已完全崩解。與植入前的對應(yīng)物(分別為圖9B和9D)相比，在手術(shù)后12周時(shí)回收的戊二醛和京尼平固定的組織略有降解。環(huán)氧化物固定的組織(圖9G對9C)的降解程度高于戊二醛和京尼平固定的對應(yīng)物。
用于光學(xué)顯微鏡的樣品在10％磷酸鹽緩沖的甲醛中固定至少3天，然后用于病理組織學(xué)檢查。在病理組織學(xué)檢查中，經(jīng)固定的樣品嵌入在石蠟中，切片厚度為5μm，然后用蘇木紫和曙紅(H&E)染色。各測試樣品的染色切面用光學(xué)顯微鏡(Nikon Microphoto-FXA)檢查組織炎性反應(yīng)，并用100 ASA Kodachrome膠片照相。
對在手術(shù)后12周時(shí)回收的經(jīng)戊二醛、環(huán)氧化物、和京尼平固定的組織進(jìn)行顯微照相，并由此得到計(jì)算機(jī)生成的圖象，見圖10(A-C)所示。應(yīng)注意到，由于完全降解，沒有對此時(shí)回收的新組織進(jìn)行顯微照相。京尼平固定的組織的炎性反應(yīng)明顯低于戊二醛和環(huán)氧化物固定的對應(yīng)物，這表明京尼平固定的組織的優(yōu)異生物適合性，因?yàn)槠涿黠@更低的毒性(見以下部分C)。
如實(shí)施例3所述，用原子吸收分析法測定各回收樣品的鈣含量。新組織、戊二醛固定的、環(huán)氧化物固定的、和京尼平固定的組織在植入前以及在手術(shù)后第1、4、和12周回收時(shí)的鈣含量數(shù)據(jù)見表1，其以μg鈣每mg干組織重量表示。應(yīng)注意的是，在手術(shù)后第4和12周時(shí)回收的新(未交聯(lián))組織沒有得到數(shù)據(jù)，這是因?yàn)樗鼈兺耆到?。如該表所示，在該研究中，在植入前的樣品與各種植入時(shí)間時(shí)回收的樣品之間沒有觀察到鈣含量的顯著差異。
表1植入前和不同植入時(shí)間時(shí)的鈣含量(μg鈣/mg干組織重量)
數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示*N/A由于組織完全降解沒有得到數(shù)據(jù)C、細(xì)胞毒性研究用于該研究中的細(xì)胞是從正常新生兒的包皮得到的人包皮成纖維細(xì)胞。將細(xì)胞在3.5cm直徑的petri培養(yǎng)皿(105細(xì)胞每個(gè)皿)中于添加有10％胎牛血清(Hyclone Laboratories,Logan,UT,USA)的Dulbecco改進(jìn)eagle培養(yǎng)基(DMEM,Gibco430-2800 EG,GrandIsland,NY,USA)中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物保持在經(jīng)加濕的培養(yǎng)箱中24小時(shí)，該培養(yǎng)箱的溫度為37℃，并有在空氣中的10％CO2。
用在DMEM中的京尼平(Challenge Bioproducts Co.,Taichung,Taiwan)替代培養(yǎng)基，其濃度為0(空白)、10、100、或1000ppm(μg/ml)。還測試戊二醛和環(huán)氧化物(乙二醇二縮水甘油醚，DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)，濃度為1、5、或10ppm。
培養(yǎng)24小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞兩次，用沒有任何測試交聯(lián)劑的新DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。最后，另外培養(yǎng)細(xì)胞兩周。在此期間，更換一次培養(yǎng)基。
圖8A顯示了對經(jīng)上述培養(yǎng)但沒有任何測試交聯(lián)劑的人成纖維細(xì)胞的對照培養(yǎng)物進(jìn)行顯微照相得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象。如該圖所示，在petri培養(yǎng)皿中觀察到的細(xì)胞都是融合的。圖8B-8D顯示了對在添加有不同交聯(lián)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行顯微照相得到的計(jì)算機(jī)生成的圖象，各交聯(lián)劑的濃度如下1ppm戊二醛(8B)、5ppm環(huán)氧化物(8C)、和1000ppm京尼平(8D)。
在添加有戊二醛的培養(yǎng)基(圖8B)中的細(xì)胞密度是最低的，在經(jīng)環(huán)氧化物處理的培養(yǎng)基中略高一些。這兩個(gè)都低于對照培養(yǎng)基中的。相反的是，雖然京尼平的使用濃度更高，但在添加有京尼平的培養(yǎng)基(圖8D)中見到的細(xì)胞密度明顯高于添加有戊二醛或環(huán)氧化物的培養(yǎng)基中的。該結(jié)果表明京尼平的細(xì)胞毒性明顯低于戊二醛和環(huán)氧化物的毒性。Ⅳ、血紅蛋白的交聯(lián)該部分所述的結(jié)果表明，與京尼平聚合的血紅蛋白具有穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，而且分子量分布在長期儲存時(shí)仍保持不變。
在交聯(lián)用作血液替代品的血紅蛋白時(shí)，希望得到由2-9個(gè)單元構(gòu)成的血紅蛋白寡聚物，同時(shí)使過度聚合的血紅蛋白(＞9個(gè)單元和＞500KDa)及高鐵血紅蛋白的形成最小化。在本發(fā)明中，所進(jìn)行的研究是確定幾個(gè)因素對用京尼平處理血紅蛋白得到的產(chǎn)品分布的影響。如以下所述，這些因素包括(a)反應(yīng)時(shí)間、(b)血紅蛋白濃度、(c)京尼平/血紅蛋白摩爾比、(d)反應(yīng)溫度、(e)緩沖液pH、和(f)添加作為淬滅劑的賴氨酸。
對于各反應(yīng)，先用CO氣體清洗血紅蛋白，以降低反應(yīng)期間高鐵血紅蛋白的形成。如以下實(shí)施例3所述，用HPLC分析產(chǎn)品分布。
A、反應(yīng)時(shí)間在pH7.0和4℃下于2-48小時(shí)內(nèi)觀察產(chǎn)品分布，其中，血紅蛋白濃度為14g/dl，京尼平濃度為15mM。如表2所示，在12小時(shí)時(shí)，Hb1(未聚合的血紅蛋白)的濃度降低至60.15％，而高鐵血紅蛋白僅從14.98％增加至18.81％。在超過15小時(shí)時(shí)，觀察到過度聚合的血紅蛋白(＞500KDa)，所希望的交聯(lián)血紅蛋白增加最少，而高鐵血紅蛋白卻快速增加。因此，在此條件下最佳反應(yīng)時(shí)間是約12-15小時(shí)。
表2在不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)的分子量分布和高鐵血紅蛋白的形成
*Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始高鐵血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是15.69％B、血紅蛋白濃度京尼平濃度、pH、和反應(yīng)溫度與上述部分A相同。發(fā)現(xiàn)10-14g/dl范圍內(nèi)的血紅蛋白濃度對于聚合反應(yīng)是合適的。如果濃度低于10g/dl，所希望的交聯(lián)血紅蛋白(＜500KDa)隨血紅蛋白的濃度增加而增加，但反應(yīng)速率較慢。如果濃度高于14g/dl，如表3所示，過度聚合的血紅蛋白和高鐵血紅蛋白都增加。
表3不同血紅蛋白濃度時(shí)分子量分布和高鐵血紅蛋白的形成
*Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始高鐵血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是10.08
C、京尼平/血紅蛋白比血紅蛋白濃度(14g/dl)、溫度或pH不變。發(fā)現(xiàn)京尼平/血紅蛋白的最佳摩爾比在6/1-9/1范圍內(nèi)。在低于6/1的摩爾比時(shí)，反應(yīng)速率非常低，而且聚合血紅蛋白的產(chǎn)量低。如表4所示，高于9/1的摩爾比沒有增加所希望的聚合血紅蛋白，但也沒有產(chǎn)生更高濃度的高鐵血紅蛋白和過度聚合的血紅蛋白。
表4不同京尼平/血紅蛋白摩爾比時(shí)分子量分布和高鐵血紅蛋白的形成
*Hb血紅蛋白*Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始高鐵血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是22.18％D、緩沖液pH對于此系列反應(yīng)，溫度為4℃，反應(yīng)時(shí)間為15小時(shí)，血紅蛋白和京尼平的濃度分別為10g/dl和15mM(摩爾比7/1)。使用磷酸氫鉀(0.05M,pH4.0)、磷酸鈉(0.001M,pH9.0)、硼酸鈉(0.01M,pH9.0)、和碳酸鈉/碳酸氫鈉(0.19M/0.18M)的水溶液分別制備pH為5.5、7.5、和9.5的緩沖液。如表5所示，中性和堿性pH對于血紅蛋白的聚合是有利的。
表5不同pH值時(shí)分子量分布和高鐵血紅蛋白的形成
Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是17.12％E、反應(yīng)溫度對于該系列反應(yīng)，血紅蛋白和京尼平的濃度都不變，將pH調(diào)節(jié)為7.0。使用4-40℃范圍內(nèi)的溫度，結(jié)果見表6。如該表所示，更高的溫度誘發(fā)更高的血紅蛋白聚合度。在30-40℃時(shí)，60-65％的未聚合血紅蛋白在2小時(shí)內(nèi)反應(yīng)。但是，更高的溫度也增加了過度聚合之血紅蛋白和高鐵血紅蛋白以及細(xì)菌產(chǎn)物的形成。合適的溫度在4-20℃之間。
表6不同反應(yīng)溫度時(shí)分子量分布和高鐵血紅蛋白的形成
Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始高鐵血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是10.08％F、添加作為終止劑的賴氨酸賴氨酸通常用作蛋白交聯(lián)反應(yīng)的終止劑。同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)聚合反應(yīng)，并在14.5小時(shí)時(shí)向其中一個(gè)添加賴氨酸。血紅蛋白和京尼平的濃度分別為14g/dl和15mM，反應(yīng)時(shí)間為15小時(shí)，反應(yīng)溫度保持在4℃。如表7所示，賴氨酸可有效地使聚合反應(yīng)驟停，并降低過度聚合之血紅蛋白的濃度。
表7賴氨酸淬滅劑對血紅蛋白聚合反應(yīng)中分子量分布和高鐵血紅蛋白形成的影響
*Hbn交聯(lián)的血紅蛋白單元數(shù)量*Met Hb高鐵血紅蛋白*初始高鐵血紅蛋白百分?jǐn)?shù)是12.08％實(shí)施例以下實(shí)施例是用于說明而不限制本發(fā)明。實(shí)施例1交聯(lián)膠原性組織對降解酶的穩(wěn)定性使用從屠宰場得到的新鮮豬心包作為原料。取出后立即將組織樣品轉(zhuǎn)移至冷鹽水中，并用于固定。用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)緩沖5％京尼平溶液，用該溶液交聯(lián)生物組織。在37℃下進(jìn)行處理3天。固定后，用去離子水沖洗生物組織60分鐘。隨后在37℃下用70％乙醇溶液消毒已固定的組織7天。用戊二醛固定的和環(huán)氧化物固定的組織作為對照。固定時(shí)用0.625％戊二醛溶液。環(huán)氧試劑為4％的乙二醇二縮水甘油醚(DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)溶液。
用光學(xué)顯微鏡檢查各測試樣品在膠原酶或鏈酶蛋白酶降解之前和之后的膠原纖維結(jié)構(gòu)變化。測試樣品固定在10％甲醛溶液中，并用于組織學(xué)檢查。在組織學(xué)檢查中，在降解之前和之后用蘇木紫和曙紅染色各測試樣品的切面。
用Perkin Elmer差示掃描熱量計(jì)(Model DSC7,Norwalk,Connecticut,USA)測定各測試樣品的變性溫度。結(jié)果描述如上，并示于圖2和3中。從體外降解之前和之后的各測試樣品中切取組織條，用于測定抗拉強(qiáng)度。使用Instron Universal Testing Machine(Model4302)在50mm/min的恒定速度下通過單軸測量來測定組織條的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。結(jié)果描述如上，并示于圖4中。實(shí)施例2皮下植入研究使用如上所述的新鮮豬心包作為原料。沖洗樣品，并進(jìn)行清理以除去血管和脂肪，然后用京尼平(5％溶液)、環(huán)氧化物(4％的DenacolEX-810,Nagase Chemicals,Ltd.,Osaka,Japan)或戊二醛(0.625％溶液)在37℃下固定3天。對于6×6cm豬心包，各情況所用的溶液的量約為200ml。環(huán)氧化物溶液用0.21M碳酸鈉/0.02M碳酸氫鈉(pH10.5)緩沖，而戊二醛和京尼平溶液用0.01M磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4,SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)緩沖。經(jīng)固定的心包用一系列的乙醇溶液消毒約5小時(shí)，所述乙醇溶液的濃度逐漸增加(20％-75％)，最后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水沖洗數(shù)次。
在一只處于麻醉下的6周齡雄性Wistar鼠身上進(jìn)行皮下植入研究。在植入后第1和4周時(shí)回收植入物。如實(shí)施例1所述測定變性溫度和抗拉強(qiáng)度，并用原子吸收光譜測定鈣濃度。結(jié)果如以上所述，并示于圖5-7中。實(shí)施例3植入的組織樣品中鈣含量的測定凍干經(jīng)回收的組織樣品24小時(shí)，然后稱重。將凍干的樣品浸沒在6N鹽酸溶液(約3mg凍干組織/3ml 6N鹽酸)中，接著在微波水解系統(tǒng)(MDS-2000,CEM Co.,Matthews,NC,USA)中水解45分鐘。最后，用5％氯化鑭之3N鹽酸溶液稀釋經(jīng)水解的樣品。用原子吸收光譜儀(Mode1 AA-100,Perkin Elmer Inc.,Norwalk,Conn.,USA)測定各測試樣品中的鈣含量。實(shí)施例4血紅蛋白的聚合在4℃下用一氧化碳清洗血紅蛋白溶液1小時(shí)，然后在該溶液中添加京尼平。反應(yīng)時(shí)間、濃度、溫度和pH如上所述進(jìn)行變化。使用高效色譜在TSK3000SW硅膠過濾柱上(流動相溶劑0.1M磷酸鹽緩沖液，0.3M氯化鈉，pH=7；流速=0.8ml/min；檢測器在410nm和280nm)分析分子量分布(交聯(lián)度)和高鐵血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)。典型曲線見圖11。
權(quán)利要求
1.一種生物適合性的植入物或傷口敷料，其包括生物適合性的、交聯(lián)的、含胺的生物分子，所述生物分子選自于脫乙酰殼多糖或結(jié)締組織蛋白，其中，所述生物分子與京尼平交聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的植入物或傷口敷料，其中，所述生物分子是結(jié)締組織蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的植入物或傷口敷料，其中，所述結(jié)締組織蛋白是膠原。
4.如權(quán)利要求1所述的植入物或傷口敷料，其中，所述生物分子是脫乙酰殼多糖。
5.一種生物適合性的粘合劑，其包括生物適合性的、交聯(lián)的、得自于膠原性物質(zhì)的明膠，其中，所述明膠與京尼平交聯(lián)。
6.一種制備生物適合性的植入物或傷口敷料的方法，其包括將包含含胺之生物分子的材料制成適合于所述植入物或敷料的結(jié)構(gòu)，所述生物分子選自于脫乙酰殼多糖或結(jié)締組織蛋白，然后使所述材料與京尼平交聯(lián)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述材料包括結(jié)締組織蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述結(jié)締組織蛋白是膠原。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述材料包括脫乙酰殼多糖。
10.一種適用于血液替代品的組合物，其包括與京尼平交聯(lián)的血紅蛋白。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中，所述交聯(lián)血紅蛋白具有大于1至小于約9的平均聚合度。
12.一種制備交聯(lián)血紅蛋白的方法，其包括用一定量的京尼平處理血紅蛋白，所述量應(yīng)有效地交聯(lián)所述血紅蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，用一定量的京尼平處理所述血紅蛋白，所述量應(yīng)有效地使所述血紅蛋白的平均聚合度在大于1至小于約9之間。
全文摘要
本發(fā)明描述了生物適合性的、經(jīng)交聯(lián)的材料,其適合用作植入物、傷口敷料、和血液替代品。該材料是如下制備的:用一種天然交聯(lián)劑——京尼平交聯(lián)生物物質(zhì),如膠原、脫乙酰殼多糖、或血紅蛋白。該交聯(lián)劑的毒性比常規(guī)使用的試劑的毒性低得多,而且所述經(jīng)交聯(lián)的產(chǎn)品具有良好的熱和機(jī)械穩(wěn)定性以及生物適合性。
文檔編號A61L27/36GK1236324SQ97199454
公開日1999年11月24日 申請日期1997年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月5日
發(fā)明者李昭仁, 林景寬, 宋信文 申請人:嘉年生化產(chǎn)品有限公司