專利名稱：用于持續(xù)釋放蛋白質(zhì)藥物的溫敏凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于持續(xù)釋放藥物的溫敏聚合物，更具體而言是涉及包含天然大分子多肽藥物的poloxamers。
背景技術(shù)：
近些年來(lái)，在重組DNA技術(shù)方面取得了重要進(jìn)展，并隨之產(chǎn)生了許多用于各種治療需要的蛋白質(zhì)藥物。的確，蛋白質(zhì)或多肽是當(dāng)前欲獲得FDA批準(zhǔn)的最大一類藥物。然而，只有當(dāng)這些進(jìn)展與能夠有效給藥并具有穩(wěn)定性的組合物制劑相結(jié)合時(shí)，多肽藥物的治療和商業(yè)潛力才會(huì)被實(shí)現(xiàn)。
蛋白質(zhì)是由氨基酸殘基組成的大有機(jī)分子或大分子，這些氨基酸殘基通過(guò)肽鍵共價(jià)地連接成線性的、未分枝的多肽鏈，其相對(duì)分子量為幾千至幾百萬(wàn)。蛋白質(zhì)作為藥物的有用性質(zhì)取決于具有獨(dú)特立體折疊構(gòu)型的多肽鏈，即蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。正是該獨(dú)特的折疊構(gòu)型使蛋白質(zhì)在其能夠識(shí)別的分子中具有高度的選擇性。但是，保持獨(dú)特立體結(jié)構(gòu)的能力的確是一個(gè)障礙，這使得多肽在用于人和動(dòng)物疾病時(shí)充滿問(wèn)題。
從傳統(tǒng)來(lái)看，給藥治療藥物最廣泛使用的方法是口服給藥。然而，該方法對(duì)于大分子藥物是不可能的，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谙乐斜凰饷缚焖俳到獠⑹Щ?。即使?duì)酶消化是穩(wěn)定的，它們的分子量對(duì)于通過(guò)腸壁吸收也是過(guò)高的。因此，它們通常是經(jīng)非胃腸道給藥；但是，因?yàn)榇说人幬锿ǔＴ隗w內(nèi)具有較短的半衰期，所以需要經(jīng)常注射來(lái)產(chǎn)生有效的治療。令人遺憾的是，非胃腸道途徑雖然是最有效的給藥方式，但該途徑有許多嚴(yán)重缺陷注射疼痛，導(dǎo)致感染，而且由于重復(fù)靜脈注射導(dǎo)致嚴(yán)重的血管問(wèn)題。
為此，已有人考慮用可生物降解的聚合物基質(zhì)來(lái)作為各種活性藥劑或藥物的緩釋系統(tǒng)。一旦植入后，該基質(zhì)緩慢溶解或侵蝕，由此釋放藥物。另一種方法是使用小的可植入泵，該泵緩慢擠出藥物和基質(zhì)組分，它們?cè)诮佑|體液后溶解。對(duì)于這兩種系統(tǒng)，藥物在基質(zhì)中均勻分布都是非常關(guān)鍵的，這是因?yàn)椴痪鶆虻姆植?例如形成大的塊和孔隙)會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定的藥物釋放。另外，這兩種系統(tǒng)都需要聚合物保持一些流動(dòng)性，以使它們?cè)谥踩牖蜓b入裝置中前容易操作。
在科學(xué)出版物和專利文獻(xiàn)中已公開(kāi)了使用聚合物作為固體植入劑以及用在小的可植入泵中用于釋放幾種治療藥物。例如參見(jiàn)Ken等人“Invivo controlled release of an LHRH analog from injected polymericmicrocapsules”,Contracept,Deliv.Syst.,3:58(1982)；Sanders等人“Controlled release of a luteinizing hormone releasing hormone analoguefrom ply(d,1-1actide-co-glycolide)-microspheres”,J.Pharmaceut.Sci.,73:1294-1297(1984)；Johnston,T.P.等人“Sustained delivery of Interleukin-2 from a poloxamer 407 gel matrix following intraperitoneal injection inmice”,Pharmaceut.Res.,9(3):425-434(1992)；Yolks等人“Timedrelease depot for anti-cancer agents Ⅱ”,Acta Pharm.Svec.,15:382-388(1978)；Krezanoski“Clear,water-miscible,liquid pharmaceutical vehiclesand compositions which gel at body temperature for drug delivery tomucous membranes”，第4,474,752號(hào)美國(guó)專利。但是，最有可能用于釋放蛋白質(zhì)藥物的聚合物應(yīng)具有逆向熱凝膠作用，并具有良好的藥物釋放特性。
現(xiàn)有一類嵌段聚合物，其通常歸類為聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物，即Pluronic多元醇或poloxamer。它們是如下形成的縮合氧化丙烯為丙二醇核，然后在聚氧丙烯基體的兩端縮合氧化乙烯?？刂品肿觾啥松系木垩跻蚁┯H水基團(tuán)的長(zhǎng)度，使其為最終分子重量的10-80％左右。
Poloxamer具有隨溫度和聚合物濃度凝膠化的能力，其經(jīng)驗(yàn)式為HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH (Ⅰ)其中a和b是整數(shù)，它們的數(shù)值使以羥基數(shù)測(cè)定(C3H6O)a代表的疏水性基團(tuán)的分子量為約900-4000；而聚氧乙烯鏈至少為共聚物重量的60-70％，并且共聚物的總平均分子量為約4000-1500。下表1表示了各種poloxamer在室溫下于水中形成凝膠所必須的最小濃度。
表1

*Poloxamer可從BASF公司(Parsippany,N.J.)以上述商標(biāo)購(gòu)得。任何濃度的低分子量poloxamer，即低于10000 MW，都不會(huì)在水中形成凝膠。
雖然poloxamer，更具體而言是PluronicF-127或Poloxamer 407，已被用于釋放非肽類藥物以及生物活性蛋白質(zhì)，分別見(jiàn)第4,100,271和5,457,093號(hào)美國(guó)專利，但是在幾周或幾個(gè)月的時(shí)間中持續(xù)釋放生物活性大分子是不可能的，其原因是雙重的。首先，公開(kāi)了在Pluronic基質(zhì)中摻入蛋白質(zhì)的現(xiàn)有文獻(xiàn)僅公開(kāi)了濃度低于約2mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；第二，在聚合物系統(tǒng)中摻入蛋白質(zhì)的配制方法經(jīng)常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆失活，這是由于存在有機(jī)溶劑、pH變化和熱效應(yīng)。因此，公開(kāi)使用poloxamer作為釋放蛋白質(zhì)之藥物載體的現(xiàn)有文獻(xiàn)有兩個(gè)嚴(yán)重缺陷(ⅰ)使用的初始蛋白質(zhì)溶液濃度低；和(ⅱ)在使用或儲(chǔ)存期間有不可令人接受之百分比的蛋白質(zhì)失去了其生物活性。這兩個(gè)限制對(duì)制造在使用前可儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間而且給藥者能夠在幾周或更優(yōu)選幾個(gè)月的時(shí)間中控制蛋白質(zhì)劑量的多肽藥物釋放系統(tǒng)產(chǎn)生直接的影響。另外，已降解的蛋白質(zhì)降低了作為藥物的效用，還有可能誘發(fā)副反應(yīng)，如過(guò)敏和負(fù)面的免疫反應(yīng)。
所以仍需要一種多肽藥物釋放裝置或組合物，其具有高濃度的完全天然的大分子多肽，而且該多肽能夠有規(guī)律地釋放較長(zhǎng)的時(shí)間。
發(fā)明公開(kāi)因此，本發(fā)明的目的是提供一種多肽藥物釋放系統(tǒng)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種多肽藥物釋放裝置或組合物，其中蛋白質(zhì)或肽的濃度大于5mg/ml。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在所述藥物釋放裝置中摻入蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)以及新的特征將在以下描述中予以闡明，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此也將更為了解。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)中指出的組合、組合物以及方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
為實(shí)現(xiàn)上述及其他目的，并根據(jù)本發(fā)明的意圖，本發(fā)明的組合物包括具有熱凝膠化性質(zhì)的聚合物基質(zhì)，在該基質(zhì)中摻入至少一種生物活性大分子多肽的懸浮液，其濃度為組合物重量的0.5％或更大。
附圖簡(jiǎn)述附圖也是本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的一部分，其說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，并與說(shuō)明書(shū)一起用于解釋本發(fā)明的原理。附圖中

圖1表示各種添加劑對(duì)本發(fā)明溶液-凝膠轉(zhuǎn)化溫度的作用，其中各添加劑分別用以下符號(hào)代表-◆-0.1％PEG 800,-X-0.5M蔗糖，-■-1.0％PEG 800,-*-1.0M蔗糖，-△-PluronicF-127,-●-1.5M蔗糖實(shí)施本發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的藥物裝置或組合物提供用于向人或動(dòng)物控制和持續(xù)給藥完全天然之大分子多肽或治療劑的釋放系統(tǒng)。用于藥物釋放的可生物降解且生物相適的基質(zhì)是如下制備的在具有逆向熱凝膠化特性的藥物載體或聚合物基質(zhì)中均勻且非連續(xù)地懸浮完全天然之大分子多肽的可溶和不可溶性顆粒以及其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定組分，所述多肽的濃度為5mg/ml或更大。與已知系統(tǒng)一樣，當(dāng)所述裝置水化，并隨后侵蝕或溶解時(shí)，懸浮顆粒和其他組分通過(guò)擴(kuò)散和溶解作用被釋放。但是，與已知釋放大分子的聚合物基質(zhì)系統(tǒng)不同的是，本發(fā)明的組合物包括天然多肽的懸浮液，而不是溶液。因此，作為懸浮液可得到高濃度的多肽，并因而可實(shí)現(xiàn)在幾天、幾周或幾個(gè)月而不是幾小時(shí)的時(shí)間中持續(xù)給藥治療藥物。另外，在本發(fā)明的組合物中可摻入穩(wěn)定劑，以進(jìn)一步降低所述藥物的降解，這對(duì)藥物的效用以及儲(chǔ)存或?qū)⑺幬镞\(yùn)輸至世界各地都產(chǎn)生直接的影響。
本發(fā)明的藥物組合物是在進(jìn)行研究時(shí)的一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)，該研究的目的是簡(jiǎn)單鑒別出對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有益作用之聚合物基質(zhì)的藥物釋放系統(tǒng)。在該研究中，使用了Fourier轉(zhuǎn)換紅外光譜學(xué)，這是因?yàn)樗軌蛴糜诜治鋈芤骸腋∫汉凸腆w中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。在該文獻(xiàn)中公開(kāi)的各種蛋白質(zhì)藥物釋放基質(zhì)中，那些使用聚合物洗滌劑PluronicF-127的系統(tǒng)對(duì)于紅外光譜學(xué)研究是最有吸引力的，該聚合物洗滌劑形成了溫敏凝膠，因?yàn)閜oloxamer的紅外吸收沒(méi)有干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)評(píng)估用吸收信號(hào)(以poloxamer的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ))。另外，已事先確定，足夠濃度的poloxamer在低于室溫的溫度時(shí)具有液化特性，但將其溫?zé)釙r(shí)則形成凝膠。因此，本研究的進(jìn)一步目的是測(cè)定poloxamer之由液體向凝膠轉(zhuǎn)化作用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生什么影響。為用紅外光譜學(xué)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的濃度必須至少為15-20mg/ml，為此在有足夠poloxamer存在時(shí)制備濃度為20mg/ml的蛋白質(zhì)濃溶液，以在溫?zé)釙r(shí)凝膠化。所得的蛋白質(zhì)溶液形成細(xì)的、乳液狀懸浮液，該懸浮液在開(kāi)始時(shí)有些令人失望，這是因?yàn)樾纬纱说葢腋∫和ǔ１砻魅芤航M分(如聚合物洗滌劑)使蛋白質(zhì)變性，并形成非天然或失活的蛋白質(zhì)聚集物，也表示試驗(yàn)的失敗。但是，令人感到幸運(yùn)的是，可使用紅外光譜學(xué)來(lái)分析懸浮液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以分析了該懸浮液。令人驚奇的是，在用Fourier轉(zhuǎn)換紅外光譜學(xué)分析蛋白質(zhì)懸浮液時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)期望之中的非天然或失活蛋白質(zhì)聚集物，而是意外地發(fā)現(xiàn)完全是天然的。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物包括聚合物，例如下式的聚氧化烯嵌段定共聚物HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH (Ⅰ)在優(yōu)選實(shí)施方案中，該聚合物具有在室溫或更低溫度下為液體但在哺乳動(dòng)物體溫時(shí)為半固體的獨(dú)特特征，其中a和b分別為20-80和15-60的整數(shù)。用作本發(fā)明藥物載體的優(yōu)選聚氧化烯嵌段共聚物是具有以下通式的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物HO-(CH2CH2O)b(CH2(CH3)CHO)a(CH2CH2O)b-H(Ⅱ)其中，a和b為整數(shù)，它們的數(shù)值使以羥基數(shù)測(cè)定的(CH2(CH3)CHO)a代表的疏水基具有至少約4000的分子量；聚氧乙烯鏈占分子中單體單元總數(shù)的約70％，而且該共聚物的平均分子量約為12600。PluronicF-127，也稱為Poloxamer 407，就是此等材料。
用于制備形成聚氧化烯嵌段共聚物凝膠之水溶液的方法是已知的。例如，可使用形成該溶液的熱法或冷法。冷法涉及以下步驟將聚氧化烯嵌段共聚物在5-10℃的溫度下溶解在水或緩沖液中，如磷酸鹽緩沖液。如果用于形成水溶液，水優(yōu)選是經(jīng)過(guò)純化的，如蒸餾、過(guò)濾、離子交換等。當(dāng)完成該溶液后，將其置于室溫下，即可形成凝膠。如果使用熱法形成凝膠，則將聚合物加至水或緩沖液中，然后加熱至約75-80℃的溫度，并緩慢攪拌，直至得到透明的均勻溶液，冷卻時(shí)即形成凝膠。
任何大分子多肽都可與該藥物載體混合，以形成本發(fā)明的藥物組合物，其中大分子多肽的濃度為組合物重量的0.5-50％。選擇根據(jù)本發(fā)明釋放的多肽時(shí)僅有一個(gè)限制，即、它們至少略溶于含水生理介質(zhì)中，如血漿、間隙液、以及皮下和粘膜組織的胞內(nèi)和胞外液。
多肽的例子包括蛋白質(zhì)、酶、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、激素活性的多肽、以及合成的類似物包括上述分子的激動(dòng)劑和拮抗劑。
適用于摻入本發(fā)明之釋放系統(tǒng)中的多肽的具體例子包括以下生物活性大分子干擾素、白介素、胰島素、酶抑制劑、集落刺激因子、血漿酶原活化劑、生長(zhǎng)因子和多肽激素。
上述的大分子多肽僅用于說(shuō)明適用于本發(fā)明中的活性物質(zhì)的類型，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的藥物組合物可使用任何使聚氧化烯嵌段共聚物達(dá)到凝膠化所必須的濃度的溶液形成技術(shù)來(lái)容易地制備。優(yōu)選的是，單獨(dú)制備藥物載體和多肽混合物，然后于大約0-10℃下在其中加入濃度為5mg/ml或更高的多肽混合物。在混合時(shí)，蛋白質(zhì)在聚合物溶液中形成細(xì)顆粒的均勻懸浮液，該懸浮液具有乳液的外觀。在光顯微鏡下，顆粒的粒徑約為5-10微米。將樣品溫度升高至poloxamer的凝膠點(diǎn)以上，使蛋白質(zhì)顆粒均勻地分布在聚合物凝膠中。由于凝膠基質(zhì)的高粘性，所述顆粒仍保持均勻分布，而不會(huì)沉積。液體至凝膠的轉(zhuǎn)化在冷卻時(shí)是完全可逆的。另外，將凝膠接觸水溶液時(shí)，凝膠基質(zhì)和蛋白質(zhì)顆粒溶解，釋放出仍保持90％以上生物活性的完全天然的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的藥物組合物可作為液體通過(guò)注射直接植入身體中，在身體中藥物組合物立即凝膠化。此外，可將藥物組合物引入至小的可植入泵中，然后再將該泵引入至身體中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在上述的本發(fā)明藥物裝置中摻入穩(wěn)定蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。首先，在本發(fā)明的藥物裝置中加入穩(wěn)定劑，以增加大分子多肽的穩(wěn)定性，而此穩(wěn)定作用對(duì)使用本發(fā)明裝置在體內(nèi)持續(xù)釋放蛋白質(zhì)是關(guān)鍵性的。但是，在實(shí)施過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的溶質(zhì)如蔗糖不僅有助于保護(hù)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)，而且還使poloxamer能夠在其濃度低于僅在水或緩沖液中所需的濃度時(shí)形成合適的凝膠。因此，增寬了聚合物濃度的工作范圍。如以上所討論的，聚氧化烯嵌段共聚物的濃度是一個(gè)重要的參數(shù)。已知的是，如圖1中空心三角線所示，如果聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物在水或稀釋緩沖液中的濃度在約20-30重量％的范圍之外，不會(huì)形成凝膠。但是，通過(guò)在本發(fā)明的藥物裝置中引入穩(wěn)定蛋白質(zhì)的溶質(zhì)，可控制凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度，并降低聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物形成凝膠所必須的濃度。
在第三實(shí)施方案中，在-10至10℃、優(yōu)選0-4℃的低溫下離心本發(fā)明藥物組合物足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以沉降蛋白質(zhì)顆粒，由此可實(shí)現(xiàn)在0.5-50重量％范圍之高限處的多肽濃溶液。例如，在4℃離心包含20mg/ml蛋白質(zhì)的上述藥物組合物樣品，使得不溶性的蛋白質(zhì)顆粒沉降。可除去一半體積的上清液，然后將沉降物重新懸浮在剩余的液體中。這可使懸浮液包含約40mg/ml。
根據(jù)以下制備方法來(lái)制備本發(fā)明的藥物組合物。因?yàn)榫垩趸┰谳^低溫度下可更完全地溶解，優(yōu)選的溶解方法是將所需量的共聚物添加至所用量的水或緩沖液中。通常在震搖使共聚物濕潤(rùn)后，密封混合物，并放置在約0-10℃的冷卻室或恒溫容器中，以溶解該共聚物。攪拌或震搖混合物，使聚合物更快地溶解。隨后添加多肽和各種添加劑如穩(wěn)定劑，并溶解，以形成懸浮液。
以下非限制性的實(shí)施例提供了制備用于緩釋藥物的溫敏聚合物，其中包含高濃度的完全天然的大分子多肽藥劑。所有的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的意思。以下的具體實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)的代表性多肽和濃度，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。為制備本發(fā)明范圍所包括但沒(méi)有具體公開(kāi)的組合物或裝置，可改動(dòng)該方法。制備相同組合物的各種方法可略有不同，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
沒(méi)有具體說(shuō)明，所有溫度都是攝氏度(℃)。紅外(IR)光譜描述是在Nicolet Magna-IR 550光譜儀上測(cè)定的。使用市售的化學(xué)品，不進(jìn)行純化。
在以下實(shí)施例中，按以下方式制備PluronicF-127的27.5％(w/w)溶液。在包含20 g冰冷磷酸鹽緩沖液(pH 7.4,30 mM)的無(wú)菌試管中加入7.59 g PluronicF-127。密封該試管，并于4℃儲(chǔ)存過(guò)夜前充分震搖混合物。
實(shí)施例1靡蛋白酶之PluronicF-127懸浮液的制備和表征a)懸浮液的制備制備靡蛋白酶在30 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的懸浮液，其濃度為100 mg/ml，在4℃下混合50μl該懸浮液和200μl 27.5％(w/w)PluronicF-127溶液，之后立即形成白色、均勻的乳液狀懸浮液。該懸浮液包含20 mg/ml蛋白質(zhì)和22％(w/w)PluronicF-127，其在低于18℃時(shí)為粘稠的液體，在20℃以上時(shí)為軟的固體凝膠。在4℃放置1或2天或者冷卻離心時(shí)，液體懸浮液中的晶體部分從溶液中沉降出來(lái)，但通過(guò)冷卻混合可容易地重新懸浮。懸浮物質(zhì)可以沉降出來(lái)并重新懸浮于其體積比原始懸浮液體積更小的溶液中，如上所述，這能夠形成明顯更高濃度的懸浮液。
為測(cè)定靡蛋白酶在懸浮液之液相中的溶解度，分光光度分析總懸浮液的等分液和在4℃下于1000-5000 rpm離心5分鐘后的上清液的等分液的酶活性。仍溶解在PluronicF-127中的靡蛋白酶的濃度見(jiàn)下表2所示。
表2

1上清液中測(cè)得的活性除以總懸浮液中每mg蛋白質(zhì)的計(jì)算活性2n=3b)懸浮酶通過(guò)FTIR測(cè)定具有類似于天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)使用Nicolet Magna-IR 550光譜儀在調(diào)節(jié)溫度下得到紅外光譜，并使用6μM光程長(zhǎng)度測(cè)定池檢查和比較磷酸鹽緩沖液(30mM,pH7.4)中和22％(w/w)PluronicF-127之相同緩沖液的溶液中的靡蛋白酶的結(jié)構(gòu)。該研究中的蛋白質(zhì)濃度為20 mg/ml。仔細(xì)檢查光譜發(fā)現(xiàn)，由于將蛋白質(zhì)懸浮在PluronicF-127中，靡蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)未改變。另外，在低于和高于凝膠轉(zhuǎn)化(約15-18℃)的溫度下對(duì)PluronicF-127中的靡蛋白酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行FTIR光譜檢查，其結(jié)果表明形成凝膠并沒(méi)有改變結(jié)構(gòu)。c)懸浮酶保持生物活性在該試驗(yàn)中，如上所述制備靡蛋白酶在22％PluronicF-127中的懸浮液，但有兩個(gè)不同的濃度，20mg/ml和2mg/ml。使用磷酸鹽緩沖液(30mM,pH 7.4)但不使用PluronicF-127制備具有相同蛋白質(zhì)濃度的溶液。如需要稀釋這些溶液的等分液，并如以上所述測(cè)試酶活性。從下表3可以看出，摻入在凝膠中的酶可定量恢復(fù)，而且在凝膠溶解于緩沖液后沒(méi)有丟失活性。
表3

1磷酸鹽，30 mM,pH 7.4222％(w/w)，在磷酸鹽緩沖液中，pH 7.43在410 nm以mAU/min表示4n=9包含在PluronicF-127中，沒(méi)有降低靡蛋白酶的生物活性。洗滌劑在酶測(cè)試混合物中的含量低時(shí)，觀察到活性略有增強(qiáng)。由于20 mg/ml樣品中凝膠稀釋較大，而且2 mg/ml樣品中PluronicF-127濃度較高，所以有可能造成表3中2 mg/ml樣品和20 mg/ml樣品之間觀察到的百分恢復(fù)的不同。d)懸浮酶具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性為證實(shí)懸浮在22％PluronicF-127中的蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定作用，如上所述在30 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)或者22％PluronicF-127之相同磷酸鹽緩沖液的溶液中制備20 mg/ml靡蛋白酶。如需要稀釋這些懸浮液，并測(cè)定酶活性。結(jié)果見(jiàn)下表4，其表明酶在PluronicF-127存在時(shí)溫育可保留比僅溫育在磷酸鹽緩沖液中的酶更多的活性。
表4

1磷酸鹽222％(w/w)，在磷酸鹽緩沖液中，pH 7.43以1小時(shí)值的百分比表示4得不到數(shù)值因此，PluronicF-127提供穩(wěn)定的環(huán)境，這在更長(zhǎng)的時(shí)間和更高的溫度時(shí)更為明顯，其中包含肽和蛋白質(zhì)的藥物可在釋放前或釋放期間懸浮。另外，可如實(shí)施例6中所述的，進(jìn)一步在該組合物中添加其它的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
實(shí)施例2枯草菌溶素之PluronicF-127懸浮液的制備和表征a)懸浮液的制備如以上靡蛋白酶中描述的相同方法制備枯草菌溶素懸浮液。其物理性質(zhì)在乳液狀白色懸浮液形成和凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度方面是相同的。用以上方法檢查懸浮液之液相中的枯草菌溶素的溶解度，并發(fā)現(xiàn)與不同蛋白質(zhì)所預(yù)料到的不同。結(jié)果見(jiàn)下表5。
表5<

1上清液中測(cè)得的活性除以總懸浮液中每mg蛋白質(zhì)的計(jì)算活性2n=2b)懸浮酶通過(guò)FTIR測(cè)定具有類似于天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)類似于靡蛋白酶中所述的，通過(guò)FTIR光譜學(xué)檢查枯草菌溶素懸浮液，以測(cè)定包含在凝膠中是否會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生作用以及凝膠-溶液轉(zhuǎn)化是否會(huì)影響結(jié)構(gòu)。如靡蛋白酶的情況，對(duì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。c)懸浮酶保持生物活性在類似于如上所述靡蛋白酶的試驗(yàn)中，在磷酸鹽緩沖液和22％Pluronic之F-127磷酸鹽緩沖液的溶液中制備枯草菌溶素懸浮液，然后用緩沖液稀釋來(lái)溶解。在這些類似于靡蛋白酶的情況中，恢復(fù)100％的酶活性，這表明雖然摻入在凝膠懸浮液中，但生物活性仍是穩(wěn)定的。d)懸浮酶具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性類似于以上靡蛋白酶中所述，為證實(shí)懸浮在22％PluronicF-127中的枯草菌溶素具有穩(wěn)定作用，如上所述在30 mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)或者22％PluronicF-127之相同磷酸鹽緩沖液的溶液中制備20mg/ml枯草菌溶素。這些懸浮液在8、25和37℃下溫育最長(zhǎng)至118小時(shí)，如需要稀釋凝膠或懸浮液，并測(cè)定酶活性。結(jié)果見(jiàn)下表6，其表明即使枯草菌溶素具有自動(dòng)催化性，并比靡蛋白酶更快失去活性，但其在PluronicF-127存在時(shí)溫育可保留比僅溫育在磷酸鹽緩沖液中更多的活性。
表6

1磷酸鹽，30 mM,pH 7.4222％(w/w)，在磷酸鹽緩沖液中，pH 7.43以0.5小時(shí)值的百分比表示實(shí)施例3乳酸脫氫酶之PluronicF-127懸浮液的制備和表征a)懸浮液的制備如以上靡蛋白酶中描述的相同方法制備乳酸脫氫酶懸浮液。肉眼觀察表明其物理性質(zhì)在乳液狀白色懸浮液形成和凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度方面是相同的。b)懸浮酶保持生物活性在類似于如上所述靡蛋白酶的試驗(yàn)中，在磷酸鹽緩沖液和22％PluronicF-127之磷酸鹽緩沖液的溶液中制備乳酸脫氫酶懸浮液。在這些類似于靡蛋白酶的情況中，恢復(fù)100％的酶活性，這表明雖然摻入在凝膠懸浮液中，但生物活性仍是穩(wěn)定的。c)懸浮酶具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行類似于以上靡蛋白酶中所述的試驗(yàn)，證實(shí)PluronicF-127在高溫下于儲(chǔ)存期間穩(wěn)定乳酸脫氫酶之酶活性的作用。在此情況下，在一些樣品中加入0.5 M蔗糖，并由此將PluronicF-127的濃度降低至18％，以保持相同的凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度。下表7顯示了乳酸脫氫酶在37℃下儲(chǔ)存48小時(shí)所得到的結(jié)果。
表7

1所用的緩沖液都是50mM Tris-HCl,pH 7.35，帶有0.1％ NaN32以任意單位表示實(shí)施例4牛血清白蛋白之PluronicF-127懸浮液的制備和表征a)懸浮液的制備制備幾種PluronicF-127和牛血清白蛋白的混合物，以發(fā)現(xiàn)在室溫下蛋白濃度為15mg/ml或更高的澄清凝膠的組合。低于20％(w/w)濃度的PluronicF-127在25℃或更低的溫度下將不會(huì)凝膠，20％或更高的濃度則在加入14mg/ml和更高濃度的牛血清白蛋白時(shí)產(chǎn)生乳液狀白色懸浮液。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何組合可產(chǎn)生所希望的性質(zhì)。隨后研究了幾種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，結(jié)果表明沒(méi)有必要用澄清凝膠來(lái)得到令人滿意的并含有PluronicF-127的蛋白質(zhì)藥物釋放組合物。b)懸浮酶通過(guò)FTIR測(cè)定具有類似于天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)先用FTIR光譜檢查20mg/ml牛血清白蛋白在22％PluronicF-127中的懸浮液的結(jié)構(gòu)，表明與該蛋白質(zhì)僅在緩沖液中的類似懸浮液沒(méi)有區(qū)別。該結(jié)果類似于檢查凝膠中靡蛋白酶和枯草菌溶素結(jié)構(gòu)的結(jié)果。實(shí)施例5胰島素之PluronicF-127懸浮液的制備和表征a)懸浮液的制備如以上靡蛋白酶中描述的相同方法制備胰島素懸浮液。肉眼觀察表明其物理性質(zhì)在乳液狀白色懸浮液形成和凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度方面是相同的。b)懸浮蛋白質(zhì)通過(guò)FTIR測(cè)定具有類似于天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)類似于靡蛋白酶中所述的，通過(guò)FTIR光譜學(xué)檢查胰島素懸浮液，以測(cè)定包含在凝膠中是否會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生作用以及凝膠-溶液轉(zhuǎn)化是否會(huì)影響結(jié)構(gòu)。如靡蛋白酶的情況，對(duì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。
實(shí)施例6用于改變凝膠性質(zhì)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑在PluronicF-127溶液中摻入各種濃度的蔗糖，作為改變凝膠性質(zhì)之已知蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的例子。凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度的典型結(jié)果見(jiàn)下表8。
表8

1w/w，在30mM磷酸鹽中，pH 7.4從表8中可清楚看出，如本發(fā)明所需要，可在低于0℃至約25℃的范圍內(nèi)改變凝膠-溶液轉(zhuǎn)化溫度。
前述說(shuō)明僅用于闡明本發(fā)明的原理。而且，因?yàn)樵S多修改或改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，所以無(wú)意將本發(fā)明限制于上述精確構(gòu)造和方法中。因此，所有合適的改進(jìn)和等同物都在以下權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于控制和持續(xù)給藥生物活性大分子多肽的藥物組合物，其包括具有熱凝膠化性質(zhì)的聚合物基質(zhì)，在該基質(zhì)中摻入至少一種生物活性大分子多肽的顆粒懸浮液，所述多肽能夠保持在摻入所述聚合物基質(zhì)前之生物活性的90％以上的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述聚合物基質(zhì)是聚氧化烯嵌段共聚物。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述聚氧化烯嵌段共聚物具有以下式HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH式中聚氧乙烯單元至少構(gòu)成所述聚氧化烯嵌段共聚物重量的70％，而a和b為整數(shù)，它們的數(shù)值使(C3H6O)a代表的疏水基具有至少約4000的分子量，且所述共聚物具有約12600的平均分子量。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述聚氧化烯嵌段共聚物具有式HO-(CH2CH2O)b(CH2(CH3)CHO)a(CH2CH2O)b-H式中a為20-80，和b為15-60
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，a是67,b是49。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述懸浮液進(jìn)一步包括可溶的和不可溶的顆粒、以及可溶的大分子多肽分子。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述大分子多肽的顆粒占組合物重量的0.5％以上。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包括蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)是蔗糖。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述蔗糖的摩爾濃度為0.5-1.5。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)是聚乙二醇。
12.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，在添加所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)時(shí)可降低形成凝膠所必須的所述聚合物基質(zhì)的最低濃度。
13.一種用于控制和持續(xù)給藥生物活性大分子多肽的藥物組合物，其包括聚合物基質(zhì)，在該基質(zhì)中摻入至少一種生物活性大分子多肽的顆粒懸浮液，其中，所述多肽占該組合物重量的0.5％以上。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述多肽能夠保持在摻入所述聚合物基質(zhì)前之生物活性的90％以上的活性。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述聚合物基質(zhì)具有熱凝膠化性質(zhì)。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中，所述聚合物基質(zhì)是聚氧乙烯一聚氧丙烯嵌段共聚物。
17.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述懸浮液進(jìn)一步包括可溶的和不可溶的顆粒、以及可溶的大分子多肽分子。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中，在添加蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)時(shí)可降低形成凝膠所必須的所述聚合物基質(zhì)的濃度。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中，所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶質(zhì)是蔗糖。
20.一種在已知體積中得到高濃度天然蛋白質(zhì)顆粒的方法，其包括以下步驟制備聚氧化烯嵌段共聚物的混合物，其濃度足以使其具有逆向熱凝膠化性質(zhì)；然后在所述混合物中添加至少一種天然大分子多肽，其濃度足以在添加至所述混合物中時(shí)形成懸浮液。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述聚氧化烯嵌段共聚物是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的濃度為已知體積之重量的15-30％。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述天然大分子多肽的濃度為已知體積之重量的0.5％或更多。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于控制和持續(xù)給藥藥理活性蛋白質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括具有熱凝膠化性質(zhì)的聚合物基質(zhì),在該基質(zhì)中摻入至少一種生物活性大分子多肽的非連續(xù)顆粒懸浮液,所述多肽能夠保持90%以上的生物活性。另外,所述大分子多肽的濃度為組合物重量的0.5%以上。
文檔編號(hào)A61K47/10GK1230108SQ97197798
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月12日
發(fā)明者劉易斯·P·斯特拉頓, 約翰·F·卡彭特, 馬克·C·曼寧 申請(qǐng)人:大學(xué)技術(shù)公司