專利名稱：應(yīng)用氟吡氨酯預(yù)防和治療與造血細胞系統(tǒng)損傷有關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氟吡氨酯(flupirtine)或它的鹽類作為藥物在預(yù)防和治療與造血細胞系統(tǒng)(例如淋巴細胞)損傷有關(guān)的疾病中的應(yīng)用。
氟吡氨酯是一種已知的、明確的非阿片類鎮(zhèn)痛劑，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。
氟吡氨酯表現(xiàn)出的鎮(zhèn)痛作用機制與阿片劑/類阿片鎮(zhèn)痛劑不同〔Nickel，B.，《醫(yī)學研究生雜志》(Postgrad Med J)，63期(增刊第3號)，19頁(1987年)；Szelenyi，I.，Nickel，B.，Borke，H.O.，Brune K.，《英國藥理學雜志》(Br.J.Pharmacol)，143期，89頁(1989年)〕。電生理研究表明，氟吡氨酯能夠在脊髓和脊髓上水平影響感受傷害活動〔Carisson，K.H.，Jurna，I.，《歐洲藥理學雜志》(Eur.J.Pharmakol)，143期，89頁(1987年)；Bleyer，H.，Carlsson，K.H.，Erkel，H.J.，Jurna，I.，《歐洲藥理學雜志》151期，259頁(1988年)；Nickel，B.，Aledter，A.，《醫(yī)學研究生雜志》，63期(增刊第3號)，41頁(1987年)〕。
氟吡氨酯還可以用于運動系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的急性疼痛期間的治療。
進一步，氟吡氨酯還成功地治療了變性或風濕性疾病。
除了良好的鎮(zhèn)痛作用，氟吡氨酯還具有松馳肌肉的特性。因此它也用于治療肌肉緊張，或由肌肉緊張導(dǎo)致的疾病(DE 40 22 442)。
在研究氟吡氨酯對大鼠的肌松作用過程中，進一步發(fā)現(xiàn)興奮性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDR)能夠抑制氟吡氨酯的作用。由于這種NMDR拮抗作用，氟吡氨酯也適于治療一些由NMDR介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如腦缺血、神經(jīng)變性疾病和癲癇發(fā)作(DE 43 27516)。
氟吡氨酯的化學名稱是2-氨基-3-乙氧羰基氨基-6-(對氟芐基氨基)吡啶。氟吡氨酯和其藥學適用鹽類的合成方法已由專利DE 1795 858、DE 31 33 519和DE 34 16 609說明。
令人驚奇地是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)氟吡氨酯能夠抑制造血系統(tǒng)(例如淋巴細胞)細胞的細胞凋亡。
這一發(fā)現(xiàn)有希望打開用氟吡氨酯治療一些與造血細胞系統(tǒng)損傷有關(guān)的疾病的希望，特別重要之處是治療HIV感染患者/艾滋病人。
本發(fā)明將通過藥理學研究闡述氟吡氨酯的新作用。
藥理學研究材料馬來酸氟吡氨酯〔2-氨基-3-乙氧羰氨基-6-(對氟芐基氨基)吡啶馬來酸鹽〕，用HIV-1病毒株HTLVIIIB制備的HIV-1-gp120(Popovic等，1984年)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，制備的gp120制備物純度大于95％〔Muller等，1988年〕。
抗逆轉(zhuǎn)錄病毒分析HIV-1病毒的分析方法已有報道〔Sarin等，1987年〕。人T-淋巴母細胞系CEM(接種濃度1×105個細胞/ml)的細胞懸浮在培養(yǎng)基中并用HIV-1病毒(HTLVIIIB株)感染，選擇一個50％細胞培養(yǎng)感染劑量〔CCID50〕的50倍作為實驗中所用的感染量。一個CCID50指懸浮細胞中每毫升細胞的50％被感染所用的感染劑量。1毫升培養(yǎng)液孵育5天。在感染前2小時把不同濃度的氟吡氨酯加至細胞中。通過3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯四唑溴〔MTT〕比色分析法計算活細胞的數(shù)目〔Scudiero等，1988年〕，也可以用不久前分布的方法，通過ELISA讀數(shù)儀測定〔Muller等，1991年〕。孵育后，未感染的CEM細胞進行2.16個，而感染的細胞則進行0.13個細胞分裂周期。
血液樣本人外周血的樣本采自(i)12個HIV-1感染的男性同性戀者〔平均年齡35歲；年齡范圍22-43歲〕，(ii)8個健康的HIV-1血清學陰性的男性，但與上組患者年齡相近，有同樣患病的危險因素〔平均年齡30歲；年齡范圍23-35歲〕。根據(jù)美國疾病控制中心(CDC，1992年)的分類標準將患者分類。用HIV-1血清學陽性的患者與無癥狀的病毒攜帶者的血樣進行研究(美國疾病控制中心標準A1，A2意味著CD4細胞數(shù)是407個/μl，范圍209-698個/μl)。病史中無一例患者出現(xiàn)過腫瘤、有癥狀的感染，或者在采集血樣10周前曾經(jīng)接受過免疫抑制劑，例如可的松的治療。
細胞制備及其處理用Ficoll-Hypaque密度梯度液離心肝素化的血液，從中分離出單核細胞(MNC)并且濃縮〔Rossol等，1990年〕。0.5×106個細胞置于終容量為500μl的培養(yǎng)基中，所用的培養(yǎng)基是MEM-培養(yǎng)基，內(nèi)含10mM HEPES緩沖液、2.6％碳酸氫鈉、100單位/L青霉素、100μg/ml鏈霉素、10％胎牛血清(FCS)和1mM谷氨酸。需強調(diào)的是，分離之后要用化學物質(zhì)立刻處理細胞。
用反應(yīng)活性氧誘導(dǎo)細胞調(diào)亡通過次黃嘌呤〔HX〕和黃嘌呤氧化酶〔XOD〕系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)活性氧基〔Bruck等，1994年〕。
單核細胞在總?cè)萘繛?00μl的MEM培養(yǎng)基中懸浮24小時(如上描述)。
0-80mU/ml的黃嘌呤氧化酶和1mM次黃嘌呤加入這份細胞中。黃嘌呤氧化酶(Sigma公司，德國慕尼黑)濃度為90mU/ml時，90％以上的淋巴細胞出現(xiàn)凋亡。
除非特別地指出，下列試驗中用的是10mU/ml黃嘌呤氧化酶和1mM次黃嘌呤。在這樣的孵育條件下，大約50％的細胞出現(xiàn)凋亡。當檢查某種化合物是否是一種潛在的細胞凋亡的抑制劑和/或刺激劑時，最好能保持這個50％的細胞凋亡比率。氟吡氨酯加主細胞中之前6小時加入產(chǎn)生氧基的系統(tǒng)，孵育1天后中止反應(yīng)。
連續(xù)流式細胞儀做細胞分析根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的方法(Schmid等，1994年)，用FACScan(Becton-Dickinson產(chǎn)品)連續(xù)流式細胞儀分析細胞的凋亡，細胞儀以488nm波長的氬激光激發(fā)。通過光學方法，結(jié)合前光散射檢查細胞的大小〔FSC〕和垂直散射光檢查細胞表面的成分〔SSC〕，來區(qū)分并且確定淋巴細胞。為了染色凋亡的單核細胞，要把這些細胞孵育在含20μg/ml的7-氨基放線菌素D(7-AAD)(Sigma產(chǎn)品)的PBS溶液中，置4℃黑暗中20分鐘。然后，在染液中用連續(xù)流式細胞儀分析細胞。用650nm波長的濾過器檢查7-氨基放線菌素D發(fā)出的紅色熒光。
由于細胞膜的裂解，7-氨基放線菌素D穿透凋亡的細胞，通過插入過程進-步將DNA染色。用LYSIS II程序分析數(shù)據(jù)。
均道數(shù)轉(zhuǎn)化成平均熒光強度、細胞大小和表面組成成分。
用TdT法和表面標記進行原位熒光標記為了明確某一細胞亞群正在發(fā)生細胞的凋亡，以末端轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(TdT)處理細胞，應(yīng)用Gorczyca等(1993年)的方法并稍做改進。懸浮細胞用PBS(Gibco產(chǎn)品)沖洗二次，然后用1％強度的多聚甲醛(Riedel de Haen產(chǎn)品)4℃下固定10分鐘。用PBS液(已加入5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)沖洗二次后，將細胞沉集，并重新懸浮于加了0.5nM生物素-16-dUTP和25U末端轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的50μl的2.5mM氯化鈷溶液中，再加入200mM卡可酸鉀、25mM Tris-HCl和0.25mg/ml牛血清白蛋白成為緩沖液。根據(jù)制造商的用戶指南(Boehringer Mannheim，Mannheim，F(xiàn)RG)，37℃下孵育30分鐘。然后用PBS緩沖液(內(nèi)含5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)沖洗二次，再懸浮于100μl含有5μg/ml熒光異硫氰酸鹽(FITC)標記的生物素(細胞分析試劑純度)的緩沖染液中。細胞另外用20μg/ml藻紅素標記的單克隆抗CD3抗體(Becton-Dickinson產(chǎn)品)處理作同時的表面標記。
通過Halliwell(1987年)介紹的方法，用連續(xù)流式細胞儀確定熒光數(shù)量。
結(jié)果用氟吡氨酯處理HIV-1感染的CEM細胞CEM細胞用氟吡氨酯預(yù)處理2小時，然后保持非感染態(tài)；或者用HIV-1感染作為平行試驗。
5天后就可以測得相關(guān)試驗的細胞數(shù)目。圖1顯示，用氟吡氨酯處理后，非感染態(tài)細胞與感染培養(yǎng)基中的細胞濃度無顯著性差異(P＞0.1)。
試驗中加入氟吡氨酯的終濃度是0.1-30μg/ml。非感染試驗組中的細胞濃度是446,880±31,020個/ml，而HIV-1感染組的細胞濃度是108,420±6,710個/ml。
該結(jié)果說明，氟吡氨酯對細胞無毒性作用，而且在所實施的孵育條件下，體外不影響HIV-1的感染。
次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)要選擇合適的黃嘌呤氧化酶的濃度，使凋亡的細胞比率大約為50％。
凋亡的細胞顯示出的熒光強度大于10個任意均道數(shù)。黃嘌呤氧化酶濃度為0時，只有6.6±2.1％的細胞超過這個大于10個任意均道數(shù)的界線，即6.6％的細胞出現(xiàn)凋亡。隨著黃嘌呤氧化酶濃度的增加，凋亡細胞的比率也增加。當黃嘌呤氧化酶濃度為80mU時，凋亡的細胞達到93.2±6.8％；當黃嘌呤氧化酶濃度為10mU時，大約有50％(準確說是54.6±6.1％)的細胞出現(xiàn)凋亡。
缺乏黃嘌呤氧化酶時，細胞出現(xiàn)以下細胞大小/表面組成(FSC/SSC)的分布形式細胞大小是349±27(任意均道數(shù))，表面組成是112±15。當黃嘌呤氧化酶濃度是80mU時，細胞變小到256±22，而表面組成則增加至180±29。這種基于細胞形態(tài)學的改變表明了一種特征性的細胞凋亡。當黃嘌呤氧化酶濃度是10mU時，細胞出現(xiàn)的分布形式則介于上述提到的2個極端數(shù)值之間。除非特別地指出，一般使用黃嘌呤氧化酶的濃度是10mU。
氟吡氨酯對人淋巴細胞自發(fā)凋亡率的影響檢查健康人和HIV-1感染患者的外周血中單核細胞的的自發(fā)凋亡。采集血樣一天后進行細胞分析。正如圖2所示，此時對照組非感染者的單核細胞有6.32±0.82％出現(xiàn)凋亡，而HIV-1感染患者的細胞則有28.42±7.84％出現(xiàn)凋亡。兩組的單核細胞均用0.1-30μg/ml濃度的氟吡氨酯處理了24小時。如圖2的總結(jié)，對健康人和HIV-1感染患者來說，氟吡氨酯并不能明顯改變淋巴細胞自發(fā)凋亡率(p＞0.1)。
氟吡氨酯減少單核細胞的誘導(dǎo)凋亡用次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)(形成氧基)處理健康人和HIV-1感染患者的單核細胞來誘導(dǎo)細胞的凋亡。在誘導(dǎo)之前6小時，把不同濃度的氟吡氨酯加入細胞培養(yǎng)基中。正如圖3所示，0.1-3.0μg/ml濃度的氟吡氨酯明顯減少了細胞的凋亡(p＜0.001)。氟吡氨酯濃度為10μg/ml時，僅僅對HIV-1患者的淋巴細胞有明顯的保護作用。氟吡氨酯濃度為0.3-3.0μg/ml時，藥物的保護作用最顯著，對細胞誘導(dǎo)凋亡的抑制作用也最強。本實驗中，對健康人的淋巴細胞大約減少了40％誘導(dǎo)的凋亡，而對HIV-1感染患者則減少了大約60％。
應(yīng)用DNA-斷裂法也可以檢測到淋巴細胞的凋亡。細胞與黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(HX/XOD)系統(tǒng)孵育后，提取細胞中的DNA，根據(jù)分子大小在瓊脂糖凝膠中分離并進一步轉(zhuǎn)移到印跡上。
DNA斷裂為180及其成倍堿基對的梯形片斷模式，這種片斷模式是細胞凋亡過程中DNA遭到破壞的典型結(jié)構(gòu)(Wyllie，1980年)。相反，用1μg/ml氟吡氨酯處理過的細胞未出現(xiàn)任何DNA片斷。
同樣得到了代表性的斑點印跡，表明了氟吡氨酯對進行自發(fā)凋亡和誘導(dǎo)凋亡的細胞的作用效果。
為了完成這一系列的實驗，要使用次黃嘌呤/20mU黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)誘導(dǎo)單核細胞凋亡。在沒有經(jīng)過氟吡氨酯處理時，有64.2±7.9％的細胞出現(xiàn)凋亡。然而，當細胞用氟吡氨酯處理24小時以后，凋亡細胞的比率明顯下降至18.3±5.8％。
這些結(jié)果清楚地表明氟吡氨酯是一種很有希望地可用于治療艾滋病患者淋巴細胞誘導(dǎo)凋亡的藥物。
DE-A-43 27 516闡明了氟吡氨酯的神經(jīng)保護作用，例如在腦缺血、早老性癡呆、帕金森氏病和由于感染如AIDS腦病或Creutzfeld-Jakob綜合征導(dǎo)致的神經(jīng)變性疾病中的作用。
伴有進行性癡呆的AIDS腦病是艾滋病的一種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。認為AIDS腦病的發(fā)病原因之一是HIV(gp-120)誘導(dǎo)NMDR激動性神經(jīng)毒素如喹啉酸從感染的巨噬細胞中釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞壞死。
AIDS腦病和艾滋病本身(獲得性免疫缺陷綜合征)可以累及不同的器官系統(tǒng)。前者已如上所述，是艾滋病的一種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(神經(jīng)細胞的凋亡)，后者則是基于細胞免疫功能紊亂而出現(xiàn)了T細胞數(shù)目的明顯減少(造血細胞系統(tǒng)中一種細胞成分的凋亡)。
本發(fā)明的氟吡氨酯的作用，即抑制造血細胞系統(tǒng)如淋巴細胞的誘導(dǎo)凋亡的最引人驚異之處在于，迄今為止尚未報告存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的NMDA受體。因此，即使是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也不可能由氟吡氨酯對神經(jīng)細胞的保護作用，而預(yù)知到它對造血細胞系統(tǒng)的細胞也有保護作用。
根據(jù)本發(fā)明中氟吡氨酯的作用，它還可以預(yù)防或治療其它疾病，例如-藥物(如細胞生長抑制劑和可的松類)、毒物、射線或其它疾病導(dǎo)致的中性粒細胞減少癥/淋巴細胞減少癥，-藥物或感染(如HIV感染)導(dǎo)致的血小板減小癥。
氟吡氨酯用于預(yù)防和治療給藥可以采取已知的下面一些劑型片劑、膜衣片劑、硬膠囊、軟膠囊、丸劑、顆粒劑、糖衣片劑、栓劑、微膠囊、水質(zhì)或油質(zhì)懸液、油質(zhì)溶液、肌肉注射液和靜脈內(nèi)注射液。
用于制備藥物的適用鹽是所有可與氟吡氨酯生理匹配的鹽類，例如氟吡氨酯的鹽酸鹽、馬來酸鹽、硫酸鹽和葡萄糖酸鹽。
本發(fā)明的藥品中氟吡氨酯的含量是0.1mg-3000mg，最好是10mg-500mg。所述藥物的單一劑量可分每日1-5次給藥，最好1-3次。
指定的給藥劑量都是指氟吡氨酯的量，如果使用的是氟吡氨酯的鹽類化合物，則必須考慮到分子量的轉(zhuǎn)換。
根據(jù)本發(fā)明的化合物可以通過常規(guī)的制藥標準方法制備，例如，氟吡氨酯與賦形劑和/或輔助劑一般在20℃-80℃，最好是20℃-50℃溫度下通過攪拌或均質(zhì)化完全地混合。


圖1將非感染的〔○表示〕和HIV-1感染的CM細胞〔●表示〕與不同濃度的氟吡氨酯孵育。給出的是10次平行試驗得到的平均值，標準差不超過10％。
圖2氟吡氨酯對未感染者〔空白條形圖表示〕與HIV-1感染患者〔斜線條形圖表示〕的淋巴細胞自發(fā)凋亡的影響。采集血樣1天后，通過連續(xù)流式細胞儀做細胞分析。檢查的淋巴細胞來自12個HIV-1感染患者和8個未感染者。平均值和標準差已標明。
圖3
用氟吡氨酯處理后的淋巴細胞減少了誘導(dǎo)凋亡。通過次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)誘導(dǎo)未感染者〔空白條形圖表示〕和HIV-1感染患者〔斜線條形圖表示〕的單核細胞凋亡，在加入這一氧基產(chǎn)生系統(tǒng)前6小時把氟吡氨酯加至細胞中，1天后通過連續(xù)流式細胞儀分析細胞。先確定總的凋亡細胞比率，從中減去的是自發(fā)凋亡的細胞比率。因此圖中所示的數(shù)值表明了誘導(dǎo)凋亡的程度。檢查的淋巴細胞來自12個HIV-1感染的患者和8個未感染者，平均值和標準差已標明。
權(quán)利要求
1.活性化合物氟吡氨酯或其藥學上適用的鹽在制備一種治療與造血細胞系統(tǒng)損傷有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的活性化合物氟吡氨酯或其藥學上適用鹽的應(yīng)用，所述藥物用于治療HIV-1感染患者/艾滋病患者。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于氟吡氨酯或其鹽與藥學上適宜的賦形劑和/或輔助物結(jié)合形成一種合適的給藥形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及氟吡氨酯或它的鹽作為藥物在預(yù)防和治療與造血細胞系統(tǒng)如淋巴細胞損傷有關(guān)的疾病中的應(yīng)用。特別重要的是治療HIV感染患者/艾滋病患者。
文檔編號A61K31/44GK1201391SQ96198131
公開日1998年12月9日 申請日期1996年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月7日
發(fā)明者G·伯甘德, W·E·G·米勒 申請人:Asta藥物股份公司