專利名稱：：血小板特異性的嵌合性免疫球蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)城在凝血塊的形成過程中，血小板的凝聚起著主導(dǎo)作用，在正常的情況下，凝血塊是為了防止血細(xì)胞從血管中漏出。但是，在某些病狀下，凝血塊會(huì)限制或者完全地阻止血液的流通，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。例如，在動(dòng)脈粥樣化的位點(diǎn)發(fā)生的血小板凝聚及其隨后形成的血栓是形成眾多疾病，例如，心膠痛、急性心肌梗塞以及在成功地進(jìn)行了凝血溶解和血管成形后的再次阻塞的重要原因。急性心臟病患者一般都接受溶血制劑，例如組織血纖維蛋白溶酶原激活因子和鏈激酶的治療，這些制劑將溶解凝血中的血纖維蛋白。與血纖維蛋白作用相伴隨的主要的并發(fā)癥是血小板凝聚所引發(fā)的再次閉塞，它還能夠造成心臟的進(jìn)一步受損。由于糖蛋白(GP)IIb/IIIa受體是已知的引起血小板凝聚的主要因素，那么，封閉這些受體的制劑就被認(rèn)為是能夠減少甚至完全防止在凝血溶解治療后的再次閉塞并從而提高溶血的速率。這些制劑還被認(rèn)為是可以用在其它的血管閉塞性和血栓栓塞的疾病中。封閉血小板凝聚的一種方法是使用對(duì)GPIIb/IIIa受體為特異性的單克隆抗體。在歐洲專利申請(qǐng)第205,207和206,532號(hào)中，揭示了鼠單克隆抗體，命名為7E3，該抗體抑制血小板的凝聚并表現(xiàn)為可用于治療人的血栓疾病。已知的是鼠單克隆抗體具有的某些特性能夠嚴(yán)重地限制它們?cè)谌梭w治療中的應(yīng)用。作為外源性蛋白，鼠抗體能夠刺激那些降低或者損害其治療效率和/或在患者身上引起變應(yīng)性和過敏性反應(yīng)的免疫反應(yīng)。在血栓栓塞疾病中，需要重復(fù)使用這些治療制劑，因而就會(huì)提高這類免疫反應(yīng)的發(fā)生率。包括非人體來源的結(jié)合區(qū)與人體來源的恒定區(qū)的嵌合性抗體已被提出并被認(rèn)為是消除鼠抗體的這些免疫反應(yīng)的一種措施，見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(81)6851(1984)和PCT申請(qǐng)NO.PCT/GB8500392。由于恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)抗體分子的免疫反應(yīng)性，那么帶有人體來源的恒定區(qū)的嵌合性抗體就被推測為很少引起人體的抗鼠反應(yīng)。然而，無法預(yù)測的是把人體來源的恒定區(qū)與具有所需要的特異性的鼠結(jié)合區(qū)相結(jié)合是否一定能夠使所得到的嵌合性抗體的免疫反應(yīng)被降低和/或改善其結(jié)合能力(例如，免疫致病性的程度和/發(fā)生次數(shù))。與本發(fā)明相關(guān)的
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包括有非人體來源可變區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)與人體來源恒定區(qū)的血小板特異性嵌合免疫球蛋白。這種嵌合免疫球蛋白可以是對(duì)GPIIb/IIIa受體或其它血小板成分為特異性的。這些抗體可與血小板結(jié)合并且防止血小板凝聚，從而用作抗血栓劑使用在防止或降低在各種臨床情況下(例如，溶解血栓治療之后以及伴隨著血管成形術(shù))發(fā)生的血管閉塞及復(fù)發(fā)性閉塞和在防止血管狹窄及重復(fù)性狹窄之中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體相結(jié)合的試劑被用于減少和防止堵塞、復(fù)發(fā)性堵塞(例如，急性堵塞)、狹窄和/或重復(fù)性狹窄。本發(fā)明的抗血小板抗體還可以用于造影。附圖的簡要說明圖1是使用克隆化的可變區(qū)作為探針對(duì)7E3單克隆抗體的mRNA的重鏈和輕鏈的Northern分析。圖2A和2B是質(zhì)粒β7E3VKhCK(圖2A)和p7E3VHhCG4(圖2B)，它們各自帶有對(duì)嵌合性7E3免疫球蛋白的輕鏈和重鏈進(jìn)行編碼的嵌合性基因結(jié)構(gòu)。圖3是由載體p7E3VKhCK和p7E3VHhCG4編碼的嵌合性7E3免疫球蛋白與血小板的結(jié)合。圖4是嵌合性7E3(c7E3)免疫球蛋白對(duì)血小板凝聚的抑制。圖5是說明血漿抗體濃度(ng/Ml)對(duì)時(shí)間(天數(shù))的點(diǎn)陣圖解，表明在三位長期冠心病患者接受5分鐘靜脈滲透0.20-mg/kg劑量的c7E3Fab后，c7E3Fab(γ1，κ)的迅速從血漿中消失的速度。圖6A-6C是在使用了抗體(γ1，κ)兩小時(shí)后一次施給嵌合性7E3Fab(0.15mg/kg，0.20mg/kg或0.25mg/kg)濃縮藥丸對(duì)血小板活性的效果的總結(jié)。當(dāng)對(duì)受體封閉(圖6A)，血小板凝聚(圖6B)，和失血時(shí)間(圖6C)進(jìn)行分析后，這些劑量對(duì)血小板活性的作用得到證實(shí)，其中的線條是平均值。圖7A-7C表明在進(jìn)行血管成形術(shù)之前以0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥c7E3Fab(γ1，κ)的抗血小板效果的作用時(shí)間。其中的線條表明的是在基線上時(shí)間為0至第24小時(shí)的受體封閉(圖7A)，血小板凝聚(圖7B)，和失血時(shí)間(圖7C)的平均值。圖8A-8C總結(jié)的是在11位患者中按0.25mg/kg濃縮藥丸劑量給藥，然后再進(jìn)行12小時(shí)c7E3Fab(γ1，κ)的連續(xù)滲透(10μg/分)的抗血小板活性。其中的線條表明的是受體封閉百分度(圖8A)，給藥前的血小板凝聚百分度(基線上的零點(diǎn))(圖8B)，和失血時(shí)間(圖8C)的平均值。圖9是在實(shí)施例4中對(duì)47位患者進(jìn)行滲透后的從基點(diǎn)到24小時(shí)的血細(xì)胞比容的絕對(duì)變化值。圖10是表明對(duì)三組接受治療的人員進(jìn)行隨機(jī)處理后，不需要進(jìn)行緊急重復(fù)經(jīng)皮血管治療的概率的Kaplan-Meier點(diǎn)陣圖。圖11是對(duì)接受治療的人員中的關(guān)鍵組(圖中右側(cè))的優(yōu)勢比例和95％的置信區(qū)間的圖示。其中的數(shù)據(jù)表示主要效率終點(diǎn)[死亡，非致命性梗塞，緊急血管成形或手術(shù)，對(duì)不應(yīng)性局部缺血放置冠狀動(dòng)脈內(nèi)斯坦特(stent)或主動(dòng)脈內(nèi)的氣囊泵]。此外，對(duì)每一亞組的主要終點(diǎn)的絕對(duì)事件比率在左側(cè)例表給出[事件比率(％)]。圖12給出的是所有患者中在6個(gè)月追蹤期不發(fā)生事件的分?jǐn)?shù)。圖13表示的是在那些接受了成功的治療之后30天沒有發(fā)生事件的患者之中的在隨后6個(gè)月追蹤期內(nèi)不發(fā)生事件的患者的分?jǐn)?shù)。圖14表示的是在接受了成功的初期治療后48小時(shí)沒有發(fā)生事件的患者在隨后6個(gè)月追蹤期內(nèi)不發(fā)生事件的患者的分?jǐn)?shù)。圖15表明的是在所有的患者中在隨后6個(gè)月追蹤期內(nèi)不需對(duì)與治療有關(guān)的動(dòng)脈(PRA，治療有關(guān)的動(dòng)脈)進(jìn)行血管再造的患者的分?jǐn)?shù)。圖16表明的是125I-c7E3Fab與未刺激的HUVEC的結(jié)合飽和度。該飽和數(shù)據(jù)被用于產(chǎn)生在圖17A-17E中的點(diǎn)陣圖(Scatchardplots)。圖17A-17E顯示了對(duì)125I-c7E3Fab與未刺激的HUVEC的結(jié)合飽和度的點(diǎn)陣圖(Scatchardplots)(圖17A)；HUVEC被用50單位/ml的TNFα刺激24小時(shí)(圖17C)；在不含血清的培養(yǎng)基中的未被刺激的HUVEC(圖17D)；未被刺激的HUVEC在有0.02％疊氮化物存在來防止抗體的加冒和內(nèi)化(圖17E)。HUVEC用提高濃度的125I-c7E3Fab培養(yǎng)，存在有或不存在100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性結(jié)合。結(jié)合的125I-c7E3Fab為橫坐標(biāo)，被游離抗體除過的結(jié)合數(shù)量為縱坐標(biāo)。曲線的線性回歸得到的公式在圖中給出。直線(-)的斜率被定為Ka值。與Y軸的交叉是BMAX或最大抗體結(jié)合量。每一個(gè)圖中的數(shù)據(jù)點(diǎn)都是三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖18顯示125I-LM609與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的點(diǎn)陣圖(Scatchardanalysis)HUVEC用提高了濃度的玻連蛋白受體-特異性抗體125I-LM609培養(yǎng)，存在有或不存在有100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性的結(jié)合。結(jié)合的125I-LM609為橫坐標(biāo)，被游離抗體除過的結(jié)合數(shù)量為縱坐標(biāo)。曲線的線性回歸得到了公式Y(jié)＝1.0831e+10-1.2188e+9xR2＝0.888。直線(-)的斜率被定為K值。與Y軸的交叉是BMAX或最大抗體結(jié)合量。每一個(gè)圖中的數(shù)據(jù)點(diǎn)都是三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖19顯示了抗體與125I-c7E3Fab對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的競爭性結(jié)合。HUVEC用1μg/ml125I-c7E3培養(yǎng)，存在有提高了濃度的未標(biāo)記的競爭物?？?CD51是單克隆抗體，識(shí)別玻連蛋白受體的α-鏈；抗-IIIa是與GPIIIa反應(yīng)的單克隆抗體；玻連蛋白是從人血漿中分離出來的天然蛋白質(zhì)；c7E3Fab是嵌合性7E3Fab片段；m7E3IgG是鼠7E3IgG；抗-7E3是兔的可變區(qū)特異性抗-7E3抗體；LM609是單克隆抗體，結(jié)合復(fù)合體αVβ3(玻連蛋白受體)，但是，不結(jié)合GPIIb/IIIa；10E5是單克隆抗體，與GPIIb/IIIa反應(yīng)，但是，不識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞GPIIb/IIIa；嵌合性MT412是抗-CD4抗體，作為同模相符的嵌合性Fab片段的對(duì)照。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖20A-20B的柱形圖顯示在用c7E3Fab處理之后，在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘性蛋白質(zhì)的表達(dá)。用c7E3Fab處理過4小時(shí)后的在HUVEC上的E-選擇蛋白表達(dá)，以及用c7E3Fab處理過24小時(shí)后的在HUVEC上的ICAM-1的表達(dá)，都用125I-抗-E-選擇蛋白結(jié)合(圖20A)或125I-抗-ICAM-結(jié)合(圖20B)監(jiān)測。HUVEC被用指定的濃度的7E3Fab或嵌合性MT412Fab(一種抗-CD4的，同模相符的陰性對(duì)照抗體)抗體處理4小時(shí)或24小時(shí)。TNFα被用來作為陽性對(duì)照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1表達(dá)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值+SEM。圖21A-21B的柱形圖顯示PMN與用c7E3Fab處理后的內(nèi)皮細(xì)胞的黏結(jié)。HUVEC被用100μg/ml嵌合性7E3Fab或100μg/ml嵌合性MT412Fab抗體處理了4小時(shí)(圖21A)或24小時(shí)(圖21B)。TNFα被用作陽性對(duì)照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1表達(dá)，以及它們對(duì)PMN的黏結(jié)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白包括單個(gè)的免疫球蛋白嵌合重鏈和嵌合輕鏈。嵌合重鏈包括從非人體來源的抗原結(jié)合區(qū)(從對(duì)血小板為特異性的非人抗體的重鏈衍生的，例如，從對(duì)GPIIb/IIIa受體為特異性的抗體衍生的)與人體來源的重鏈恒定區(qū)結(jié)合在一起。嵌合性輕鏈包括非人抗原結(jié)合區(qū)(例如，從非人體來源的抗體的輕鏈衍生的抗原結(jié)合區(qū))與人體來源的輕鏈恒定區(qū)結(jié)合在一起。本發(fā)明的免疫球蛋白可以是單價(jià)的，雙價(jià)的或多價(jià)的。單價(jià)的免疫球蛋白是二聚體(HL)，由嵌合重鏈通過二硫鍵與嵌合輕鏈相結(jié)合在一起而形成的。二價(jià)的免疫球蛋白是四聚體(H2L2)，由兩個(gè)二聚體通過至少一個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起而形成。多價(jià)的免疫球蛋白也可以被制造出來，例如，使用可聚合的重鏈恒定區(qū)(例如，μ重鏈恒定區(qū))。嵌合免疫球蛋白片段，例如Fab、Fab’、和F(ab’)2也可被制造出來。嵌合免疫球蛋白的非人體來源的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)血小板為特異性的免疫球蛋白中產(chǎn)生。優(yōu)選的免疫球蛋白是對(duì)血小板GPIIb/IIIa受體為特異性，并且能夠阻止配體結(jié)合到糖蛋白的IIb/IIIa受體的復(fù)合體上。當(dāng)血小板粘結(jié)在血管壁受到損傷的位置時(shí)就開始產(chǎn)生血栓。血小板的粘結(jié)是受血小板表面受體調(diào)控的，這些受體與暴露出來的內(nèi)皮下組織的細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白相結(jié)合，例如vonWillebrand因子，膠原，纖維連結(jié)素，玻連蛋白和昆布胺酸。血小板的粘結(jié)導(dǎo)致單層的血小板排列。隨后血小板的激活是在對(duì)激活劑，例如腎上腺素，ADP，膠原或凝血酶等發(fā)生反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生。激活導(dǎo)致血小板表面的糖蛋白IIb/IIIa受體(GPIIb/IIIa)被暴露出來。在被激活的血小板上的GPIIb/IIIa就可與纖維蛋白原相結(jié)合，并且調(diào)控血小板的凝聚。GPIIb/IIIa與其它粘結(jié)性蛋白的結(jié)合，例如vonWillebrand因子的結(jié)合還可以導(dǎo)致血小板的交聯(lián)和凝聚。因此，粘結(jié)性分子例如纖維蛋白原和vonWillebrand因子與GPIIb/IIIa的結(jié)合就造成血小板的凝聚，并且是血栓形成中的一個(gè)共同步驟，這樣就使得GPIIb/IIIa受體成為治療劑的具有吸引力的靶標(biāo)，這些治療劑可以干擾GPIIb/IIIa與這些分子的相互作用。此外，使用抗GPIIb/IIIa嵌合抗體可以在不干擾血小板的初始粘接的條件下抑制被激活的血小板的凝聚。這種對(duì)血小板凝聚的選擇性的抑制可能正是人們所期望的，因?yàn)樵诓话l(fā)生凝聚的條件下血小板的粘結(jié)可以對(duì)止血有利。適宜的對(duì)血小板為特異的抗體包括7E3和10E5。參見歐洲專利申請(qǐng)205,207號(hào)，206,532號(hào)，和206,533號(hào)，其中的教導(dǎo)通過引述在此結(jié)合于本文。最優(yōu)選的是的7E3抗體(或者是與相同的或功能上等同的對(duì)象產(chǎn)生反應(yīng)的抗體)，因?yàn)樗菍?duì)復(fù)合形式的GPIIb/IIIa受體為特異性的。其它的對(duì)GPIIb/IIIa受體(被7E3識(shí)別的抗原)為特異的抗體，例如那些對(duì)IIb/IIIa成分為特異性的抗體也可被使用。還可以使用對(duì)其它血小板抗原為特異性的抗體。例如與血小板α粒膜蛋白GMP-140起反應(yīng)的抗體，例如S12抗體(J.Biol.Chem.，2599799-9804(1984)；美國專利No.4,783,330)也可被使用。嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)可以從非人體來源的免疫球蛋白中衍生。優(yōu)選的抗原結(jié)合區(qū)來源于鼠，因?yàn)槭罂寡“?，特別是GPIIb/IIIa受體的抗體可以從鼠中產(chǎn)生并且是可獲得的。其它的動(dòng)物和嚙齒類提供了抗原結(jié)合區(qū)的另外來源(參見Newmanetal..Bio/technology，101455-1460(1992))。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)包括非人體來源的對(duì)血小板為特異性的免疫球蛋白的、足夠?qū)乖Y(jié)合區(qū)為特異性或選擇性的至少一部分，例如從非人體來源的免疫球蛋白產(chǎn)生的一種或多種輔助性確認(rèn)區(qū)(參見Winter，美國專利No.5,225,539，歐洲專利No.0,239,400，英國專利No.2,188,638；Adairetal.，WO91/09967；Jolliffeetal.，WO91/09966)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合免疫球蛋白包括至少一條由非人體來源的免疫球蛋白的重鏈的可變區(qū)與人體來源的重鏈的恒定區(qū)的至少一部分相連接的嵌合重鏈和一條從非人體免疫球蛋白的輕鏈產(chǎn)生的可變區(qū)與人體來源的輕鏈的恒定區(qū)的至少一部分共價(jià)連接的嵌合輕鏈。其它的可變區(qū)與恒定區(qū)的組合方式也是可能的(參見美國專利第5,169,939號(hào))。嵌合抗體的恒定區(qū)是從人免疫球蛋白中產(chǎn)生的。重鏈恒定區(qū)可以從五種同型物α，δ，ε，γ，μ中選擇。進(jìn)而言之，不同亞組的重鏈(例如IgG亞組重鏈)對(duì)不同的功能因子負(fù)責(zé)，因此，選擇所需的重鏈恒定區(qū)就可以產(chǎn)生具有所需功能因子的嵌合抗體。優(yōu)選的恒定區(qū)是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)，和γ4(IgG4)。輕鏈恒定區(qū)可以是κ和λ型?？偠灾?，在制備嵌合抗體時(shí)對(duì)嵌合免疫球蛋白的每一輕鏈和重鏈成分都制造一個(gè)融合基因，該基因包括對(duì)非人體來源的血小板特異性可變區(qū)的功能部分的至少一部分(如將可變區(qū)與相鄰段進(jìn)行功能性重新安排)進(jìn)行編碼的第一DNA片段與對(duì)人體來源的恒定區(qū)的至少一部分進(jìn)行編碼的第二DNA片段連接。每一個(gè)融合基因都是在表達(dá)載體中組建或插入到其中，產(chǎn)生含有處于可表達(dá)形式的融合基因的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有抗原結(jié)合區(qū)的DNA是通過間隔序列與恒定區(qū)共價(jià)結(jié)合在一起。在另一實(shí)施方案中，可以制造出缺少一個(gè)或多個(gè)間隔序列的結(jié)構(gòu)。能夠表達(dá)這些基因產(chǎn)物的受體細(xì)胞就被用這些基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。被轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞在允許對(duì)所插入的基因進(jìn)行表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后回收表達(dá)出來的免疫球蛋白和免疫球蛋白鏈。對(duì)Ig輕鏈和重鏈的可變區(qū)進(jìn)行編碼的基因可以從產(chǎn)生血小板特異性抗體的淋巴細(xì)胞中獲取。例如，那些產(chǎn)生抗GPIIb/IIIa抗體的雜交瘤細(xì)胞系是本發(fā)明嵌合抗體的免疫球蛋白可變區(qū)的一種來源。其它的嚙齒類細(xì)胞系也是可選用的。用人血小板或包含GPIIb/IIIa受體成分或血小板片段對(duì)嚙齒類進(jìn)行攻擊，在產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系之間形成融合雜交細(xì)胞，將所得雜交細(xì)胞克隆化，選擇那些產(chǎn)生抗血小板或GPIIb/IIIa受體的抗體的克隆，從而產(chǎn)生所需的細(xì)胞系。用常規(guī)的克隆技術(shù)可以從人的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中得到恒定區(qū)。另外，由于代表兩類輕鏈和五類重鏈的基因已經(jīng)被克隆化了，所以人體來源的恒定區(qū)可以從這些克隆中得到。嵌合抗體結(jié)合片段例如F(ab’)2和Fab片段可以通過將嵌合重鏈基因制成被剪切的形式而制取。例如，對(duì)F(ab’)2重鏈部分進(jìn)行編碼的嵌合基因包括對(duì)重鏈的關(guān)節(jié)區(qū)和CH1部分進(jìn)行編碼的DNA序列。這些片段可以通過對(duì)嵌合免疫球蛋白進(jìn)行酶切來得到。例如，使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶切可以分別得到Fab和F(ab’)2片段。優(yōu)選地，對(duì)嵌合輕鏈和重鏈(或它們的一部分)進(jìn)行編碼的融合基因可以裝配于兩種不同的并可對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體之中。每一個(gè)載體都包含兩個(gè)可選擇的基因，一個(gè)基因用于在細(xì)菌系統(tǒng)中進(jìn)行選擇，另一個(gè)用于在真核細(xì)胞體系中進(jìn)行選擇，每一個(gè)載體含有不同的一對(duì)基因。這些載體可以使融合基因在細(xì)菌系統(tǒng)中生產(chǎn)和放大，然后在真核細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染并選擇被共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用于細(xì)菌體系的可選擇的基因包括例如那些具有氨芐青霉素抗性的和那些具氯霉素抗性的基因。在對(duì)真核轉(zhuǎn)染物進(jìn)行選擇的兩種選擇性基因優(yōu)選(i)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)，和(ii)從Tn5來的磷酸轉(zhuǎn)移酶(定名為neo)。選擇gpt依據(jù)的是這個(gè)基因所編碼的酶將黃嘌呤作為底物合成出嘌呤核苷酸的能力；其它的內(nèi)生性酶的類似物是無法完成這一任務(wù)的。在含有黃嘌呤霉酚酸的培養(yǎng)基中，因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基可以阻止次黃苷單磷酸鹽轉(zhuǎn)變成黃嘌呤單磷酸鹽，所以，只有表達(dá)gpt的基因可以在其中存活下來。neo基因的產(chǎn)物封閉由抗生素G418和其同類的抗生素所造成的對(duì)在真核細(xì)胞中的蛋白合成的抑制。這兩種選擇程序可以同時(shí)使用或者順序使用，以對(duì)插入到真核細(xì)胞中的兩個(gè)不同的DNA載體上的免疫球蛋白鏈基因的表達(dá)進(jìn)行選擇。優(yōu)選的受體細(xì)胞系是骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞可以對(duì)轉(zhuǎn)染的Ig基因所編碼的免疫球蛋白進(jìn)行合成，組建和分泌。此外，它們還具有對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行糖化的機(jī)制。特別優(yōu)選的受體細(xì)胞是一種不產(chǎn)生Ig的骨髓瘤細(xì)胞系，例如，SP2/0。這些細(xì)胞系僅僅產(chǎn)生由轉(zhuǎn)染的免疫球蛋白基因所編碼的免疫球蛋白。骨髓瘤細(xì)胞可以在培養(yǎng)基中或者在小鼠的腹膜中生長，并分泌免疫球蛋白，然后從腹水中獲取這些免疫球蛋白。其它的淋巴細(xì)胞例如B淋巴細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞也可作為適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞?，F(xiàn)在已有幾種用含有免疫球蛋白編碼基因的載體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的方法。一種優(yōu)選的將DNA引入到淋巴中的方法是電穿孔法(electroporation)。在這一方法中，在有要被引入的DNA存在的條件下對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行電脈沖刺激。參見Potteretal..Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161(1984)。另一種引入DNA的方法是原生質(zhì)體融合。在這一方法中對(duì)含有包含嵌合Ig基因的重組質(zhì)粒的細(xì)菌的細(xì)胞壁用溶菌酶進(jìn)行處理。所得到的原生質(zhì)球與骨髓瘤細(xì)胞用乙二醇進(jìn)行融合。原生質(zhì)融合完成后，對(duì)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行選擇和分離。另外的一種可以將DNA引入到眾多細(xì)胞的方法是磷酸鈣沉淀法。嵌合免疫球蛋白基因還可以在非淋巴細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，例如在細(xì)菌或酵母菌中。當(dāng)在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，免疫球蛋白重鏈和輕鏈就變?yōu)閮?nèi)含體的一部分。因此，這些鏈就必須被分離和提純，然后組建到功能性免疫球蛋白分子中。其它的在大腸桿菌E.coli中進(jìn)行表達(dá)的方法是已知的(參見Pluckthun，A.，Bio/Technology，9545-551(1991)；Skerra，A.etal.，Bio/Technology，9273-278(1991))，包括從E.coli分泌含有信號(hào)序列的融合蛋白。血小板特異性嵌合免疫球蛋白的用途本發(fā)明的嵌合血小板特異性抗體可用作抗血栓治療制劑。例如，嵌合抗體(或其片段)可用于患有血栓或具有發(fā)生血栓危險(xiǎn)的患者以抑制血小板的凝集和血栓的發(fā)生。這些抗體還可以用于抑制由血小板凝集引起的血流異常(例如，血液循環(huán)異常)及其進(jìn)而造成的血栓或血栓的復(fù)發(fā)情況。這些抗體可以用于防止血栓形成或復(fù)發(fā)性血栓(復(fù)發(fā)性閉塞)的各種情況。此外，這些抗體還可用于抑制狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄(減低，延遲或預(yù)防)的各種情況。例如，患有或可能患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者可以通過使用有效劑量的本發(fā)明的嵌合抗血小板抗體或抗體片段(例如，嵌合抗GPIIb/IIIa抗體或優(yōu)選其片段，例如，嵌合7E3Fab或F(ab’)2)來抑制血管的閉塞，復(fù)發(fā)性閉塞，狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。例如，本發(fā)明的抗體可以使用于個(gè)體(例如，哺乳動(dòng)物，例如人)以防止肺部血栓，瞬時(shí)性失血(TIA)，深度靜脈血栓，冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)，插入人造瓣膜和血管(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)或安置血管(冠狀或外周)斯坦特。本發(fā)明的抗體還可以用于患者在進(jìn)行冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(例如，血管成型術(shù)、安置斯坦特、安放斯坦特的血管成型術(shù)、血管移植)或其它的血管介入術(shù)[例如安置外周血管斯坦特，放置人造瓣膜或容器(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)]。例如，抗體可以在對(duì)個(gè)體進(jìn)行氣囊，冠狀動(dòng)脈癍塊切除(atherectomy)，和激光血管成形術(shù)(angioplasty)及其它適當(dāng)?shù)难艹尚涡g(shù)之前，之中或之后來防止血小板凝集或血栓?？贵w可在進(jìn)行血管成形術(shù)之前，之中和/或之后使用。這類處理方式可以防止血栓的形成，進(jìn)而降低在血管成形術(shù)之后的并發(fā)癥的出現(xiàn)，例如，死亡、心肌梗塞，進(jìn)行導(dǎo)致PTCA時(shí)的局部缺血事件或冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)(急性局部缺血事件)。此外，這種治療可以獲得長期的效果，減少冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)(例如，血管成形術(shù)、安置斯坦特、安置斯坦特的血管成型術(shù))的局部缺血事件和并發(fā)癥的發(fā)生，例如，死亡、心肌梗塞，導(dǎo)致進(jìn)行PTCA時(shí)的局部缺血事件或冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)(血管再造)，指示性降低，延遲或防止狹窄或復(fù)發(fā)狹窄。另外，在進(jìn)行各種手術(shù)之前、之中和/或之后使用本發(fā)明的抗體，還可以長期降低或防止由于其它的血管介入術(shù)[例如，安置外周血管斯坦特、插入人造瓣膜或容器(例如，在自體性、非自體性、或合成性血管植入中)]造成的局部缺血或綜合癥的發(fā)生。例如在實(shí)施例4中所示，當(dāng)在進(jìn)行血管成形手術(shù)[經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)]之前將嵌合抗血小板抗體(嵌合7E3Fab片段)作為輔助治療劑使用時(shí)，就可以提高失血時(shí)間，并且降低拮抗劑引導(dǎo)的血小板凝聚，正如用體外血小板凝聚檢測方法所測的結(jié)果所示。在實(shí)施例4和5中的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還表明對(duì)血小板GPIIb/IIIa的封閉和用c7E3抗體(Fab片段)對(duì)血小板凝聚的抑制可以在人的體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗血栓效果。在實(shí)施6和7中給出的結(jié)果是使用嵌合7E3抗體片段的隨機(jī)的雙盲性對(duì)照研究結(jié)果。在實(shí)施例6中給出的數(shù)據(jù)揭示了對(duì)進(jìn)行血管成形手術(shù)和有發(fā)生血管堵塞(復(fù)發(fā)性閉塞)高度危險(xiǎn)的患者給以嵌合7E3抗體片段，可以有效地防止急性堵塞，同時(shí)降低了急性局部缺血的發(fā)生。正如在實(shí)施例7中進(jìn)一步所表明的，對(duì)這類患者采用相同的處理可以降低、延遲、和/或防止以后的復(fù)發(fā)性血管狹窄。這種使用嵌合抗GPIIb/IIIa抗體片段(見實(shí)施例7)所產(chǎn)生的對(duì)非急性局部缺血并發(fā)癥的長期有利效果是沒有先例的。此外，那些能夠選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的化合物和試劑可以用來防止或者降低狹窄或重復(fù)性狹窄的發(fā)生，同時(shí)能夠帶來有效的在臨床上降低非急性局部缺血并發(fā)癥的發(fā)生率。當(dāng)使用這些化合物時(shí)，還可以另外地防止閉塞或者重復(fù)性閉塞。這些化合物包括，例如GPIIb/IIIa拮抗藥，免疫球蛋白或非免疫球蛋白的肽或蛋白質(zhì)(例如合成性的或者重組的)及它們的類似物，核苷酸或核苷酸類似物。當(dāng)患有或有可能患冠狀動(dòng)脈疾病的患者接受有效劑量的這些選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的化合物時(shí)，就可以抑制血管的閉塞，復(fù)發(fā)性閉塞，狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。在一個(gè)實(shí)施方案中，血管的狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄都可以通過給予有效治療劑量或預(yù)防劑量的一種能夠同GPIIb/IIIa或被指定為αvβ3的玻連蛋白受體相結(jié)合的化合物或制劑[例如，GPIIb/IIIa拮抗物、免疫球蛋白、非免疫球蛋白的肽或蛋白質(zhì)(例如，合成性的或重組性的)、它們的類似物、核酸或核酸類似物]來得到抑制。血小板糖蛋白GPIIb/IIIa(還被稱為CD41/CD61)屬于整合蛋白受體，這類物質(zhì)擁有共同的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特征。與GPIIb/IIIa非常接近的一個(gè)整合蛋白是玻連蛋白受體(αvβ3，也被稱為CD51/CD61)，它使用與GPIIb/IIIa同樣的β亞單位(即β3)，但是具有不同的α亞單位。玻連蛋白受體是在細(xì)胞上表達(dá)的，例如，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(而且，在某些程度上，也在血小板上表達(dá))，調(diào)節(jié)對(duì)許多胞外性基質(zhì)蛋白(例如，玻連蛋白、纖連蛋白、vonWillebrand因子、血纖蛋白原、骨橋蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、膠原、基底膜聚糖)的黏結(jié)。GPIIb/IIIa與玻連蛋白受體之間具有足夠的同源性，所以，直接抗GPIIb/IIIa的單克隆抗體7E3也同樣與在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的玻連蛋白受體相結(jié)合(實(shí)施例10)。對(duì)血管壁的損傷導(dǎo)致一系列細(xì)胞活性和增殖的調(diào)節(jié)子的釋放。血小板凝集、血小板脫粒作用、倒位、在凝聚中涉及的血小板表面現(xiàn)象都導(dǎo)致血栓形成并釋放其它的因子(例如，生長因子和細(xì)胞激活素，如由血小板衍生的生長因子)，從而刺激在受傷位點(diǎn)的細(xì)胞增殖和遷移。炎癥細(xì)胞激活素可以引起產(chǎn)生基質(zhì)蛋白(例如，膠原、骨橋蛋白、玻連蛋白)，并積聚在受傷位置。這樣，細(xì)胞遷移就被激發(fā)，血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬體、成纖維細(xì)胞、以及其它的炎癥因子就向傷口遷移，導(dǎo)致傷癍(例如，動(dòng)脈粥樣化)，使血管流徑變窄(狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄)。當(dāng)細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞)遷移到傷口的時(shí)候，αvβ3整合蛋白或玻連蛋白受體也被牽涉于其中。αvβ3就與粥樣化傷癍中的胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，例如，玻連蛋白、骨橋蛋白或其它的基質(zhì)蛋白。交聯(lián)的αvβ3受體，例如與玻連蛋白結(jié)合之后，就可以送出遷移/活化信號(hào)，還可以產(chǎn)生促進(jìn)遷移的物質(zhì)。復(fù)發(fā)性狹窄使血管流徑變窄，導(dǎo)致血栓發(fā)生。在不受某一具體理論限制的同時(shí)，應(yīng)該有理由相信給以能夠結(jié)合GPIIb/IIIa和αvβ3，并能夠抑制它們的功能的制劑(例如，抗體c7E3Fab)，就可以抑制血小板凝集、脫粒和倒位，并能夠使血管壁鈍化，不宜形成血栓和發(fā)生急性臨床病癥。因此，就可以降低凝聚中涉及的血小板表面現(xiàn)象，使凝血酶的生成數(shù)量被減小，其它的因子的釋放被降低(例如，生長因子和細(xì)胞激活素)，抑制細(xì)胞的增殖、遷移，以及抑制傷癍的形成。根據(jù)前所未見的長期效果，例如在給予嵌合性抗-GPIIb/IIIa抗體片段(見實(shí)施例7)顯示的對(duì)非急性局部缺血綜合癥的降低那樣，給予能夠與存在于內(nèi)皮細(xì)胞上的血小板GPIIb/IIIa和αvβ3整合蛋白反應(yīng)并抑制其功能的試劑(例如，抗體c7E3Fab)，就可以降低和防止冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后的非急性局部缺血綜合癥(例如，手術(shù)后3-6個(gè)月或更長)。例如，可以給予的有與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體結(jié)合的抗體、抗體片段，例如，F(xiàn)v、Fab、Fab’、F(ab’)2等。適宜的抗體可以是多克隆的或單克隆的，術(shù)語抗體和免疫球蛋白包括多克隆抗體和單克隆抗體。術(shù)語抗體和免疫球蛋白還包括單鏈抗體、嵌合性抗體、人源化抗體、靈長源化抗體(CDR-剪切)，以及包含從不同種來源的不同部分的嵌合性或CDR-剪切的單鏈抗體。參見例如Cabilly等人的美國專利第4,816,567號(hào)；Cabilly等人的歐洲專利第0,125,031B1號(hào)；Winter的美國專利第5,225,539號(hào)；Winter的歐洲專利第0,239,400B1號(hào)；還可以參見Newman，R.等人BioTechnology，101455-1460(1992)關(guān)于靈長源化抗體；Ladner等人的美國專利第4,946,778號(hào)和Bird，R.E.等人在Science，242423-426(1988)關(guān)于單鏈抗體的文章?？梢允褂猛珿PIIb/IIIa和玻連蛋白受體結(jié)合的鼠7E3或嵌合性7E3抗體。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使用的抗體是在GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體上與7E3抗體結(jié)合的同一表位發(fā)生反應(yīng)的抗體(功能性等同物)。例如，可以使用阻止7E3單克隆抗體與GPIIb/IIIa和玻連蛋白受體的結(jié)合的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種交叉反應(yīng)的抗體或其部分(例如，F(xiàn)ab片段)對(duì)血小板上的GPIIb/IIIa受體和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上的玻連蛋白受體都有很高的親和性，例如，至少為約5.0×107M-1，或更高，優(yōu)選約1.0×108M-1。這樣的抗體可以通過適宜的免疫原來得到(例如，血小板、分離的和/或純化的GPIIb/IIIa或αvβ3、或它們的鏈的成分、特別是β3鏈，這些物質(zhì)的部分或它們的合成分子，例如合成性肽)。對(duì)于免疫抗原、多克隆或單克隆抗體的生產(chǎn)，可以采用任何適宜的方法。眾多的這類方法已經(jīng)被介紹了[參見例如，美國專利第5,336,618號(hào)(Coller)；Kohler等人，Nature，256495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；Milstein等人，Nature266550-552(1977)；Koprowski等人，美國專利第4,172,124號(hào)；Harlow，E.和D.Lane，1988，AntibodiesALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor，NY)；CurrentProtocolsInMolecularBiology，Vol.2(Supplement27，Summer1994)，Ausubel，F(xiàn).M.等人，Eds.，(JohnWiley&SonsNewYork，NY)，Chapter11，(1991)]。給藥血小板的凝聚誘發(fā)鏈鎖凝固并且產(chǎn)生更加穩(wěn)定的(血)纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和凝血塊，它們可以被血栓溶解劑來溶化掉。本發(fā)明的選擇性地與GPIIb/IIIa受體相結(jié)合的抗體或化合物可以單獨(dú)地或與血栓溶血制劑，例如，纖維蛋白溶酶原激活子(例如，組織血纖維蛋白溶酶原激活子、尿激酶、鏈激酶、重組的組織纖維溶酶原激活子)，或抗凝固劑(例如，抗凝血酶)，或抗血小板劑例如阿斯匹林、肝素、水蛭素或香豆素抗凝固劑(例如芐丙酮香豆素)等結(jié)合使用于人體(如，人)，從而防止及降低血栓溶解治療后的復(fù)發(fā)性閉塞并加速凝血塊的溶解。這些化合物、抗體或其片段可以在使用血栓溶血?jiǎng)⒖谷苎钢苿?、抗凝固制劑或抗血小板之前、之后或同時(shí)按有效劑量使用，從而防止那些能夠?qū)е麻]塞或重復(fù)性閉塞的血小板凝集和/或延遲或防止狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄。有效劑量的(即足以獲得所需治療效果的劑量，例如抑制血小板凝聚并從而抑制血栓的形成或復(fù)發(fā)性血栓的劑量，能夠降低或延遲或防止狹窄或重復(fù)性狹窄或局部缺血的有效劑量)化合物或抗體或抗體片段可以按腸胃外的形式，優(yōu)選靜脈輸入的方式，在藥物上可接受的載體，例如無菌生理鹽水中對(duì)患者給藥。還可包括緩沖劑。這些抗體的制劑還可以包括另外的添加劑，例如穩(wěn)定劑(多乙氧基醚80，USP/NF)。這些抗體可以單一劑量、連續(xù)性使用或以多重滲透(例如，濃縮藥團(tuán)注射然后進(jìn)行連續(xù)滲透)使用。此外，這些化合物和抗體還可以被可調(diào)控的釋放方式[例如，用聚合物或外貼緩釋裝置(patch)]或另外的適當(dāng)?shù)姆绞絹斫o藥。給藥的劑量將要根據(jù)不同的因素，例如臨床癥狀，患者的體重以及是否伴有其它藥物(例如，血栓溶解劑)等一起使用而決定。在用抗血小板抗體的重復(fù)治療中，會(huì)發(fā)生藥物引起的血小板減少癥，其原因可能是身體將抗體所包被的血小板認(rèn)作是外來蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生更多的抗體來抵抗它們，并將它們以比正常情況更快的速度通過網(wǎng)狀內(nèi)皮的系統(tǒng)清除出去。由于GPIIb/IIIa受體在血小板的表面上的濃度很高(每個(gè)血小板上有約80,000受體)以及在循環(huán)系統(tǒng)中的血小板的數(shù)量很大(約0.25-0.5×106/μl)，因而使用抗血小板抗體的治療的一個(gè)顯著的并發(fā)癥是血小板減少癥。然而，使用嵌合抗血小板(抗GPIIb/IIIa)抗體可以避免這種問題。本發(fā)明的嵌合抗血小板抗體可以消除(減少或防止)在使用其它抗血小板抗體時(shí)產(chǎn)生的血小板減少癥。例如，在使用嵌合7E3Fab(參見實(shí)施例6和7)時(shí)只觀察到很少的血小板減少癥的癥狀的出現(xiàn)。另外，當(dāng)對(duì)人給予嵌合7E3Fab抗體片段時(shí)，顯示出了與其來源于鼠的等同物相比為另人吃驚的低的誘發(fā)性免疫反應(yīng)(參見實(shí)施例4和7)，特別是從對(duì)鼠7E3Fab的可變區(qū)的免疫原性的角度來看更是如此。當(dāng)與血小板結(jié)合時(shí)，抗血小板嵌合性抗體的來源于鼠的主要成分就與血小板表面相結(jié)合，例如通過GPIIb/IIIa受體，因此，就將使得它們無法與免疫系統(tǒng)相接觸，并使嵌合抗體在功能上與其相對(duì)應(yīng)的來源于人的抗相同表位的抗體無法區(qū)分。因此，本發(fā)明的其它嵌合抗血小板抗體盡管具有來源于鼠的抗原結(jié)合區(qū)，但是它們?cè)诜敲庖咝陨鲜欠浅ｎ愃频?。本發(fā)明的血小板特異性嵌合免疫球蛋白還可以用于血栓造影。要達(dá)到這一目的一般優(yōu)選使用抗體片段。如上所述，嵌合性重鏈基因可以被以剪切的形式設(shè)計(jì)出來，從而生產(chǎn)出嵌合性免疫球蛋白片段(例如Fab，F(xiàn)ab’和F(ab’)2)用于免疫閃爍圖造影(immunoscintigraphicimaging)。這些分子可以直接用或者通過螯合劑例如DTPA被放射性同位素例如131碘，125碘，99m锝，或111銦等標(biāo)記，產(chǎn)生放射性免疫閃圖劑。另外可以在嵌合抗體位點(diǎn)中設(shè)置一個(gè)放射性金屬結(jié)合(螯合)區(qū)，從而對(duì)標(biāo)記物提供位點(diǎn)。這樣，嵌合免疫球蛋白可以被設(shè)計(jì)為一種具有非人體來源的血小板特異性可變區(qū)、人體來源的恒定區(qū)(優(yōu)選被剪切的)、以及一個(gè)由金屬結(jié)合蛋白質(zhì)例如金屬硫因產(chǎn)生的金屬結(jié)合區(qū)的蛋白質(zhì)。血小板特異性嵌合免疫球蛋白或其片段可以對(duì)那些被懷疑患有血栓的病人給藥。當(dāng)以足夠的時(shí)間允許被標(biāo)記的免疫球蛋白到達(dá)血栓位點(diǎn)區(qū)時(shí)，則由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)被光掃描設(shè)備例如γ照相機(jī)檢測到。然后將檢測到的信號(hào)轉(zhuǎn)換成血栓的圖像。這種圖像就可以幫助在體內(nèi)確定血栓的位置并設(shè)計(jì)出適合的治療方案。本發(fā)明將由以下的實(shí)施例得以進(jìn)一步的說明，但并不受其限制。本發(fā)明的最佳實(shí)施例實(shí)施例1嵌合血小板特異性IgG4的制備A.總體方案由7E3雜交瘤對(duì)用于重鏈和輕鏈基因的可變區(qū)進(jìn)行克隆化的總體方案是基于對(duì)功能性重新排列(和表達(dá))Ig基因的可變區(qū)和相應(yīng)的結(jié)合區(qū)(J區(qū))的基因組之間的連接。J區(qū)DNA探針可以用于篩選基因庫以分離連接到J區(qū)的DNA，在種系表形(未被重新排列的)中的DNA還可以雜交到J探針中，但是并不連接到可變區(qū)序列上，可以通過對(duì)分離出來的克隆用限制酶分析對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)。因此，克隆化的方案是使用JH和JK從被重新排列的重鏈和輕鏈基因中分離出可變區(qū)。對(duì)這些克隆進(jìn)行Northern分析(Northernanalysis)以確認(rèn)它們的序列是否在7E3雜交瘤中被表達(dá)。那些含有被表達(dá)了的序列的克隆被放置到含有人體來源的恒定區(qū)的表達(dá)載體中，并被轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓瘤細(xì)胞中以確定是否有抗體的產(chǎn)生。然后對(duì)從細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體與7E3鼠抗體比較以確定其結(jié)合特異性和功能性。有關(guān)的細(xì)胞系和鼠雜交瘤7E3被存放于ATCC(AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852，USA)，存放日期是1985年5月30日，保存號(hào)是HB8832，并被確認(rèn)為是存活的。B.材料和方法除非另有說明，本文中所給出的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)都是以重量為基準(zhǔn)的，溫度以℃度為準(zhǔn)。重鏈基因組庫的構(gòu)建為了從7E3雜交瘤中分離出重鏈的可變區(qū)基因，用噬菌體λ載體gt10建立了依照大小選擇的基因組庫。使用JH探針對(duì)被EcoRI消化的7E3DNA進(jìn)行了Southern分析(Southernanalysis)，揭示了對(duì)應(yīng)于被重新排列的重鏈的位置的一個(gè)單一的3.5kb帶。這個(gè)片段非常可能含有7E3重鏈可變區(qū)基因。從7E3雜交瘤細(xì)胞中分離出來的大分子DNA被用限制性內(nèi)切酶EcoRI完全消化。然后對(duì)該DNA在0.7％瓊脂凝膠上進(jìn)行分級(jí)分離，并從凝膠中直接獲取尺寸范圍為3-4kb的DNA。在用苯酚/氯仿萃取后和交聯(lián)葡聚糖G-50凝膠過濾后，對(duì)3-4kb的片段用λgt10臂(PromegaBiotech，Inc.)配位，再用從PromegaBiotech獲取的Packagene在體外將其包裝在噬菌體顆粒內(nèi)。用32磷標(biāo)記的JH探針在濃度為大約每150mm培養(yǎng)皿中有30,000噬菌體的條件下對(duì)這個(gè)庫進(jìn)行直接篩選。在5×SSC，50％甲酰胺，2×Denhardt試劑，200μg/mL變性的鮭魚精子DNA中以42℃的溫度對(duì)這些噬菌斑進(jìn)行雜化18-20小時(shí)。最后，用0.5×SSC，0.1％SDS在65℃進(jìn)行清洗。用放射自顯影照相鑒定了陽性的克隆。輕鏈基因組庫的構(gòu)建為了分離用于7E3輕鏈的可變區(qū)基因，在λ載體EMBL-3上構(gòu)建基因組庫。大分子量的DNA用限制內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行部分消化，并在10-40％蔗糖濃度梯度上進(jìn)行按大小尺寸的分組。具有18-23kb的DNA片段與EMBL-3臂相配位，然后再用Packagene將其在體外裝入到噬菌體顆粒中。用JK探針在濃度為大約每150mm培養(yǎng)皿中有30,000噬菌體的條件下對(duì)這個(gè)庫進(jìn)行篩選。雜化和清洗的條件都與前述重鏈基因組庫的相同。DNA探針小鼠重鏈JH探針是含有J3和J4碎片的2kbBamHI/EcoRI的片段。小鼠輕鏈JK探針是含有所有5種JK碎片的2.7kbHindIII片段。32磷標(biāo)記的探針用從Amersham，Inc.獲取的制劑盒進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)譯來制備。用交連葡聚糖G-50柱進(jìn)行離心把游離的核苷酸去除。該探針的特異活性大約是109cpm/μg。Northern分析總量為15μg的細(xì)胞RNA用1％瓊脂/甲醛凝膠(Maniatis，etal，MolecularCloning)進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上。在5×SSC，50％甲酰胺，2×Denhardt溶液和200μg/mL變性的鮭魚精子DNA中用42℃對(duì)漬點(diǎn)用缺口轉(zhuǎn)譯的DNA探針進(jìn)行雜化。最后清洗的條件是0.5×SSC，0.1％SDS，65℃。采用電穿孔法的DNA轉(zhuǎn)染被轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA被在溴化乙錠/氯化銫梯度離心至平衡兩次來進(jìn)行純化。將10-50μg的質(zhì)粒DNA加到放置在冰上的處于PBS中的8×106SP2/0細(xì)胞中，將該混合物放在Biorad電穿孔設(shè)備上。進(jìn)行電穿孔的電壓是200伏特，然后將細(xì)胞放置到96孔微滴盤中。48小時(shí)后用藥品進(jìn)行篩選，然后經(jīng)過1-2個(gè)星期將對(duì)藥物有抗性的克隆鑒定出來。抗體生產(chǎn)的定量化按照顆粒濃度熒光免疫分析法(Jolley，M.E.etal.，(1984)J.Immunol.Meth.6721)用純化的IgG得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析組織培養(yǎng)上清液中的IgG蛋白含量。使用山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和用結(jié)合有山羊抗人IgGFc抗體的熒光素對(duì)帶有人恒定區(qū)的嵌合7E3抗體的濃度進(jìn)行確定。本分析用自動(dòng)化的儀器(PandexLaboratories，Inc.)完成。血小板特異性嵌合IgG4抗體的純化用DiafloYM100超濾膜(Amicon)對(duì)組織培養(yǎng)上清液進(jìn)行濃縮，然后裝載到蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱上。用pH6.5-pH3.5的檸檬酸鈉的pH梯度將嵌合抗體從該蛋白質(zhì)A柱上洗脫下來。被純化的抗體用DiafloYM100超濾膜進(jìn)行濃縮?？贵w的濃度根據(jù)其在280nm的吸收來確定。抑制結(jié)合的分析被純化的抗體(鼠7E3或嵌合7E3)與放射性碘化的7E3競爭與人血小板相結(jié)合。用檸檬酸化的人全血以1875rpm離心3.5分鐘來制備富含血小板的血漿(PRP)。將125碘標(biāo)記的7E3抗體(150,000cpm)加入到適當(dāng)稀釋濃度的純化的受試抗體中，然后加入150μlPRP中來啟動(dòng)該反應(yīng)。在室溫下保育1-2小時(shí)，然后將其放入0.4mLmicrofuge管中的30％蔗糖內(nèi)以12,000g離心4分鐘將結(jié)合有抗體的血小板與游離的抗體分離開來。在管的尖部的含有血小板/抗體的小丸被取出并放在γ計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。碘化的7E3與嵌合7E3之間對(duì)血小板的競爭同碘化的7E3與未標(biāo)記的7E3IgG之間的競爭進(jìn)行比較。對(duì)血小板凝聚的抑制將純化的7E3或嵌合的7E3抗體加入到檸檬酸化的人全血中，并在37℃保育10分鐘。血小板凝聚的速率是在用膠原或ADP活化后使用全血集合度計(jì)(ChronologCorp.)測量的。C.結(jié)果血小板特異性可變基因區(qū)的克隆化在用JH和JK探針分別對(duì)大約100萬個(gè)噬菌斑進(jìn)行篩選之后，從其重鏈和輕鏈基因組庫中分離出來了幾個(gè)陽性克隆。在進(jìn)行了至少3次純化之后，從每一個(gè)陽性的克隆中分離出來了細(xì)菌噬菌體DNA，用EcoRI(重鏈克隆)或HindIII(輕鏈克隆)進(jìn)行消化，并用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分組。將該DNA轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上，用JH(重鏈)或JK32磷標(biāo)記的DNA探針對(duì)漬點(diǎn)進(jìn)行雜化。在重鏈中分離出兩個(gè)克隆，含有與JH探針雜化了的3.5kbEcoRIDNA片段。用JK探針鑒定出了兩類分別為3.0和6.0kb的HindIII片段。與來自于7E3雜交瘤的原始重鏈和輕鏈可變區(qū)相對(duì)應(yīng)的克隆化的DNA要與從雜交瘤中分離出來的mRNA雜化。在重鏈或輕鏈位置上的非功能性DNA重新排列將不被表達(dá)。圖1給出的是Northern分析，表明的是推斷的3.5kbEcoRI重鏈片段和推斷的6.0kbHindIII輕鏈片段各自與來自7E3雜交瘤的適當(dāng)大小的mRNA的雜化。這些亞克隆的片段被缺口轉(zhuǎn)譯進(jìn)行32磷標(biāo)記，并且被雜化到含有來自于SP2/0(7E3雜交瘤的融合伴侶)或來自于7E3的全RNA的northern漬點(diǎn)，如圖1所示。3.5kbEcoRI重鏈片段與7E3RNA的2kbmRNA發(fā)生雜化，而不與SP2/ORNA的2kbmRNA發(fā)生雜化。相似地，6.0kb輕鏈HindIII片段與7E3RNA的但不與SP2/ORNA的1250bpmRNA相雜化，這些尺寸分別是重鏈和輕鏈mRNAs的正確尺寸。因?yàn)榭寺』腄NA片段含有在7E3雜交瘤中表達(dá)的序列，這些數(shù)據(jù)就表明這些克隆含有來自于7E3雜交瘤的正確的可變區(qū)序列。然而，其功能性的最后測試是由這些序列與適當(dāng)?shù)暮愣▍^(qū)序列結(jié)合在一起時(shí)能夠指導(dǎo)合成具有與鼠7E3抗體相似的特異性和親和性的抗體而證實(shí)。載體和表達(dá)系統(tǒng)從7E3雜交瘤克隆化的推斷的輕鏈和重鏈V基因被結(jié)合到如前所述的(Sun，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))在表達(dá)載體中的人κ和G4恒定區(qū)基因中。pSV184ΔHneo17-1AVκhCκ的17-1AVκHindIII片段被用與來自于7E3的推斷的輕鏈可變區(qū)基因相應(yīng)的6.0kbHindIII片段所取代。相似的pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG4的17-1AVHEcoRI片段被用與來自于7E3的推斷的重鏈V區(qū)基因相應(yīng)的3.5kbEcoRI片段所取代。所得到的質(zhì)粒，被命名為p7E3VκhCHκ和p7E3VHhCG4，如圖2所示。為了表達(dá)嵌合重鏈和輕鏈基因，將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到非生產(chǎn)型小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0中。輕鏈質(zhì)粒具有對(duì)G418的抗性，重鏈質(zhì)粒具有對(duì)霉酚酸的抗性，因此使得它們可以對(duì)含有從每一個(gè)質(zhì)粒來的表達(dá)基因的克隆進(jìn)行篩選。具有對(duì)G418和霉酚酸抗性的克隆被擴(kuò)展到穩(wěn)定的細(xì)胞系中并保持在有這兩種藥物的條件下。對(duì)從這些細(xì)胞系來的組織培養(yǎng)上清液測試抗體，使用的是顆粒濃度熒光免疫分析法，山羊抗人IgGFc抗體包被的聚苯乙烯珠粒和被熒光素標(biāo)記的同種抗體。在被檢測的最初10個(gè)細(xì)胞系中有一個(gè)產(chǎn)生大約2μg/mL抗體的細(xì)胞系(命名為c-7E3F6)被選來用于進(jìn)一步研究。血小板結(jié)合活性的檢測在用蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱對(duì)c-7E3F6進(jìn)行提純后，對(duì)抗體進(jìn)行濃縮并用血小板結(jié)合活性檢測法與鼠7E3IgG進(jìn)行比較。圖3表示的是鼠7E3和c-7E3F6(推斷的嵌合抗體)同放射性標(biāo)記的7E3競爭與血小板同等程度的結(jié)合。結(jié)合曲線表明鼠7E3和嵌合7E3在這一標(biāo)準(zhǔn)下的結(jié)合特性是相等的。c-7E3F6對(duì)血小板凝聚的抑制純化的c-7E3F6與鼠7E3用測量受試抗體對(duì)人血小板凝聚的抑制力的功能性檢測來進(jìn)行比較。其檢測的結(jié)果列于表4中，表明這兩種抗體在同樣濃度下對(duì)膠原引起的血小板凝聚的抑制程度是相等的。c-7E3F6還對(duì)ADP引起的血小板凝聚具有相似的抑制能力。血小板結(jié)合檢測以及抑制血小板凝聚的檢測表明(1)正確的可變區(qū)基因確實(shí)被從7E3雜交瘤克隆出來；(2)用人恒定區(qū)取代鼠恒定區(qū)并沒有對(duì)7E3可變區(qū)的結(jié)合和功能特性造成任何影響，正如這些檢測所示。纖維蛋白原包被的珠粒檢測嵌合c-7E3F6抗體在定量性、功能性的檢測中，即測定抗體抑制血小板同纖維蛋白原包被的珠粒的凝集的檢測中被發(fā)現(xiàn)是陽性的。Coller，B.etal.(1983)J.Clin，Invest，73325-338。實(shí)施例2嵌合IgG1和IgG3的生產(chǎn)對(duì)于從鼠7E3抗體來的重鏈的可變區(qū)進(jìn)行編碼的DNA碎片通過以相應(yīng)的7E3可變區(qū)片段取代17-1A重鏈或輕鏈可變區(qū)片段而連接到在表達(dá)載體pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG1和pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG3(Sunetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987))上存在的人γ1和γ3恒定區(qū)。所得到的嵌合重鏈基因與嵌合輕鏈基因被共轉(zhuǎn)染到SP2/0細(xì)胞中，以獲得分泌γ1，K、和γ3，K抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系。實(shí)施例3對(duì)嵌合7E3Fab在人體應(yīng)用上的初步研究制備嵌合7E3Fab片段嵌合7E3(c7E3)Fab片段的生產(chǎn)是用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶對(duì)純化的嵌合7E3IgG(γ1重鏈，κ輕鏈)進(jìn)行酶消化來完成的。用一系列設(shè)計(jì)的純化步驟，即生產(chǎn)不含其它的消化的片段和污染成分(例如，蛋白質(zhì)、核酸、病毒)的純化步驟來分離Fab片段。最后的產(chǎn)品是一種無菌的非熱原溶液，含有2mg單克隆嵌合7E3Fab/mL0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉，pH7.2。在某些制劑中，包含有最終濃度為0.001％(w/v)的多乙氧基醚80。使用前用0.22微米低蛋白結(jié)合過濾器進(jìn)行過濾。產(chǎn)品儲(chǔ)存于2-8℃。藥物動(dòng)力學(xué)c7E3Fab在人體血漿中的消失人體血漿中的消失是在三個(gè)患有穩(wěn)定的冠心病的患者中進(jìn)行的。用5分鐘靜脈滲透給藥0.20-mg/kg的c7E3Fab，在給藥后的2分鐘起至72小時(shí)收取血樣。可預(yù)見的是有一部分的抗體以非結(jié)合態(tài)存在于血漿中。為了對(duì)這些非結(jié)合的抗體成分進(jìn)行定量，要盡快地將血漿與血小板分離開來以防止在體外的進(jìn)一步結(jié)合。用固相酶免疫分析法(EIA)檢測血漿中游離的c7E3Fab濃度。在該檢測中，從兔抗血清中提純的抗鼠7E3IgG親和性分離物被用于固相捕捉，同時(shí)還使用了在同樣的兔抗體7E3抗體制劑的生物素化的衍生物的基礎(chǔ)上建立的檢測體系。其結(jié)果列于表1。表1在用0.20-mg/kg劑量處理過的患者的血漿中的c7E3Fab濃度c7E3Fab(μg/mL)時(shí)間*患者A患者B患者C給藥前NDNDND2分鐘NA2.5542.3125分鐘1.1491.8731.41110分鐘0.7131.3311.11115分鐘0.6100.9160.85220分鐘0.4990.9850.75630分鐘0.4630.8150.51545分鐘0.3400.7040.4051小時(shí)0.3080.4360.1952小時(shí)0.2880.2620.1496小時(shí)0.2030.0950.10512小時(shí)0.1120.0720.06424小時(shí)0.0650.0580.05348小時(shí)0.0550.1470.17472小時(shí)0.196ND0.076*給藥與抽血的時(shí)間間隔。注意，在血被抽出來以后血小板還與血漿有額外的2分鐘接觸時(shí)間(即用離心方法對(duì)血漿的分離時(shí)間)。ND＝未檢測出/低于檢測的最低檢測水平(0.025μg/mL)。NA＝未獲得。如果將整個(gè)注射的7E3作為血漿中的游離抗體進(jìn)行檢測，則抗體濃度的理論最大值就為大約5.0μg/mL(0.20mg/kg除以40mL血漿/kg)。然而，這一理論最大濃度是永遠(yuǎn)無法獲得的，因?yàn)樵谧⑸涞目贵w中有很大一部分與血小板相結(jié)合了。事實(shí)上，在最早的那一次測定(2分鐘)時(shí)，血漿中平均c7E3Fab濃度(n＝2)是2.43μg/mL，這一數(shù)值是實(shí)測的最大血漿濃度(Cmax)。在注射后的按時(shí)間順序抽取的血樣中的測定值顯示了血漿中c7E3Fab濃度的迅速下降。在1小時(shí)和24小時(shí)的測定值顯示了在血漿(n＝3)中殘存的被注射的抗體的濃度分別小于0.5μg/mL和0.1μg/mL。在圖5中是血漿抗體濃度(ng/mL)對(duì)時(shí)間的點(diǎn)陣圖，以圖表的形式顯示了在得自所有3個(gè)患者的血漿中c7E3Fab的迅速消失。對(duì)c7E3Fab片段的藥物動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了初步的分析。對(duì)獲得的血漿濃度的數(shù)據(jù)使用了幾種不同的模型，包括幾種混合的(隨機(jī)和固定效果)線性模型以及標(biāo)準(zhǔn)的兩室模型和不分室模型。血漿游離抗體的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)的藥物動(dòng)力學(xué)模型并不符合。由于對(duì)c7E3Fab的作用點(diǎn)是在血小板的受體上，游離抗體的血漿濃度與其作用點(diǎn)處的濃度不發(fā)生任何直接的聯(lián)系這一結(jié)果并不是無法預(yù)見的。c7E3Fab在血漿中的迅速消失，部分上反應(yīng)了抗體與血小板的GPIIb/IIIa受體的迅速結(jié)合。在所檢測的模型中隨機(jī)效果線性模型與血漿濃度的數(shù)據(jù)最相吻合。使用這一模型獲得了藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Clp，Vd和t1/2的初步值，并列于表2。表2c7E3Fab*的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)值參數(shù)數(shù)值Clp(份數(shù)/小時(shí))15.6Vd(L)6.8t1/2(小時(shí))0.1(6分鐘)*使用了隨機(jī)效果線性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。Clp＝在血漿中的消失被定義為血漿濃度的下降除以該濃度的比率并被計(jì)算為每小時(shí)的速率，即如果在某一時(shí)刻的速率延續(xù)一小時(shí)，則計(jì)算的速率就將是在那一小時(shí)內(nèi)去除的藥物的份數(shù)。Vd＝體積分布被定義為所給藥的劑量除以測定的血漿濃度與血漿體積的乘積。計(jì)算中對(duì)體重為70公斤的人選用3升血漿體積。t1/2＝半消除期。人體尿樣的檢測3名穩(wěn)定的冠心病患者以靜脈注射0.25-mg/kgc7E3Fab后，收集他們的尿樣(這三名患者的血漿消失數(shù)據(jù)如上所述)。按以下的注射后的時(shí)間收取他們的尿樣0-2小時(shí)，2-6小時(shí)，6-12小時(shí)，12-24小時(shí)。此外，還收集了給藥前的尿樣。用對(duì)如上所述EIA進(jìn)行了稍微修飾的方法在所收取的尿樣的選樣中測定游離的7E3Fab。在所有的案例中，都沒有在尿樣中檢測到c7E3Fab?；A(chǔ)毒理學(xué)基礎(chǔ)毒理學(xué)的研究是用嵌合7E3Fab在18只猴子(Cyonomolgus屬和獼猴屬)中進(jìn)行的。濃縮藥丸劑量上至0.6mg/kg，然后滲透上至0.8μg/kg/分，共96小時(shí)(包括對(duì)肝素，阿斯匹林和重組的組織血纖維蛋白溶酶原激活子的研究)。在所有的猴子中、所有的劑量內(nèi)以及所有的組合情況下，7E3都是安全的，并且完全都是可以忍受的，沒有任何顯著的失血并發(fā)癥或其它的有害反應(yīng)。在穩(wěn)定的心絞痛患者中的嵌合7E3Fab的劑量階梯劑量梯度的研究是在52名停止接受抗血小板治療10天以上的穩(wěn)定的心絞痛患者(男，43～75歲)中進(jìn)行的。使用了不同的劑量。這些患者要么接受了一次性靜脈注射0.15～0.30mg/kg嵌合7E3Fab(20名患者)，要么是接受一次性濃縮藥丸，然后以12～96小時(shí)進(jìn)行靜脈滲透(10μg/分)(32名患者)。在使用了濃縮丸劑c7E3Fab(0.15-0.30mg/kg)兩小時(shí)后，確定血小板GPIIb/IIIa受體的封閉，對(duì)20μMADP(拮抗劑)反應(yīng)的血小板凝聚，以及失血時(shí)間。受體封閉和作為對(duì)拮抗劑反應(yīng)的血小板凝聚是按照以上所述確定的(Gold，H.K.etal.，J.Clin.Invest.86651-659(1990))。失血時(shí)間是用Simplate方法進(jìn)行確定的。正如受體封閉的百分?jǐn)?shù)(由可利用的受體結(jié)合位點(diǎn)來確定)所指出的，隨著所用劑量的提高，對(duì)受體的封閉也逐步提高。在受體封閉增高的同時(shí)，相伴隨的還有對(duì)血小板凝聚抑制(以給藥前的數(shù)值或基線為準(zhǔn)的百分?jǐn)?shù))的升高，以及失血時(shí)間的增長。在所有三個(gè)參數(shù)中的峰值都是在0.25mg/kg觀察到的。這一劑量相應(yīng)的血漿濃度為5μg/mL，即在集合度計(jì)的小杯中有升高了濃度的嵌合7E3Fab存在時(shí)對(duì)正常人體的富含血小板的血漿保育15分鐘后觀察到抑制峰值的濃度。(從正常人體來的血漿的凝聚程度是用穿過小杯的光量的百分?jǐn)?shù)來決定的。在加入拮抗劑之前，血漿相對(duì)來說是不透明的，將此時(shí)的透光量的百分?jǐn)?shù)定為0點(diǎn)。當(dāng)把拮抗劑ADP加入到不含抗體的對(duì)照樣品中時(shí)，隨著凝聚的發(fā)生，透光量就逐漸提高。然而，當(dāng)有c7E3Fab存在時(shí)就觀察到了由劑量引起的對(duì)凝聚的封閉，并且完全抑制由5μg/mLc7E3Fab產(chǎn)生。)對(duì)受體的封閉，失血時(shí)間以及血小板凝聚的抑制的期間進(jìn)行了確定。在兩小時(shí)處觀察到了受體封閉，血小板凝聚以及失血時(shí)間的峰值，并且是隨著時(shí)間而逐漸回復(fù)的。在6～12小時(shí)內(nèi)失血時(shí)間回到接近正常值處。由于受體封閉和功能性抑制的峰值是以0.25mg/kg獲得的，所以對(duì)該劑量的藥物進(jìn)行連續(xù)滲透所造成的血小板抑制的期間進(jìn)行了檢測以確定血小板抑制的期間是否可以被延長。在5名接受了0.25mg/kg給藥并以10μg/分連續(xù)72小時(shí)滲透嵌合7E3Fab的患者中，受體封閉、血小板凝聚的抑制以及失血時(shí)間的延長的程度都在整個(gè)連續(xù)滲透的期間內(nèi)保持不變，一旦連續(xù)滲透被中斷，就開始發(fā)生回復(fù)現(xiàn)象。在12、24、48、和96小時(shí)的滲透中也發(fā)生了同樣的結(jié)果。沒有任何一個(gè)患者發(fā)生了過敏反應(yīng)。沒有與這種處理相關(guān)的在血液學(xué)和化學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)值上的顯著變化。也沒有任何嚴(yán)重失血現(xiàn)象發(fā)生。非顯著的失血現(xiàn)象是很少見的，僅在那些患有牙周病的患者中出現(xiàn)了輕微的牙齦滲血以及輕微的鼻出血。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，嵌合7E3Fab可以按劑量對(duì)患者給藥，產(chǎn)生對(duì)血小板的抑制長達(dá)幾天的效果。免疫原性結(jié)果在鼠7E3F(ab’)2和Fab的實(shí)驗(yàn)中(150名患者)，用敏感性酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)16％的患者(24/150)發(fā)生免疫反應(yīng)。所有的反應(yīng)都是低效價(jià)的，典型的范圍是1∶50到1∶200。在受試組內(nèi)包括用0.01-0.25mg/kg鼠7E3F(ab’)2處理過的正常的自愿者，用0.05-0.20mg/kg鼠7E3F(ab’)2處理過的非頑固性心絞痛患者，用0.1mg/kg鼠7E3F(ab’)2或0.15-0.35mg/kg鼠Fab處理過的PTCA患者，以及分別用一次性靜脈注射0.01-0.30mg/kg鼠7E3Fab處理過的、一次性給藥0.25或0.30mg/kg然后連續(xù)滲透12～36小時(shí)(0.15μg/kg/分或10μg/分)鼠Fab或按6小時(shí)間隔兩次注射鼠Fab(一次給藥0.2mg/kg-0.30mg/kg，隨后以0.05mg/kg第二次給藥)的頑固型心絞痛患者。用人-鼠嵌合7E3Fab可以明顯地降低免疫原性。在52名患有頑固型心絞痛并用嵌合7E3Fab處理過(如上所述)的劑量梯度研究中的患者身上沒有顯示出免疫反應(yīng)，其確定方法是與對(duì)嵌合Fab相似的檢測法?？寡“寤钚缘哪孓D(zhuǎn)性嵌合7E3Fab(γ1，κ)從血小板上脫落的速率比較慢，血漿中游離的嵌合7E3Fab從循環(huán)系統(tǒng)中可以迅速地消失(如上所述)。因此，嵌合7E3的抗血小板效果可以由使用隨機(jī)供者的血小板來逆轉(zhuǎn)。這種由轉(zhuǎn)輸血小板而引起的逆轉(zhuǎn)或解毒效應(yīng)在2名接受了鼠Fab或嵌合Fab并在接近對(duì)血小板凝聚達(dá)到完全抑制的時(shí)候又接受了隨機(jī)供體血小板的患者中得到證實(shí)。對(duì)血小板功能的恢復(fù)是由測量失血時(shí)間來測定的。這一性質(zhì)對(duì)于因?yàn)槭а枰M(jìn)行對(duì)血小板功能恢復(fù)的患者是非常有用的。實(shí)施例4用嵌合7E3抗體在選擇性冠心血管成形術(shù)中防止血栓并發(fā)癥經(jīng)皮經(jīng)腔冠心血管成形術(shù)(PTCA)，例如使用氣囊泵或冠狀動(dòng)脈癍塊切除(atherectomy)的PTCA是一種有效的使狹窄的冠心動(dòng)脈腔擴(kuò)張的方法。在這一過程中，在進(jìn)行血管成形術(shù)之中和之后都伴隨著固有的急性冠心血管閉塞的危險(xiǎn)。報(bào)導(dǎo)的冠心閉塞的發(fā)生率在選擇性血管成形術(shù)的案例中為大約3％～6％(Detre，K.M.etal.，Circulation82739-750(1991))，并且是在醫(yī)院中發(fā)病和死亡的主要因素。在危險(xiǎn)性高的患者中由血栓引起的重大心肌病癥發(fā)生率是10-20％。在冠心血管成形術(shù)之中或緊隨其后而發(fā)生的急性冠心閉塞的原因看起來是由于對(duì)動(dòng)脈血管壁的深度損傷以及由此而產(chǎn)生的伴有或不伴有血栓的部分閉塞性“內(nèi)膜瓣(intimalflaps)”、或在血管壁損傷的部位的血栓而共同造成的。在動(dòng)物中，在進(jìn)行了成功的血栓溶解之后而發(fā)生的再次閉塞都有在以前發(fā)生過周期性的冠心血管流量的降低和恢復(fù)，即稱作“周期流量變化”(CFV)的病史。這些CFV幾乎完全是一種血小板調(diào)控的現(xiàn)象，其原因是血小板凝聚物在冠心狹窄處和內(nèi)皮損傷處的重復(fù)性聚集和脫落。在人體中也發(fā)現(xiàn)了在冠心血管成形術(shù)后出現(xiàn)的周期流量變化。在血管成形術(shù)中可以用嵌合7E3抗體抑制血小板的功能并進(jìn)而防止血小板的凝聚和血栓。嵌合7E3抗體在那些有高度發(fā)生血栓危險(xiǎn)的病人中是特別有用的。這些患者可以根據(jù)解剖學(xué)(例如血管造影術(shù)對(duì)狹窄位點(diǎn)的損傷的特性的確定)或臨床的那些預(yù)示著急性冠心血栓和那些產(chǎn)生急性心肌梗塞、非頑固性心絞痛或突發(fā)性堵塞綜合癥的危險(xiǎn)征兆(例如心肌梗塞，非頑固性心絞痛，糖尿病，65歲以上的婦女)來確診。在選擇性PTCA中的嵌合抗血小板抗體本試驗(yàn)是分兩階段進(jìn)行的。第一階段的主要目的是確定在進(jìn)行了選擇性經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)的患者中嵌合7E3Fab的最佳一次劑量和其安全性。進(jìn)行第二階段試驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)將嵌合7E3(c7E3)作為濃縮丸劑進(jìn)行滲透并緊接著進(jìn)行不同連續(xù)期間的滲透的安全性及前期效率。第二階段研究中的患者是接受了選擇性冠狀動(dòng)脈成形術(shù)并且有高度局部心肌缺血并發(fā)癥危險(xiǎn)的患者。高度危險(xiǎn)的患者包括那些帶有B型或C型損傷特性的非頑固性心絞痛和頑固型冠心病的患者。表3給出了確定高度危險(xiǎn)患者的標(biāo)準(zhǔn)，表4給出了血管造影學(xué)的損傷特征的定義。前期效率是由對(duì)血小板的抑制以及防止血栓并發(fā)癥的功能而測定的。在本實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)階段之中，可選用的對(duì)象是18-76歲的男性以及18-76歲的不具懷孕潛力的女性。表3具有高度局部缺血并發(fā)癥危險(xiǎn)的患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)中等程度的高度危險(xiǎn)1)不具有所定義的損傷特異特征的非頑固性心絞痛。2)具有單一B損傷特異特征的狹窄。最高危險(xiǎn)1)帶有≥2個(gè)B型損傷特異性特征的狹窄。2)帶有至少一個(gè)B型損傷特異特征的狹窄的非頑固性心絞痛。3)帶有至少一個(gè)B型損傷特異特征的狹窄的糖尿病。4)帶有至少一個(gè)B型損傷特異特征的狹窄的≥65歲的女性。5)帶有至少一個(gè)C型損傷特異特征的狹窄。表4損傷特異特征A型損傷(高成功率，＞85％；低危險(xiǎn))-稀疏的(＜10mm長度)-沒有或幾乎沒有被鈣化-同心的-并非完全閉塞的-可接觸的-不在口部的-非尖角的碎片，＜45°-不涉及主要支管-平滑輪廓的-沒有血栓B型損傷(中等成功率，60-85％；中等危險(xiǎn))-管狀(10-20mm長度)-中度-重度鈣化-偏心的-完全閉塞＜3個(gè)月-近端中等彎曲的碎片-位于口部-中等角度的碎片，＞45°，＜90°-分叉的損傷，需要兩條導(dǎo)線-非規(guī)則輪廓-有一些血栓存在C型損傷(低成功率，＜60％；高危險(xiǎn))-彌散-完全閉塞，＞3個(gè)月-近端極度彎曲的碎片-不能保護(hù)主要側(cè)枝-極度尖角的碎片，＞90°-帶有脆性損傷的變性的靜脈移植物第一階段在第一階段，將患者分組接受一次劑量靜脈注射嵌合7E3(γ1，κ)Fab片段(按實(shí)施例3的描述制備的和配方的)。對(duì)一共15名患者(3女12男)進(jìn)行了治療，病人的平均年齡是62歲(46-76歲)。在表5A和表5B中對(duì)所有一次劑量的患者和在單個(gè)劑量組內(nèi)的患者給出了人口學(xué)的輪廓。在劑量梯度方案中，有5名患者(n＝5)在進(jìn)行選擇性PTCA之前約30分鐘時(shí)接受了單一劑量的0.15mg/kg，0.20mg/kg，0.25mg/kg的c7E3Fab。在此程序中，所有的患者都接受了阿斯匹林(標(biāo)準(zhǔn)劑量)并用肝素(標(biāo)準(zhǔn)劑量)進(jìn)行了充分的抗凝集治療。雖然，PTCA程序?qū)Φ谝浑A段的病人被劃分為選擇性的，15個(gè)患者中的6個(gè)患有非頑固性靜止心絞痛(unstablerestangina)。進(jìn)行冠心擴(kuò)張的部位總結(jié)于表6(底部)。15名第一階段患者中的7名接受了在單一血管中一個(gè)損傷的PTCA，6名接受了在單一血管中多個(gè)損傷的PTCA，2名接受了在多條血管中的PTCA(表6)。為了獲得最佳單一劑量c7E3的效率標(biāo)準(zhǔn)被預(yù)測定義為在進(jìn)行滲透2小時(shí)后達(dá)到下列平均值的最低劑量(1)將失血時(shí)間延長了至少20分鐘；(2)對(duì)GPIIb/IIIa受體進(jìn)行了封閉使得基線位點(diǎn)受體的80％以上被封閉；和(3)作為對(duì)20μMADP的反應(yīng)，對(duì)血小板凝聚的抑制≤基線的20％。表5A嵌合7E3抗血小板抗體按年齡、體重、身高、性別和種族對(duì)病人的分類連續(xù)對(duì)照單一劑量全部患者32915年齡平均值57.454.260.1中間值57.056.062.0最小值383746最大值767476標(biāo)準(zhǔn)偏差9.710.59.7體重(kg)平均值82.888.285.5中間值84.884.284.0最小值42.367.370.5最大值113.0122.7107.0標(biāo)準(zhǔn)偏差16.619.011.1身高(cm)平均值171.2176.7173.6中間值172.8177.8175.2最小值152.4157.5160.0最大值7.98.87.8標(biāo)準(zhǔn)偏差性別女性813男性24812種族001白人26811黑人512亞洲人001西班牙裔100表5B嵌合7E3抗血小板抗體基于年齡、體重、身高、性別和種族的患者分級(jí)0.25mg/kg0.25mg/kg0.25mg/kg7E3*7E3*7E3*0.15mg/kg0.20mg/kg0.25mg/kg10mcg/分鐘10mcg/mg10mcg/分鐘7E37E37E36小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)安慰劑全體患者5551111109年齡平均值60.657.262.659.155.058.154.2中間值63.056.065.060.053.058.558.0最小值47465140423837最大值73687676737574標(biāo)準(zhǔn)偏差10.58.311.310.58.910.310.5體重(kg)平均值83.880.592.285.883.878.388.2中間值76.378.096.089.085.079.984.2最小值74.570.582.060.442.362.367.3最大值107.095.099.1113.0111.895.0122.7標(biāo)準(zhǔn)偏差13.89.57.717.819.610.719.0身高(cm)平均值170.8171.9178.1169.3170.9173.7176.7中間值173.0175.2177.8167.6172.7175.2177.8最小值160.0160.8169.0157.5152.4165.1157.5最大值177.8182.9188.0177.8185.0180.3185.4標(biāo)準(zhǔn)偏差7.08.87.06.410.85.48.8性別女性3003411男性2558798種族0010000白人3448998黑人2003201亞洲人0100000西班牙裔0000010表6血管造影特性被治療的損傷的數(shù)目對(duì)照c7E3Fabc7E3Fab第一階段第二階段單一血管/單一損傷8721單一血管/多重?fù)p傷067多重血管/單一損傷121多重血管/多重?fù)p傷002未知001被治療的損傷的位置RCA3913LCX4314LAD3917*在患有多重血管疾病的患者中，計(jì)數(shù)每一條血管。RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈第二階段在第二階段中，患者被給予0.25mg/kg濃縮丸劑，然后連續(xù)滲透10μg/分c7E3Fab6、12或24小時(shí)。受試組中的32名患者(8女，24男)參加了第二階段的研究。接受c7E3Fab處理的患者的平均年齡是57歲(范圍是38～76歲)有9名患者(1女，8男)作為對(duì)照參加了本試驗(yàn)。對(duì)照組患者的平均年齡是56歲(范圍是37～74歲)。對(duì)照患者是如上所述的高危險(xiǎn)患者，不接受c7E3的治療，但是按照接受c7E3的患者一樣被監(jiān)測。在表5A和表5B中列出了所有第二階段的患者以及各接受單一劑量處理組的患者的人口學(xué)輪廓。在進(jìn)行PTCA的氣囊擴(kuò)張之前30分鐘用c7E3Fab給藥。阿斯匹林和肝素是按照臨床標(biāo)準(zhǔn)給藥，并參考在進(jìn)行了血管成形術(shù)后肝素的用量應(yīng)該是每小時(shí)800單位。各有11名患者分別進(jìn)入到6小時(shí)和12小時(shí)的組內(nèi)，有10名患者進(jìn)入24小時(shí)的組內(nèi)。在32名接受了c7E3Fab治療的患者中，有21名患者經(jīng)歷了在單一血管內(nèi)有一個(gè)損傷的PTCA，7名患者接受了在單一血管中多重?fù)p傷的PTCA，有3名患者接受了多重血管的PTCA(表6)。有一名患者的PTCA的種類并沒有具體確定。在第二階段受試患者中的冠心擴(kuò)張位置總結(jié)于表6。在9名對(duì)照患者中，8名接受了單一血管內(nèi)一個(gè)損傷的PTCA，一名接受了多種血管的PTCA。這32名接受了c7E3Fab治療的患者和9名對(duì)照患者都具有那些能夠使他們被劃分為對(duì)PTCA有高度局部缺血心肌并發(fā)癥危險(xiǎn)的臨床和血管造影特征。有2名接受c7E3Fab治療的患者和一名對(duì)照患者具有未確定的危險(xiǎn)因素。剩下的30名接受c7E3Fab治療的患者和8名對(duì)照患者都具有至少一種使他們被劃分為有高度局部缺血并發(fā)癥危險(xiǎn)的臨床或血管造影特征，而且其中的大多數(shù)都具有一種以上的危險(xiǎn)特征。表7中總結(jié)的是用于對(duì)照和c7E3處理組的危險(xiǎn)因素，而對(duì)各劑量組內(nèi)的每一患者的危險(xiǎn)因素則列于表8A-表8D。表7高危險(xiǎn)特性第二階段危險(xiǎn)因素對(duì)照c7E3治療(n＝9)(n＝32)一種B型特性514兩種或兩種以上B型特性1273一種C型特性02無被鑒定的損傷特性的非頑固性絞痛114非頑固性絞痛+B型特性085非頑固性絞痛+≥2個(gè)B型特性176非頑固性絞痛+C型特性01未指定的危險(xiǎn)特性121編號(hào)為04-006的患有糖尿病的患者。2編號(hào)為04-007的患有糖尿病的患者。3編號(hào)為03-001與02-007的患有糖尿病的患者。4患者04-004除糖尿病外，還帶有以下額外的危險(xiǎn)因素女性，年齡＞65。5編號(hào)為03-003與05-001的患有糖尿病的患者。6患者01-018除糖尿病外，還帶有以下額外的危險(xiǎn)因素女性，年齡＞65；編號(hào)為03-002的患有糖尿病的患者。表8A素因性高危險(xiǎn)特性對(duì)照患者患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位201-0231.非頑固性絞痛LAD01-0241.一個(gè)B型特性3LAD04-0061.糖尿病LCX2.一個(gè)B型特性(偏心的)04-0071.糖尿病RCA2.兩個(gè)B型特性(偏心的，角度緩和的碎片；＞45°，＜90°)04-0081.一個(gè)B型特性(偏心的)LCX04-0091.一個(gè)B型特性(偏心的)LCX01-0211.一個(gè)B型特性3RCA01-0221.非頑固性絞痛OM2.兩個(gè)B型特性(管狀；不正規(guī)輪廓)03-0051.未確定的危險(xiǎn)特性RCA1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈OM＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8B素因性高危險(xiǎn)特性6小時(shí)持續(xù)滲透患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位204-0011.非頑固性絞痛RCA2.一個(gè)B型特性(偏心的)06-0011.非頑固性絞痛LCX2.一個(gè)B型特性(血栓)06-0021.一個(gè)B型特性LAD(管狀[10至20mm損傷])01-0141.非頑固性絞痛LAD2.一個(gè)C型特性(彌散＞2cm長度)01-0131.非頑固性絞痛RCA2.兩個(gè)B型特性(偏心的，一些血栓)01-0151.二個(gè)或更多個(gè)B型特性3LADLADD01-0171.一個(gè)B型特性(偏心的)LCX02-0051.非頑固性絞痛LAD2.三個(gè)B型特性(管狀，(10至20mm長度)；不正規(guī)輪廓；口部)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈LADD＝LAD的對(duì)角線分支3未確定的特性表8B(續(xù))素因性高危險(xiǎn)特性6小時(shí)持續(xù)滲透(續(xù))患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位203-0011.糖尿LAD2.四個(gè)B型特性(偏心的，角度緩，＞45°，＜90°；不正規(guī)輪廓；中度至重度鈣化)01-0121.一個(gè)C型特性(彌散＞2cm長度)LAD01-0161.一個(gè)B型特性(一些血栓)RCAOMn1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C素因性高危險(xiǎn)特性12小時(shí)持續(xù)滲透患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位201-0181.非頑固性絞痛OMn2.65歲以上女性3.兩個(gè)或兩個(gè)以上B型特性01-0191.非頑固性絞痛回旋2.兩個(gè)或兩個(gè)以上B型特性——02-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個(gè)B型特性(完全閉塞＜3個(gè)月)02-0071.糖尿病LCX2.五個(gè)B型特性(偏心的，近端片段的中度OM1，彎曲；角度緩和的片段，＞45°，＜90°；需LADD要雙重導(dǎo)線的分叉損傷；完全閉塞＜3個(gè)月)03-0021.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病3.兩個(gè)B型特性(中度彎曲片段，不正規(guī)輪廓)03-0031.非頑固性絞痛RCA2.糖尿病3.一個(gè)B型特性(不正規(guī)輪廓)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支表8C(續(xù))素因性高危險(xiǎn)特性12小時(shí)持續(xù)滲透(續(xù))患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位205-0011.非頑固性絞痛LADD2.糖尿病RCA3.一個(gè)B型特性3(偏心性)05-0021.一個(gè)B型特性(管狀)RCA2.一個(gè)C型特性LADD(完全閉塞＞3個(gè)月)05-0031.兩個(gè)B型特性LAD(角度緩和的片段，＞45°，＜90°；一些血栓)06-0031.非頑固性絞痛RCA2.一個(gè)B型特性(一些血栓)04-0021.非頑固性絞痛LCX2.一個(gè)B型特性(10至20mm管狀的)1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈LADD＝LAD的對(duì)角線分支OMn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D素因性高危險(xiǎn)特性24小時(shí)持續(xù)滲透患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位201-0201.兩個(gè)B型特性(不正規(guī)輪廓，一些血栓)RCA02-0081.非頑固性絞痛2.B型特性a)4個(gè)特性(管狀；偏心的；近端片段中LCX度彎曲；不正規(guī)輪廓)b)3個(gè)特性(偏心的；角度緩和的片段LCX＞45°，＜90°)05-0051.非頑固性絞痛RCA2.一個(gè)B型特性305-0061.非頑固性絞痛RCA2.一個(gè)C型特性(彌散(＞2cm長度))04-0031.兩個(gè)B型特性LAD(偏心性；帶有雙重導(dǎo)線的分叉)04-0041.非頑固性絞痛LAD2.糖尿病3.65歲以上女性1列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈LADD＝LAD的對(duì)角線分支Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性表8D(續(xù))素因性高危險(xiǎn)特性24小時(shí)持續(xù)滲透患者編號(hào)危險(xiǎn)類型(S)1部位204-0051.兩個(gè)B型特性(偏心性，一些血栓)RCA02-0091.非頑固性絞痛2.B型特性a)3個(gè)特性(不正規(guī)輪廓，一些血栓；需要雙重LAD導(dǎo)線的分叉損傷)b)1個(gè)特性(需要雙重導(dǎo)線的分叉損傷)LADc)2個(gè)特性(偏心性；需要雙重導(dǎo)線的分叉損傷)DB05-0041.一個(gè)B型特性O(shè)M1(需要雙重導(dǎo)線的分叉)OM21列于表3和表4的潛在特性2RCA＝右冠狀動(dòng)脈LCX＝左回旋冠狀動(dòng)脈LAD＝左前下冠狀動(dòng)脈DB＝Omn＝LCX的鈍的邊緣的分支3未確定的特性對(duì)血小板功能的抑制(第一階段的結(jié)果)為了鑒定嵌合7E3Fab對(duì)血小板功能的抑制活性，對(duì)GPIIb/IIIa受體結(jié)合位點(diǎn)的存在程度(記錄為被封閉的GPIIb/IIIa的平均百分?jǐn)?shù))，對(duì)由拮抗劑20μMADP引起的血小板凝聚的抑制的平均值，以及平均失血時(shí)間進(jìn)行了一系列的檢測。對(duì)由拮抗劑引起的受體的封閉和血小板的凝聚的測定基本上按照如上所述進(jìn)行(Gold，H.K.etal.，J.Clin.Invest.，86651-659(1990))。對(duì)于受體封閉的測定，在0時(shí)測定了受體的存在程度并將在此時(shí)所存在的受體數(shù)定義為被封閉受體為0％(基線)。其它時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值都是相對(duì)于該基線或給藥前的測量的受體存在數(shù)值。失血時(shí)間是用Simplate方法進(jìn)行的。圖6A-6C總結(jié)的是在按單一濃縮藥丸嵌合7E3Fab給藥之后2小時(shí)的劑量反應(yīng)，以受體封閉(圖6A)，血小板凝聚(圖6B)和失血時(shí)間(圖6C)來表示。在圖6A-6C中的實(shí)線表示的是在每一劑量組中的5名患者的平均值。隨著c7E3Fab劑量的提高，受體封閉也有逐步的提高，正如被封閉的受體的百分?jǐn)?shù)所顯示的那樣(圖6A)。在兩小時(shí)處的受體封閉的平均數(shù)值對(duì)0.15mg/kg為53.8％，對(duì)0.20mg/kg為80.2％，對(duì)0.25mg/kg為86.6％。受體封閉的增加伴隨著有對(duì)血小板凝聚抑制的增加，以對(duì)給藥前的數(shù)值的百分?jǐn)?shù)表示(圖6B)。在2小時(shí)處的平均血小板凝聚數(shù)值對(duì)0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各組分別為基線值的46.1％，44.6％和17.9％。同樣，在進(jìn)行了滲透后的2小時(shí)處也表現(xiàn)出與劑量有關(guān)的失血時(shí)間的延長(失血時(shí)間的測量僅取了30分鐘，圖6C)。失血時(shí)間對(duì)于0.15mg/kg，0.20mg/kg和0.25mg/kg各劑量分別為26.0分鐘，27.5分鐘和30分鐘。在所使用的條件下，以及根據(jù)這些檢測所得到的結(jié)果，對(duì)于抗血小板活性的最佳劑量被確定為0.25mg/kg。圖7A-7C表示的是單次濃縮藥丸劑量0.25mg/kg給藥后的作用時(shí)間，在該劑量觀測到最大的血小板效果。圖中的線表示的是從0時(shí)(基線)到24小時(shí)的平均數(shù)值，如圖在X軸上所示，上圖表示的是對(duì)受體的封閉(圖7A)，中圖表示的是對(duì)血小板凝聚(圖7B)的結(jié)果，下圖表示的是失血時(shí)間(圖7C)。在兩小時(shí)處見到了受體封閉，血小板凝聚和失血時(shí)間的效果峰值，并隨時(shí)間逐步回復(fù)。失血時(shí)間在12小時(shí)處回復(fù)到接近正常值。沒有任何一個(gè)患者發(fā)生血小板減少癥。對(duì)血小板功能的抑制(第二階段的結(jié)果)在第二階段中，GPIIb/IIIa受體和血小板凝聚的數(shù)據(jù)并沒有從所有患者中取得，在接受了24小時(shí)滲透的患者中，只從2名患者身上獲取了這些數(shù)據(jù)。因此，只總結(jié)了6小時(shí)和12小時(shí)的數(shù)據(jù)。在6小時(shí)和12小時(shí)滲透的組內(nèi)，受體封閉的平均值在整個(gè)滲透期間都保持在大于基線的80％的水平上。在2小時(shí)處，6小時(shí)和12小時(shí)滲透組內(nèi)的20μMADP引起的血小板凝聚的平均值分別為基線的13％和15％，并且，12小時(shí)組內(nèi)則在整個(gè)滲透期間內(nèi)都低于25％。對(duì)所有3個(gè)滲透期間的2小時(shí)平均失血時(shí)間都大于30分鐘。圖8給出的結(jié)果是在接受了0.25mg/kg劑量后又接受了12小時(shí)的10μg/分的嵌合7E3Fab連續(xù)滲透的患者的結(jié)果。12小時(shí)滲透所產(chǎn)生的結(jié)果在圖8中由淺色區(qū)表示，線條表示的是平均值。在整個(gè)的滲透期間內(nèi)，對(duì)受體的封閉程度，對(duì)血小板凝集的抑制程度以及對(duì)失血時(shí)間的延長都得到了保持，一旦中止了滲透則它們就開始恢復(fù)。表9從圖8A-8C中得出的平均數(shù)值0.25mg/kg+10μg/分12小時(shí)從起始滲透起平均失血時(shí)間平均凝聚平均結(jié)合計(jì)算的小時(shí)數(shù)(分)(％基線)(％基線)05.51000.023014.793.563022.489.11223.524.485.61813.961.172.9248.660.969.23614.575.060.6第一階段和第二階段患者的臨床效果在47名接受了c7E3Fab治療的患者中，沒有任何一個(gè)人在PTCA的過程中或之后經(jīng)歷了血栓。在所有47名接受了c7E3治療的人同中，除了2名以外，都成功地進(jìn)行了PTCA，正如血管造影所確定的那樣，將損傷減小到小于50％的血管直徑。在兩例不成功的擴(kuò)張患者中，01-012接受了將左前下冠狀動(dòng)脈的由90％狹窄減少到70％的擴(kuò)張，但是進(jìn)一步的擴(kuò)張是技術(shù)上無法實(shí)現(xiàn)的。第二名患者(患者01-019)，開始時(shí)進(jìn)行了成功的擴(kuò)張，但是隨后又對(duì)主要的縱向解剖(沒有明顯的血栓)放置了冠心內(nèi)的斯坦特(stent)。在9名對(duì)照人員中，有1名(01-022)在進(jìn)程15分鐘時(shí)發(fā)生了急性血栓封閉，需要進(jìn)行緊急冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)(CABG)，并得到復(fù)原。其他8名的對(duì)照患者都得到了成功的擴(kuò)張，使狹窄的部位被降低至50％或更少?；颊?1-019(12小時(shí)滲透組)接受了氣囊擴(kuò)張，使左回旋冠狀動(dòng)脈的95％的損傷被降低了50％。其后，該患者經(jīng)歷了明顯的血管迷走神經(jīng)的異常，導(dǎo)致了心動(dòng)過緩，低血壓，短暫的心搏停止。它被送回到導(dǎo)管插入室并且進(jìn)行了緊急的冠狀動(dòng)脈內(nèi)斯坦特安裝術(shù)。該斯坦特在左主冠狀動(dòng)脈發(fā)生了錯(cuò)位，該患者被送去進(jìn)行了緊急的冠心動(dòng)脈分流手術(shù)。根據(jù)調(diào)查的結(jié)果，沒有患冠心內(nèi)血栓的明顯跡象，不論是在血管造影中或是手術(shù)期中都是如此。該名患者還發(fā)生了周期發(fā)作的(peri-operative)心肌梗塞。術(shù)后8天該患者脫離危險(xiǎn)并恢復(fù)。有3名接受c7E3Fab治療的患者各自分別患有PTCA術(shù)后的胸部疼痛，程度并不一致?；颊?1-009(0.25mg/kg單一劑量組)在c7E3處理后9小時(shí)后發(fā)生胸痛，患者05-003(12小時(shí)滲透組)在接受了c7E321小時(shí)后發(fā)生了絞痛，患者06-003(12小時(shí)滲透組)在接受c7E3處理2天后發(fā)生心絞痛。調(diào)查結(jié)果表明，這些胸痛的表現(xiàn)與標(biāo)志著復(fù)發(fā)閉塞的局部缺血表征并不相關(guān)?；颊?2-004(0.25mg/kg單一劑量組)在接受c7E3Fab治療之前就患有長期的胸痛并在PTCA過程中繼續(xù)有胸痛。在術(shù)后的那一天ECG的變化以及伴隨著的心酶(前一天抽取)的升高表明這位患者經(jīng)歷了周期性(peri-procedural)非Q波心肌梗塞(肌酸酐激酶峰值＝462，MB分?jǐn)?shù)＝64)。在用c7E3Fab處理的52天時(shí)，受試組中發(fā)生一例死亡?；颊?6-002(6小時(shí)滲透組)患有間隙肺病，充血性心衰和非頑固性絞痛的病史，進(jìn)行過成功的近左下冠狀動(dòng)脈的PTCA術(shù)。在試驗(yàn)過程中，該患者發(fā)生了持續(xù)性的心室纖維性顫動(dòng)，兩次需要電除顫，此后，試驗(yàn)進(jìn)展順利。當(dāng)離開了導(dǎo)管室后，該患者又發(fā)生了藍(lán)視(癥)，并立即給予利尿劑和輸氧治療。然而，該患者隨后又發(fā)生了呼吸困難并需要呼吸輔助器。該患者隨后在醫(yī)院內(nèi)的情況變得更為復(fù)雜，包括膿毒癥、成年人呼吸系統(tǒng)壓迫綜合癥、貧血(進(jìn)行了多次輸血)、心臟局部缺血。該名患者在c7E3Fab治療后的第52天死于多重系統(tǒng)功能衰竭。安全性第一階段和第二階段圖9表示的是所有劑量組的患者在滲透終止后的從基線到24小時(shí)的血細(xì)胞比容的絕對(duì)變化值。在圖上標(biāo)出了變化為0的一條參照線。對(duì)照組中的一名患者(01-022)以及一名c7E3Fab治療的患者(01-019)的血細(xì)胞比容的數(shù)據(jù)并沒有在圖中表示出來，因?yàn)檫@兩名患者都在第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)需要進(jìn)行緊急冠心分流手術(shù)并輸血(見以下)。在-12處的第二條低線表明根據(jù)心肌梗塞血栓溶解(TIMI)標(biāo)準(zhǔn)被定義為少量出血的所需血細(xì)胞比容的變化(Raoetal.，J.Am.Coll.Cardiol.111-11(1988))。在對(duì)照的病人和所有c7E3Fab劑量組的病人之間的血細(xì)胞比容的變化是相似的。表10總結(jié)的是滲透終止后24小時(shí)血小板計(jì)數(shù)變化的平均值。血小板計(jì)數(shù)的變化在未接受治療的對(duì)照組和c7E3Fab治療組中具有相似的分布，并沒有明顯的與劑量相關(guān)的效果。表10滲透結(jié)束后24小時(shí)血小板計(jì)數(shù)平均變化值％劑量％變化范圍對(duì)照(n＝9)-0.7(-20.2，+13.2)0.15mg/kg(n＝5)-17.4(-24.5，+19.5)0.20mg/kg(n＝5)-11.6(-20.8，+4.7)0.25mg/kg(n＝5)+2.9(-8.9，+4.4)6小時(shí)*(n＝11)-7.7(-28.3，+19.4)12小時(shí)*(n＝11)0.0(-24.3，+24.4)24小時(shí)*(n＝10)-3.9(-9.0，+50.0)*注射濃縮藥丸劑量0.25mg/kg后c7E3Fab(10μg/分)的滲透時(shí)間對(duì)第一階段和第二階段結(jié)果的討論本研究的第一階段結(jié)果表明，c7E3在用阿斯匹林和肝素處理過的PTCA患者群中的劑量反應(yīng)特征與在劑量階梯試驗(yàn)(實(shí)施例3)中的頑固性心絞痛患者中的特征是相同的。嵌合7E3產(chǎn)生了血小板GPIIb/IIIa受體的劑量依賴性封閉，并且這種受體封閉與對(duì)血小板功能的抑制相關(guān)。此外，第二階段的結(jié)果表明，用連續(xù)滲透可以獲得對(duì)血小板Fab功能長達(dá)24小時(shí)的抑制效果。在所有的患者中，不論其滲透時(shí)間長短，停止?jié)B透后6-12小時(shí)就會(huì)發(fā)生血小板功能的恢復(fù)。c7E3處理的患者的臨床結(jié)果，從血管造影學(xué)或臨床終點(diǎn)的觀點(diǎn)來看，都比根據(jù)它們的危險(xiǎn)性的概況所預(yù)測的結(jié)果好得多。在c7E3處理的患者中，沒有任何人在此過程之中或之后發(fā)生血栓。此外，除2名患者以外，其他的患者都進(jìn)行了在血管造影學(xué)上為成功的治療。所有進(jìn)入第二階段的患者以及進(jìn)入第一階段的15名患者中的6名都是根據(jù)臨床或血管造影特征而被定義為高危險(xiǎn)性的患者。單個(gè)的臨床特征(例如非頑固性絞痛，糖尿病，婦女年齡大于65歲)或血管造影的損傷特異性特征(例如B型或C型)都使患者發(fā)生并發(fā)癥的危險(xiǎn)性被提高，多重這些因素的效果是相加性的。在第二階段中，被處理的患者中的17名患有非頑固性心絞痛并帶有或不帶有另外的臨床或血管造影損傷特異危險(xiǎn)特征。此外，在第一階段中的6名患者被確認(rèn)具有非頑固性心絞痛。在公開的文獻(xiàn)中，患有非頑固性心絞痛的患者發(fā)生重大并發(fā)癥(死亡，心肌梗塞，急性冠心血管分流或重復(fù)性PTCA)的發(fā)生率為10％～15％(DeFeyter，P.J.Editorial.Am.HeartJ.118860-868(1989)和Rupprecht，H.J.etal.EurHeartJ.11964-973，(1990))。血管造影特征同樣是對(duì)PTCA綜合癥有高度預(yù)測性的(Ellis，S.G.，1990，“Electivecoronaryangioplastytechniqueandcomplications”，InTextbookofInterventionalCardiology，E.J.Topol，Ed.，(W.B.SaundersCo.，Philadelphia)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990)；andACC/AHATaskForceReportGuidelinesforpercutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，J.Am.Coll.Cardiol.12529-545(1988))。29名第二階段c7E3處理的患者由于其損傷特異性特征而達(dá)到了該標(biāo)準(zhǔn)，其中的12名具有一個(gè)B型損傷，14名具有2個(gè)或更多個(gè)B型損傷，3名具有C型損傷。此外，在試驗(yàn)中的很多患者都接受了在一個(gè)或多個(gè)血管中的多重?fù)p傷的擴(kuò)張，因此而增加了本程序的潛在危險(xiǎn)性[Samson，M.etal.，Am.HeartJ.1201-12(1990)]。根據(jù)這些患者的血管造影學(xué)定義的高度的危險(xiǎn)因子的數(shù)目和程度，局部缺血并發(fā)癥的預(yù)測發(fā)生率在10％～20％的范圍內(nèi)[Ellis，S.G.Electivecoronaryangioplastytechniqueandcomplications，InTextbookofInterventionalCardiology，(Ed.E.J.Topol)，W.B.SaundersCo.，philadelphia(1990)；DeFeyter，P.J.，Circulation83927-936(1991)；Ellis，S.G.andTopol，E.J，Am.J.Cardiol.66932-937(1990)]。對(duì)照組中同樣包括高度危險(xiǎn)的患者。然而，一般而言，對(duì)照組患者中的危險(xiǎn)因子的數(shù)量和程度是較低的。9名對(duì)照患者中的5名具有單一的危險(xiǎn)因子，即一個(gè)B型損傷(4名患者)或非頑固性絞痛(1名患者)，而32名第二階段c7E3處理的患者中有26名具有C型損傷或兩種甚至更多的高度危險(xiǎn)特征。在這兩組之間，危險(xiǎn)程度上的不同是顯著差異的(Fisher’sexacttestp＝0.018)。非常有趣的是，對(duì)照組中具有急性堵塞(患者01-022，具有2個(gè)B型損傷特征的非頑固性絞痛)是被鑒定為具有多于一種危險(xiǎn)因子的3名患者之一(有一名對(duì)照患者具有未確認(rèn)的危險(xiǎn)特征)。因此，當(dāng)對(duì)照組3名高度危險(xiǎn)患者中的一名發(fā)生了血栓時(shí)，而同屬于這種最高危險(xiǎn)性的26名經(jīng)c7E3Fab處理的患者中卻沒有任何一人發(fā)生血栓。本研究還表明在那些已經(jīng)接受了靜脈注射肝素或口服阿斯匹林治療的患者中可以獲得用c7E3的安全有效的抗血小板效果。在對(duì)照組和c7E3處理的患者之間對(duì)比其失血現(xiàn)象，表明在各組的基線之間沒有血細(xì)胞比容變化的明顯差異。其它的副作用都不是經(jīng)常發(fā)生的，而且是中等程度和比較緩和的。在整個(gè)試驗(yàn)中發(fā)生了一例死亡，而且是在c7E3Fab治療后幾乎2個(gè)月時(shí)發(fā)生的，該患者患有間隙性肺病和心衰，并在PTCA后發(fā)生了呼吸困難且并發(fā)有膿毒病，成年人呼吸抑制綜合癥以及最后的多器官衰竭。最終，在所有那些得到了結(jié)果的20名患者中沒有任何一人發(fā)生了人抗嵌合抗體的免疫反應(yīng)?？偠灾?，嵌合7E3Fab可以對(duì)那些接受了阿斯匹林及靜脈注射肝素治療的患者在進(jìn)行PTCA時(shí)，產(chǎn)生安全有效的對(duì)血小板功能的抑制。這種抗血小板作用可以保持長達(dá)24小時(shí)，即不引起顯著的失血危險(xiǎn)性的增加，也不引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。在那些具有高度血栓并發(fā)癥危險(xiǎn)的患者中，在接受c7E3治療的組內(nèi)沒有發(fā)生血栓現(xiàn)象。這就表明c7E3可以在這些患者中降低血栓并發(fā)癥的危險(xiǎn)。實(shí)施例5在冠心血管成形術(shù)中治療急性堵塞在冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)中，急性冠狀動(dòng)脈堵塞是在這一手術(shù)中的決定其發(fā)病率和死亡率的主要因素，在選擇性的血管成形術(shù)案例中大約為3％～6％(Detre，K.M.etal.，Circulation82739-750(1991))，但是在那些因?yàn)榉穷B固性絞痛或發(fā)生了急性心肌梗塞而進(jìn)行血管成形術(shù)的患者中的發(fā)生率高達(dá)20％～40％(Ellis，S.G.etal.，Circulation77372-379(1988)；DeFeyter，P.J.etal.，Circulation83927-936(1991))。發(fā)生急性堵塞的機(jī)制是在進(jìn)行血管成形術(shù)時(shí)，在動(dòng)脈上所創(chuàng)造的或所延展的內(nèi)皮損傷區(qū)處發(fā)生的急性血栓而造成的。通常在這些位置由于血管的幾何形狀的變化而造成對(duì)血流形式的改變，一般都是由對(duì)斑塊的改動(dòng)而造成的，并且一般都有內(nèi)皮下邊的組織的暴露，例如內(nèi)膜和中間切開的部分的暴露。因?yàn)樵谛纬赡某跗谛枰“宓恼辰Y(jié)和凝聚，所以嵌合7E3Fab抗體片段被用來治療在冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)時(shí)發(fā)生的急性冠狀動(dòng)脈堵塞。案例患者是一位年齡為45歲的男性醫(yī)師，并且身體狀況一直非常良好。在他接受血管成形術(shù)一周前開始發(fā)生胸部和頸部的不適。當(dāng)這些病征持續(xù)數(shù)天并惡化后，他向其同事進(jìn)行咨詢。心電圖(EKG)結(jié)果揭示出前心T波的倒轉(zhuǎn)。該患者被送入當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的冠心病病房，靜脈注射硝酸甘油和肝素，并口服阿斯匹林。在此后的24小時(shí)內(nèi)對(duì)心異化酶進(jìn)行了一系列的測定，并沒有顯示出超出正常范圍。在此后的兩天內(nèi)數(shù)次心電圖記錄揭示了前心T波的持續(xù)性平緩，但是并沒有發(fā)生導(dǎo)致心肌梗塞的變化。住院的第二天，患者被送到心臟導(dǎo)管室，由左心室造影術(shù)揭示了左心室功能在整體上是正常的，但在左心室壁上的前外側(cè)有一個(gè)很小的運(yùn)動(dòng)減少區(qū)，同時(shí)在后下基底區(qū)也有一個(gè)運(yùn)動(dòng)減少區(qū)。左心室的泵血量為72％。冠狀動(dòng)脈造影顯示出以左側(cè)為主的冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)有一個(gè)很小的但是完全堵塞右冠狀動(dòng)脈的閉塞。在左側(cè)前下冠狀動(dòng)脈(LAD)的中間部位有一個(gè)明顯的狹窄。在該中間LAD狹窄處的遠(yuǎn)端有一個(gè)由此產(chǎn)生的斜向的很小的逐漸擴(kuò)展的病灶。該患者被送回到冠心病病房，并被連續(xù)靜脈注射硝酸甘油和肝素48小時(shí)。在此期間內(nèi)，他沒有感到病痛，心異化酶沒有升高，每目的心電圖僅揭示出其前心T波的持續(xù)性平緩。隨后該患者被轉(zhuǎn)移到Hermann醫(yī)院(Houston，TX)進(jìn)行血管成形術(shù)。在進(jìn)行血管成形術(shù)前，該患者還繼續(xù)接受靜脈注射硝酸甘油和肝素，口服阿斯匹林，并且開始口服鈣通道封閉劑。在以下的幾天內(nèi)，患者的部分促凝血酶原激酶的時(shí)間(PTT)是70-90秒。在開始對(duì)其進(jìn)行血栓成形手術(shù)時(shí)，活化的血凝塊時(shí)間(ACT)是173秒。給患者靜脈注射肝素5000單位，患者的左冠狀動(dòng)脈口與一個(gè)8號(hào)FrenchJL3.5導(dǎo)向?qū)Ч芟嘟印Ｓ梦矀?cè)右前斜向投像和顱側(cè)左前斜向投像觀察該LAD冠狀動(dòng)脈，對(duì)LAD首先放置0.018英寸多普勒導(dǎo)線(Cardiometrics，Inc.，MountainView，CA)。我們經(jīng)常使用這種導(dǎo)線對(duì)高度危險(xiǎn)性急性堵塞患者的血流進(jìn)行監(jiān)測。從LAD相對(duì)于損傷的遠(yuǎn)端和近端記錄到血流速度的信號(hào)。將一個(gè)2.5mm冠狀動(dòng)脈氣囊導(dǎo)管(Intrepid，Baxter，Inc.，Irvine，CA)通過多普勒導(dǎo)線送入，該多普勒導(dǎo)線是穩(wěn)定在冠狀動(dòng)脈處的。將該氣囊放置在跨騎在LAD損傷處的正確位置，然后對(duì)該氣囊以6個(gè)大氣壓的壓力進(jìn)行系列性短暫的充氣。這樣就使得該狹窄的程度被降低，正如從血管造影上以及從血管流量峰值(APV)由12cm/秒到33cm/秒的升高所觀察到的變化證實(shí)的那樣。在進(jìn)行這種擴(kuò)張以后幾分鐘的觀察中，發(fā)現(xiàn)該流速信號(hào)開始消失。注射對(duì)比劑后顯示了在該血管成形位點(diǎn)又發(fā)生了狹窄，即彈性回縮，斑點(diǎn)扭曲和形成了血栓。然后將氣囊再次深入到該損傷位點(diǎn)，再次進(jìn)行氣囊擴(kuò)張。使該動(dòng)脈得到了再次擴(kuò)展并使流速信號(hào)再次回到APV為34cm/秒的水平。在繼續(xù)監(jiān)視的幾分鐘內(nèi)，該信號(hào)再次降低。在5分鐘內(nèi)，該信號(hào)已達(dá)到相當(dāng)?shù)偷乃?，平均峰值速度?cm/秒。患者開始感到胸痛。心電圖對(duì)心前區(qū)電極的監(jiān)視揭示了ST部分的升高。血管造影顯示該動(dòng)脈被徹底地閉塞了。在此之前幾分鐘所獲得的活化凝血時(shí)間是344秒。然后給予血小板GPIIb/IIIa受體(c7E3Fab，γ1，κ)的特異性嵌合7E3單克隆抗體Fab片段，劑量為0.25mg/kg，1分鐘靜脈注射。此后約1-2分鐘，血流速度開始回升。注入對(duì)比劑后顯示了該冠狀動(dòng)脈開放的流速已經(jīng)被恢復(fù)并達(dá)到血栓溶解心肌梗塞試驗(yàn)的一級(jí)水平(TIMI1)。在此后的15分鐘期間內(nèi)，冠狀動(dòng)脈流量繼續(xù)回升并穩(wěn)定在APV為23cm/秒。以后又注射了幾次對(duì)比劑，證明冠狀動(dòng)脈流量確實(shí)得到了改善?；颊叩男赝粗饾u消失，由監(jiān)測電極所產(chǎn)生的ST部分回到了其基線部分。在使用了c7E3Fab15分鐘后，按照要求進(jìn)行了血管造影。其結(jié)果顯示了TIME3冠狀動(dòng)脈流動(dòng)。此時(shí)的流速信號(hào)為20cm/秒。在此后的5分鐘連續(xù)觀測中，沒有發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈流量的進(jìn)一步改善。在此期間內(nèi)的血管造影的錄像確認(rèn)了在該血管成形術(shù)位點(diǎn)處還有少量的血栓。因此，決定冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射250,000單位的尿激酶。這一血栓溶血?jiǎng)┰诖撕蟮拇蠹s10分鐘內(nèi)被滲透進(jìn)去。在此期間內(nèi)由多普勒導(dǎo)線測量確認(rèn)在流速上沒有進(jìn)一步的改善。當(dāng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射的尿激酶被完全滲透以后，即在使用了c7E3Fab后的第33分鐘時(shí)進(jìn)行了再一次的冠狀動(dòng)脈血管造影。該動(dòng)脈開放并達(dá)到TIMI3水平的流動(dòng)。在損傷位點(diǎn)還有一些中等程度的、殘余的狹窄繼續(xù)存在。此外，還可以觀察到血栓的尺寸進(jìn)一步縮小但并未被完全溶解。因此，決定再次進(jìn)行氣囊擴(kuò)張術(shù)，以減少殘存的狹窄。氣囊導(dǎo)管就再一次通過導(dǎo)線進(jìn)入到損傷的位點(diǎn)，然后以6個(gè)大氣壓進(jìn)行最后的氣囊擴(kuò)張2分鐘。此后，抽出氣囊導(dǎo)管，導(dǎo)線仍保留在原位置。流速信號(hào)升高到APV為29cm/秒，并在此水平上保持?jǐn)?shù)分鐘。此后的血管造影證實(shí)了該殘余狹窄被適當(dāng)?shù)販p小了。然后將導(dǎo)線抽回到該狹窄的近端，并再一次的記錄流速。抽出導(dǎo)線、氣囊導(dǎo)管和導(dǎo)向?qū)Ч?。該程序徹底完成。然后將該患者送回到冠心病病房。為了在未來的幾天使他的PTT保持在70-90秒的范圍內(nèi)，繼續(xù)給他口服阿斯匹林，硝酸鹽以及鈣通道封閉劑。此后的幾次心電圖(EKG)表明前心T波倒轉(zhuǎn)得到了緩解，此后的所有EKG都是正常的。此后幾次肌酸激酶(CK)異化酶值均為＜100U/L。在進(jìn)行PTCA之前血小板的計(jì)數(shù)是248,000，在接受了c7E3Fab之后的2小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)的血小板計(jì)數(shù)分別為304,000、279,000、246,000、185,000和220,000。由10μMADP引起的血小板凝聚在術(shù)前由光密度計(jì)測定為73％，在術(shù)后的2小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)分別為0％、13％、26％、45％和51％。血管成形術(shù)后一個(gè)星期對(duì)患者進(jìn)行了跟蹤導(dǎo)管檢測。其LAD冠狀動(dòng)脈是充分開放的并達(dá)到TIMI3級(jí)流量。在當(dāng)天的晚些時(shí)候允許他回家。病歷的討論該患者接受了0.25mg/kgc7E3Fab的靜脈注射，冠狀動(dòng)脈內(nèi)250,000單位尿激酶注射以及多次的擴(kuò)張治療，成功地治療了他的在冠狀動(dòng)脈血管擴(kuò)張術(shù)中發(fā)生的突發(fā)堵塞引起的急性的局部冠狀動(dòng)脈缺血綜合癥。這些結(jié)果表明抑制血小板糖蛋白IIb/IIIa受體結(jié)合以及血小板交連的抗血小板治療方法可以有效地幫助被急性閉塞的冠狀動(dòng)脈重新獲得穩(wěn)定的流通，并可以用于其它相似的臨床病例。實(shí)施例6防止高度危險(xiǎn)血管成形術(shù)局部缺血并發(fā)癥的抗GPIIb/IIIa嵌合抗體片段的隨機(jī)、雙盲評(píng)價(jià)概述自從1977年出現(xiàn)了冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后，經(jīng)皮心肌血管再造術(shù)就得到了迅速的發(fā)展(Gruentzig，A.R.etal.，N.Engl.J.Med.，3161127-1132(1987))。雖然這些手術(shù)能夠使局部缺血和生命的質(zhì)量得到改善(Parisi，A.F.etal.，N.Eng1.J.Med.，32610-16(1992))，急性并發(fā)癥仍舊是其主要的缺陷。在醫(yī)院的這些手術(shù)之中或其后發(fā)生的在被治療的血管上的突然閉塞的發(fā)生率為4％～9％，發(fā)生的重復(fù)閉塞及急性堵塞都相伴有相當(dāng)數(shù)量的發(fā)病率以及大約10倍的死亡率的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Tenaglia，A.N.etal.，Am.J.Cardiol，Inpress(1993)；Detre，K.M.etal.，Circulation，82739-750(1990)；Ellis，S.G.etal.，Circulation，77372-379(1988))。盡管血管上發(fā)生突然堵塞的機(jī)制通常都是無法確定的，但是血栓的形成以及血管的創(chuàng)傷都是其形成因素。使患者被確認(rèn)為具有高度急性并發(fā)癥危險(xiǎn)的特征，包括與冠狀動(dòng)脈血栓(非頑固性絞痛，急性的或近期的心肌梗塞)、糖尿病、女性及冠狀動(dòng)脈形態(tài)特征(彎曲點(diǎn)，血栓，分叉)相關(guān)的臨床癥狀，表明患者損傷的復(fù)雜性的增加(Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.17(SupplB)89B-95B(1991)；Moushmoush，B.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，2797-103(1992)；andMyler，R.K.etal.，circulation，82(Supp1II)II-88-II-95(1990))。盡管阿斯匹林已經(jīng)顯示出可以降低患者在接受血管成形術(shù)時(shí)發(fā)生急性血管堵塞和急性心肌梗塞的危險(xiǎn)程度(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988)；Barnathon，E.S.etal.，Circulation，76125-134(1987))。但是，它對(duì)血小板功能的作用相對(duì)來說較弱，而且在接受了阿斯匹林的那些高度危險(xiǎn)的患者中繼續(xù)發(fā)生局部失血的發(fā)生率為10％～20％(Tenaglia，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol，(1993，inpress))。相反，對(duì)患者給予嵌合7E3抗體的Fab片段就獲得了對(duì)GPIIb/IIIa受體的實(shí)質(zhì)上的封閉，并且抑制了血小板的凝聚(見實(shí)施例4，血小板功能的抑制)。在對(duì)進(jìn)行血管成形術(shù)的患者的初期研究中，c7E3Fab降低了在進(jìn)行經(jīng)皮手術(shù)之中或之后發(fā)生急性血管堵塞的危險(xiǎn)性(見實(shí)施例4和Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，4167-75(1993))。現(xiàn)在進(jìn)行的隨機(jī)性的研究是為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)對(duì)GPIIb/IIIa受體為特異性的嵌合抗體片段在防止局部缺血并發(fā)癥時(shí)的效率(EPIC實(shí)驗(yàn)，c7E3Fab防止局部缺血并發(fā)癥的評(píng)價(jià))。特別是對(duì)c7E3Fab在接受血管成形術(shù)的具有高度并發(fā)癥危險(xiǎn)的患者中的臨床效果，用預(yù)期的、雙盲的、安慰劑控制的、隨機(jī)臨床的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該實(shí)驗(yàn)包括在56個(gè)地區(qū)的2099名患者，他們按計(jì)劃要進(jìn)行冠心血管成形術(shù)或定向性冠狀動(dòng)脈癍塊切除術(shù)，并具有以下的臨床高度危險(xiǎn)情況重度非頑固性絞痛并伴有靜止痛感和心電圖的變化，急性心肌梗塞、臨床的和冠狀動(dòng)脈損傷形態(tài)特征并伴有高度的并發(fā)癥危險(xiǎn)?；颊邆兘邮芰?a)安慰劑的濃縮藥丸及滲透，(b)c7E3Fab的濃縮藥丸和安慰劑滲透，或(c)c7E3Fab的濃縮藥丸及其滲透。主要終點(diǎn)(Primaryendpoint)是一種復(fù)合情況，包括發(fā)生下列情況中的任何一種死亡、非致命性心肌梗塞、計(jì)劃外的血管再造手術(shù)或重復(fù)的經(jīng)皮手術(shù)、計(jì)劃外的冠狀動(dòng)脈斯坦特植入術(shù)或?qū)︻B固性局部缺血進(jìn)行主動(dòng)脈內(nèi)氣囊泵插入術(shù)。在主要終點(diǎn)處的濃縮藥丸和滲透的降低效果是35％(12.8vs8.3％，P＝0.008)，而獨(dú)自使用濃縮藥丸的降低效果是11％(12.8vs11.4％，P＝0.43)。使用濃縮藥丸加上滲透的降低效果對(duì)每一個(gè)終點(diǎn)成分都是一致的，另外，在大部分患者的按年齡、性別、已經(jīng)患有冠狀動(dòng)脈血管血栓，急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(心肌梗塞、非頑固性絞痛的)所分的亞組中也是一致的。在使用了濃縮藥丸和其滲透的組中，失血現(xiàn)象及輸血現(xiàn)象是增加的，而僅使用濃縮藥丸時(shí)是中等程度的。這一實(shí)驗(yàn)揭示了用抗體片段直接抑制血小板IIb/IIIa受體能夠通過明顯降低局部缺血并發(fā)癥而獲得延續(xù)的臨床效果。方法根據(jù)前述對(duì)常規(guī)經(jīng)皮手術(shù)的危險(xiǎn)性所做的研究，患者如果有發(fā)生急性血管堵塞的高度危險(xiǎn)并且沒有由于高度失血危險(xiǎn)而造成的禁忌，那么，他們就是合適的患者。被認(rèn)為是高度危險(xiǎn)的患者是被分在下列三組之一的患者(1)在開始進(jìn)行了直接的或“搶救性”經(jīng)皮手術(shù)時(shí)，發(fā)生在12小時(shí)內(nèi)的急性心肌梗塞；(2)不論采用了何種藥物治療，在此前24小時(shí)發(fā)生了早期梗塞后絞痛或非頑固性絞痛并伴有至少兩次靜止絞痛的發(fā)作以及靜止心電圖的改變；(3)根據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)/美國心臟病學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)制定的臨床和/或血管造影標(biāo)準(zhǔn)為高度危險(xiǎn)患者(Ryan，T.J.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-45(1988))，該標(biāo)準(zhǔn)被修飾(Ellis，S.G.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17(SupplB)89B-95B(1991))。這些高度危險(xiǎn)的臨床和血管造影的標(biāo)準(zhǔn)包括在目標(biāo)損傷處有兩個(gè)B型特征或一個(gè)C型特征，或在65歲以上婦女或患糖尿病的患者中有一個(gè)B型特征。該標(biāo)準(zhǔn)具體條件如下(I)建議采用美國食品藥物和管理局(FDA)批準(zhǔn)的裝置對(duì)下列一種情況進(jìn)行選擇性或急性的冠狀動(dòng)脈血管氣囊成形術(shù)或癍塊切除(A)非頑固性絞痛和/或非Q波心肌梗塞，其定義如下1)靜止絞痛在靜止時(shí)有兩次或更多次絞痛并伴有局部缺血性ST部分或T波的異常；或2)復(fù)發(fā)性絞痛在住院期間對(duì)常規(guī)藥物治療無效并伴有局部缺血性ST部分或T波的異常的復(fù)發(fā)性絞痛；3)早期梗塞后的絞痛在記錄有心肌梗塞后的7天內(nèi)的絞痛，伴隨有靜止時(shí)的絞痛以及局部缺血性ST部分或T波的異常；或由最低量的勞累引起的絞痛(2梅脫)，其中，短暫的ST部分或T波的異常的定義如下a)≥1mmST部分的壓低(在J點(diǎn)后80毫秒)或升高(J點(diǎn)后20毫秒處)，和/或b)T波的改變(通常為倒轉(zhuǎn))，其中，在所有的患者的入選時(shí)，他們的肌酸轉(zhuǎn)移酶(CK)比正常水平低2倍。(B)急性Q波心肌梗塞1)在心肌梗塞發(fā)生并且在此之前沒有接受溶血治療時(shí)，進(jìn)行直接的手術(shù)，或2)對(duì)心肌梗塞進(jìn)行溶血治療失敗后進(jìn)行搶救性血管成形術(shù)，其中，所接受的心肌梗塞被定義為具有如下所述的3種情況中的至少2個(gè)(1)延長性心絞痛(長于30分鐘)；(2)總肌酸轉(zhuǎn)移酶的升高超過正常水平上限的2倍以上(由CK-MB異化酶的升高來證實(shí))；(3)心肌梗塞的心電圖(ECG)證據(jù)，定義如下a)ST部分升高至少0.1mV(在J點(diǎn)以后0.2秒處測定)發(fā)生在下述3個(gè)位置中的至少一處i)3個(gè)下電極之中的2個(gè)(II、III、aVF)；或ii)6個(gè)心前電極中的至少2個(gè)(V1-V6)；或iii)電極I和aVL；或iv)心前電極V1-V4ST部分的壓低與傷后或后期心電相一致(鏡子法則)；或v)在左側(cè)支動(dòng)脈有堵塞，在下或前電極的主要ST發(fā)生變化；b)新的顯著的Q波≥0.04秒或其深度≥相應(yīng)的R放大波的1/4，或同時(shí)具有兩者。(C)高度臨床/形態(tài)學(xué)危險(xiǎn)特征1)在要擴(kuò)張的動(dòng)脈處具有兩個(gè)或更多B型損傷特異特征的狹窄。損傷特異性特征依據(jù)的是ACC/AHA標(biāo)準(zhǔn)；2)在要擴(kuò)張的動(dòng)脈處的具有一個(gè)或更多個(gè)C型特征的狹窄；3)年齡≥65歲的婦女并帶有至少一個(gè)B型特征的狹窄；4)糖尿病患者并在要進(jìn)行擴(kuò)張的動(dòng)脈處具有至少一個(gè)B型特征的狹窄；或5)發(fā)生了由CK-MB異化酶升高而證實(shí)的心肌梗塞并在7天內(nèi)對(duì)由梗塞所造成的損傷進(jìn)行了血管成形術(shù)。(II)年齡在18～80歲之間的男性，不具懷孕潛力的年齡在18～80歲之間的女性(進(jìn)行了絕育手術(shù)或絕經(jīng)，定義為絕經(jīng)至少一年以上)。(III)在開始進(jìn)行規(guī)范化的專項(xiàng)手術(shù)和給予所研究的試劑之前有書面文件表示同意。其它條件適合但由于以下任何一種原因而被排出本實(shí)驗(yàn)的患者(1)具有出血素質(zhì)的病史；(2)在入選前6星期曾經(jīng)做過重大手術(shù)；(3)近期(入選前6星期內(nèi))曾有臨床上為顯著的胃腸道或生殖泌尿系統(tǒng)的出血；(4)入選前2年內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生過中風(fēng)或有中風(fēng)所遺留下來的明顯的神經(jīng)缺陷；(5)左主冠狀動(dòng)脈發(fā)生＞50％的閉塞；(6)被推斷為或被證實(shí)為有脈管炎病史；(7)在接受計(jì)劃的受試藥劑的滲透之前的七天內(nèi)，曾經(jīng)參加了其它的受試藥物評(píng)價(jià)的臨床研究的患者；(8)在隨機(jī)研究藥劑的服用前七天內(nèi)，曾經(jīng)口服過抗凝聚藥物的患者，除非在隨機(jī)服藥之前所服用的凝血酶原的份量≤對(duì)照劑量的1.2倍；(9)在進(jìn)行血管成形術(shù)之前或者計(jì)劃在該手術(shù)中靜脈注射葡聚糖；(10)有曾經(jīng)服用過鼠單克隆抗體或已知對(duì)鼠蛋白過敏的歷史；或(11)不能提供書面同意文件。在所有的試驗(yàn)機(jī)構(gòu)中，都從其試驗(yàn)審核委員會(huì)獲得了他們的批準(zhǔn)，并且從所有的患者獲得了書面的同意。受試患者的篩選工作是在1991年12月～1992年11之間完成的；共在美國的56所試驗(yàn)機(jī)構(gòu)中選取了2099名患者。研究規(guī)則所有的患者都接受阿斯匹林和肝素的治療。程序開始至少2小時(shí)前口服何斯匹林劑量為325mg，并在其后還保持每天325mg的劑量。肝素(豬)是以初始劑量為10,000～12,000單位靜脈給藥并接著進(jìn)行每15分鐘給予至多3,000單位，但是其總量不超過20,000單位，目的是為了使活化的凝塊時(shí)間保持在“治療”范圍內(nèi)，一般在程序中為300～350秒(Dougherty，K.G.etal.，Abstractsofthe63rdScientificSessions，III-189(1991)；Rath，B.etal.，Br.Heart.J.，6318-21(1990)；OgilbyJ.D.etal.，Cath.Cardiovasc.Diag.，18206-9(1989))。然后繼續(xù)將肝素以每小時(shí)1,000單位的速率連續(xù)輸入12小時(shí)。根據(jù)臨床的要求，還可以按靜脈注射或冠狀動(dòng)脈內(nèi)給藥硝酸鹽。嵌合7E3Fab(γ1，κ)是以含有每毫升0.15M氯化鈉，0.01M磷酸鈉和0.001％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂80，pH7.2的無菌非熱原性溶液含2毫克單克隆Fab的形式使用的。在出院時(shí)患者所需要的唯一的藥品是每天325mg阿斯匹林。將患者隨機(jī)等分到三個(gè)雙盲研究組內(nèi)。其中的一個(gè)組的患者以劑量為0.25mg/kg接受c7E3Fab的濃縮藥丸，然后以10μg/分的劑量連續(xù)12小時(shí)滲透c7E3Fab。第二組的患者接受劑量為0.25mg/kg的c7E3Fab濃縮藥丸，然后連續(xù)12小時(shí)滲透安慰劑溶液。第三組接受安慰劑藥丸和12小時(shí)的安慰劑溶液連續(xù)滲透。濃縮藥丸的使用是在程序開始前至少10分鐘進(jìn)行的，并且是以5分鐘的時(shí)間完成的，所進(jìn)行的滲透都是12小時(shí)的，除非發(fā)生了臨床上的不良反應(yīng)。在病人出院以前，分別在給藥后的30分鐘、2小時(shí)、12和24小時(shí)對(duì)血壓的血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行測定以檢查血小板減少癥的證據(jù)。對(duì)威脅生命的失血以及血小板減少癥用一種事先設(shè)計(jì)好的算法進(jìn)行評(píng)價(jià)和處理(Sane，D.C.etal.，Ann.Intern.Med.，1111010-22(1989))。該方法的守則中沒有關(guān)于紅血細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)木唧w指示；因而實(shí)際上進(jìn)行的輸血是按照各個(gè)地點(diǎn)的當(dāng)?shù)貙?shí)踐方式進(jìn)行的。血管成形術(shù)是按照標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)則進(jìn)行的。在程序前以及程序后進(jìn)行的血管造影都是在冠狀動(dòng)脈內(nèi)給以150-300μg硝酸甘油并進(jìn)行了冠狀動(dòng)脈舒張以后完成的。在此程序之后，血管鞘在結(jié)束了研究藥劑的滲透后保持至少6小時(shí)。此外，將血管鞘繼續(xù)保持在該位置直至肝素滲透結(jié)束后的至少4小時(shí)以及直至達(dá)到了可接受的被激發(fā)的部分促凝血酶原激酶時(shí)間從而保持止血。研究終點(diǎn)一個(gè)獨(dú)立的臨床終點(diǎn)委員會(huì)審核了那些可能代表著研究終點(diǎn)或主要負(fù)作用現(xiàn)象的所有情況。這個(gè)委員會(huì)在整個(gè)研究期間對(duì)具體處理方法是一無所知的，隨后審核了病例記錄、心電圖以及所需要的相關(guān)的醫(yī)療記錄。對(duì)每一事件的確定需要兩個(gè)審核委員的一致意見。該實(shí)驗(yàn)的主要終點(diǎn)是一個(gè)復(fù)合的臨床終點(diǎn)結(jié)果，包括在隨機(jī)選擇后的第一個(gè)30天內(nèi)發(fā)生了任何一種下列情況(1)由任何原因?qū)е碌乃劳觯?2)非致命性心肌梗塞；或(3)緊急救護(hù)(a)第二次血管成形術(shù)。重復(fù)經(jīng)皮救護(hù)以治療復(fù)發(fā)的急性局部缺血(氣囊血管成形術(shù)和癍塊切除)。按預(yù)定計(jì)劃進(jìn)行的(例如，階段性的程序)都不屬于終點(diǎn)事件；(b)冠狀動(dòng)脈分流術(shù)。緊急(非選擇性)手術(shù)搶救以治療復(fù)發(fā)的急性局部缺血；(c)插入冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)斯坦特(stent)。將冠狀動(dòng)脈內(nèi)斯坦特放置在能夠使被擴(kuò)張了的血管保持立即開放的位置；或(d)插入主動(dòng)脈內(nèi)的對(duì)抗搏動(dòng)的氣囊泵。對(duì)于那些被認(rèn)為不屬于重復(fù)血管成形術(shù)或手術(shù)搶救的患者的復(fù)發(fā)性局部缺血放置氣囊泵。在本研究中，“開放”的定義是TIMI2-3級(jí)流量并且手術(shù)醫(yī)生可以用肉眼觀察到小于或等于50％的狹窄，但心電圖又沒有局部缺血證據(jù)。終點(diǎn)心肌梗塞的定義如下1.在隨機(jī)取樣的并在24小時(shí)內(nèi)發(fā)生心肌梗塞的患者中，為了確診隨后發(fā)生的非致命性梗塞需要對(duì)兩種酶進(jìn)行測定(a)肌酸激酶(CK)或肌酸激酶MB比正常值的上限至少高三倍，代表著從前一個(gè)“谷”升高至少33％(其定義為從前一個(gè)峰值降低了25％但是又保持在比正常的上限至少高2倍的水平上)；或(b)在前一個(gè)峰值降低了50％并且其“谷”值小于正常上限的兩倍之后或CK-MB升高了至少100％并保持在正常上限3倍以上的水平上。用記錄的新的長時(shí)間絞痛(長于2分鐘)并伴隨著心肌酶的再次升高的現(xiàn)象來確定再次梗塞的起始時(shí)間。在沒有記錄到絞痛的情況下，再次梗塞的起始時(shí)間就被定義為緊接著前一個(gè)新的酶的升高之后所測定到的低谷的時(shí)間。定義，僅適用于這樣的患者，即在參加本研究時(shí)所發(fā)生的心肌梗塞后24小時(shí)之內(nèi)有復(fù)發(fā)性絞痛和/或酶的低谷值開始發(fā)生的患者。在所有的病例中都使用的是CK-MB水平，除非無法獲得這些數(shù)據(jù)，在這種情況下就使用肌酸激酶全值代替之。2.在那些發(fā)生了急性梗塞24后或者最近未發(fā)生梗塞的進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)的患者中，要將其確診為需要住院的心肌梗塞就要達(dá)到下列兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)(a)在兩個(gè)或更多個(gè)臨近的電極上的新的Q波≥0.04秒，深度比相應(yīng)的R波＞1/4；或(b)CK-MB值至少大于正常上限的3倍，并且在該水平是一個(gè)≥前一個(gè)“谷”值50％的增長。在本定義中，那些在進(jìn)入本研究時(shí)帶有急性心肌梗塞的患者發(fā)生再次梗塞的起始時(shí)間是產(chǎn)生新的長時(shí)間絞痛(長于20分鐘)的時(shí)間，或是在新的酶的升高之前測定到酶的低谷水平的時(shí)間。要想使本定義可用于實(shí)際，這兩個(gè)時(shí)間從初始梗塞時(shí)算起都必須大于24小時(shí)。3.出院后要想被確診為心肌梗塞，必須達(dá)到下述兩個(gè)條件中的一個(gè)(a)在兩個(gè)或更多個(gè)相鄰的電極上的新的Q波≥0.04秒，或深度比相應(yīng)的R波＞1/4，或兩者同時(shí)發(fā)生；或(b)CK或CK-MB水平比正常的上限高2倍。主要終點(diǎn)的另一個(gè)要點(diǎn)是需要進(jìn)行緊急的重復(fù)手術(shù)，定義為計(jì)劃外的送回到血管成形病房進(jìn)行手術(shù)；主要終點(diǎn)并不包括按計(jì)劃進(jìn)行的階段性程序。相似的，僅把用于治療復(fù)發(fā)性局部缺血或失敗了的血管成形術(shù)的緊急冠狀動(dòng)脈手術(shù)算作主要終點(diǎn)。當(dāng)為了治療在血管成形術(shù)時(shí)發(fā)生的急性血管堵塞以及為了消除發(fā)生這一情況的危險(xiǎn)性而將斯坦特放置在冠心內(nèi)時(shí)，才將這種斯坦特的放置算作主要終點(diǎn)。為了對(duì)沒有進(jìn)行重復(fù)的血管再造術(shù)的患者的復(fù)發(fā)性局部缺血而放置主動(dòng)脈內(nèi)氣囊泵時(shí)，才將這種主動(dòng)脈內(nèi)氣囊泵的放置認(rèn)作是主要終點(diǎn)。失血現(xiàn)象可以劃分為嚴(yán)重、輕度及非顯著性，依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)是血栓溶解在心肌梗塞中的研究(ThrombolysisinMyocardialInfarctionStudyGroupcriteria)(Rao，A.K.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111-11(1988))。嚴(yán)重失血的定義是顱內(nèi)失血或血紅蛋白的降低大于5g/dl的失血(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時(shí)，依據(jù)血細(xì)胞比容降低至少15％)。輕度失血要么是自發(fā)的并有大量尿血或嘔血，并伴有血紅蛋白的降低大于3g/dl(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時(shí)，依據(jù)血細(xì)胞比容降低至少10％)，或當(dāng)無法確定失血位點(diǎn)時(shí)，血紅蛋白的降低大于4g/dl(或當(dāng)無法測定血紅蛋白時(shí)，依據(jù)血細(xì)胞比容降低至少12％)。在那些接受了輸血的患者中，將其所輸血的單位數(shù)累加到所觀察到的血細(xì)胞比容的降低并除以3的數(shù)值上，以確定血細(xì)胞的總降低數(shù)量并進(jìn)而確定是否有嚴(yán)重或輕度的失血發(fā)生(Landefield，C.S.etal.，Am.J.Med.，82703-13(1987))。數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)通過公爵大學(xué)(DukeUniversity)的數(shù)據(jù)采集中心用電話隨機(jī)對(duì)患者進(jìn)行采訪。隨機(jī)性是按照研究地點(diǎn)以及患者是否患有正在發(fā)展的急性心肌梗塞而進(jìn)行的區(qū)分，基于以前的數(shù)據(jù)，選取了一組為2100名患者的樣品組群，為的是確定主要終點(diǎn)的33％的降低(在安慰劑組群中預(yù)計(jì)為15％)并且其乘方為0.8，α＝0.05。這些數(shù)據(jù)被研究調(diào)查員記錄到病歷表格上，并且在數(shù)據(jù)輸入前由本研究的盲點(diǎn)監(jiān)察人員進(jìn)行監(jiān)察。本研究的主持人對(duì)于隨機(jī)抽樣的密碼以及研究結(jié)果一直為盲目的，直至所有的患者都被選擇完畢，并且所有終點(diǎn)都被臨床終點(diǎn)委員會(huì)進(jìn)行了判斷時(shí)為止。在下表中，基線特征對(duì)于連續(xù)的可變值是以平均值和第25和第75百分分布來表示的，而對(duì)于間斷的可變值是用百分?jǐn)?shù)來表示的。對(duì)試驗(yàn)中的主要終點(diǎn)進(jìn)行了分析，即考慮在開始實(shí)驗(yàn)后30天內(nèi)第一次發(fā)生任何一種構(gòu)成終點(diǎn)的現(xiàn)象的時(shí)間。如果在此30天的期間內(nèi)未發(fā)生這些現(xiàn)象，在30天以后就對(duì)患者進(jìn)行追蹤調(diào)查。對(duì)每一試驗(yàn)的Kaplan-Meier存活曲線被用來圖示出結(jié)果(Kaplan，E.L.etal.，J.Am.Stat.Assn.，53457-81(1958))。所有試驗(yàn)相互間的比較是用以治療為目的的原則(intention-to-treat)而進(jìn)行的。對(duì)于主要終點(diǎn)而言，進(jìn)行了測定趨勢(劑量反應(yīng))的對(duì)數(shù)級(jí)別的試驗(yàn)(log-ranktest)，將僅接受了濃縮藥丸的患者認(rèn)作是接受了濃縮藥丸和滲透組的患者的中間值(Kalbfleisch，J.D.andR.L.Prentice，TheStatisticalAnalysisofFailureTimeData，JohnWilleyandSons，NewYork(1980))。如果對(duì)趨勢的檢測是顯著性的，那么就在對(duì)照組和每一個(gè)c7E3Fab組之間進(jìn)行成對(duì)的對(duì)數(shù)級(jí)別的比較。當(dāng)從1/3或2/3的患者中可獲得有關(guān)數(shù)據(jù)時(shí)，就進(jìn)行安全性的臨時(shí)分析。在每一個(gè)臨時(shí)分析中，對(duì)劑量反應(yīng)的檢測的顯著性是用極小的α水平來判定的，即預(yù)先設(shè)定使總體的I型的誤差率≤0.05。在最終的分析中，這種比較的顯著性水平是0.036。在最終的分析中，也使用了相似的策略(測定趨勢，然后進(jìn)行成對(duì)的比較)，以探查對(duì)組成終點(diǎn)的各個(gè)不同成分的治療方法之間的關(guān)系，雖然這些比較主要是用來對(duì)這些現(xiàn)象進(jìn)行解釋的。在失血綜合癥的治療的最終分析中也使用了這種策略，采用的是X平方檢測。在主要分組(年齡、性別、體重、臨床亞組)中的治療效果的置信區(qū)間和差異率進(jìn)行了計(jì)算并表示出來。結(jié)果患者組中的基線臨床特征表明對(duì)這些患者進(jìn)行血管成形術(shù)時(shí)發(fā)生急性并發(fā)癥的危險(xiǎn)很高，因?yàn)樗麄冎虚g糖尿病患者、近期心肌梗塞患者、高齡以及帶有入選標(biāo)準(zhǔn)中的損傷特征的婦女的數(shù)量很高(見表11)。大多數(shù)的患者都曾經(jīng)有過一種或兩種血管疾病，但是左心室功能還是正常的。在表12中給出的是手術(shù)程序的詳情。對(duì)于每一種治療方案來說沒有見到明顯的差異。表13給出的是總體主要終點(diǎn)的結(jié)果以及其組成情況。與安慰劑組相比，c7E3Fab顯示出了分級(jí)的效果(P＝0.009)，在僅使用了濃縮藥丸的組中的綜合事件的發(fā)生率被降低了11％(P＝0.43)，在使用了濃縮藥丸以及滲透的組中的事件的發(fā)生率被降低了35％(P＝0.008)。在表13中的其它的最重要的局部缺血終點(diǎn)也觀察到相同的分級(jí)效果。因此，存留的GPIIb/IIIa封閉就降低了非致命性梗塞和進(jìn)行緊急冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)及緊急經(jīng)皮血管再造手術(shù)的頻率。而在僅使用濃縮藥丸時(shí)所產(chǎn)生的短時(shí)間的封閉存在著發(fā)生上述事件的非顯著性的一種傾向。在使用了濃縮藥丸和滲透的組中發(fā)生了3例死亡，這3位病人都是在進(jìn)行隨機(jī)抽樣后但又在接受藥物治療之前死亡的。盡管如此，這些死亡事件都根據(jù)以治療為目的的原則而包括在本分析中。由于c7E3Fab可以防止非致命性局部缺血現(xiàn)象，因此對(duì)非致命性心肌梗塞的嚴(yán)重程度的預(yù)防是非常有意義的。正如在表14中所示，c7E3Fab防止了Q波梗塞以及帶有酶的大量升高的梗塞，并且顯示出了劑量反應(yīng)的效果。表11基線特性安慰劑組濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(N＝708)年齡(年)+62(53，69)61(52，68)63(53，69)男性(％)737271體重(kg)848282危險(xiǎn)因素(％)糖尿病262323高血壓555554高膽固醇575955吸煙657168血管疾病(％)外周的999大腦的344曾患過MI(％)無343030＞30天2528278-30天131314＜8天282929進(jìn)程前血管成形術(shù)252022分流術(shù)151416冠狀解剖(％)1血管疾病5451552血管疾病2934313血管疾病161513MI＝心肌梗塞+中間值(第25，75百分分布)表12手術(shù)程序細(xì)節(jié)安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)程序(％)氣囊血管成形術(shù)909090癍塊切除545上述兩者565在手術(shù)室的時(shí)間(分鐘)+134(71，394)129(75，401)141(69，513)使用的對(duì)照(mL)+200(150，286)200(150，277)200(150，285)血栓溶解劑(％)3.23.72.3最低的ACT(秒)271(190，345)284(190，371)285(185，388)ACT＝活化的血凝塊時(shí)間+中間值(第25，75百分分布)表13主要發(fā)生事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透劑量反應(yīng)(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值主要終點(diǎn)*89(12.8％)79(11.4％)59(8.3％)0.009主要終點(diǎn)的組成死亡12(1.7％)9(1.3％)12(1.7％)+0.96非致命性MI60(8.6％)43(6.2％)37(5.2％)0.013緊急PTCA31(4.5％)25(3.6％)6(0.8％)＜0.0001緊急CABG25(3.6％)16(23％)17(2.4％)0.177斯坦特4(0.6％)12(1.7％)4(0.6％)0.97氣囊泵1(0.1％)1(0.1％)1(0.1％)0.99*P＝0.009對(duì)于趨勢的總體試驗(yàn)P＝0.43安慰劑組與濃縮藥丸組的比較P＝0.008安慰劑組與濃縮藥丸及滲透組的比較+3名死亡的患者被納入這一組，但實(shí)際上沒有接受治療MI＝心肌梗塞；PTCA＝經(jīng)皮血管造橋術(shù)或癍塊切除；CABG＝冠狀動(dòng)脈分流術(shù)表14c7E3Fab對(duì)心肌梗塞的效果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透劑量反應(yīng)(N＝696)(N＝695)(n＝708)P值Q波MI(％)2.30.90.80.018大的非Q波MI(％)4.02.42.80.197小的非Q波MI(％)2.32.91.60.342總值(％)8.66.25.20.013MI＝心肌梗塞大的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值＞5倍的正常上限；小的非Q波MI的定義是CK-MB的峰值或總的CK值在正常上限3～5倍之間。在3個(gè)組中需要進(jìn)行緊急重復(fù)性血管再造手術(shù)的非致命性局部缺血事件的發(fā)生時(shí)間是不同的，并且可以被準(zhǔn)確地確定下來(見圖10)。在安慰劑組中大部分的事件發(fā)生在進(jìn)行了引導(dǎo)程序后的數(shù)小時(shí)內(nèi)，而在使用了濃縮藥丸的組中其發(fā)生的時(shí)間是在數(shù)小時(shí)以后(約6～12小時(shí))，相應(yīng)于對(duì)受體達(dá)到最大封閉的時(shí)間。在同時(shí)使用了濃縮藥丸和滲透的組中，局部失血現(xiàn)象的發(fā)生時(shí)間被明顯地推遲了，而且它們的絕對(duì)發(fā)生頻率也被明顯地降低了。表15給出的是在住院期間失血并發(fā)癥的輪廓情況。如同對(duì)主要終點(diǎn)的效果一樣，也明顯地存在著對(duì)失血治療的分級(jí)效果。接受了濃縮藥丸以及滲透的患者顯示出在失血率及輸血率上的明顯的升高，而在僅接受了濃縮藥丸的患者中只顯示了中等程度的升高。大部分的失血現(xiàn)象是發(fā)生在冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)時(shí)，或在腹股溝血管穿刺的位點(diǎn)，雖然它們的血管修復(fù)手術(shù)的分布情況是基本相等的(在安慰劑組和接受了濃縮藥丸以及滲透的組中為1％，在僅接受了濃縮藥丸的組中為2％)。相似地，在6名患者身上發(fā)生了顱內(nèi)失血現(xiàn)象，2例發(fā)生在安慰劑組中，1例發(fā)生在僅接受了濃縮藥丸的組中，3例發(fā)生在接受了濃縮藥丸以及滲透的組中，其中的一人并沒有接受藥物治療，因?yàn)樗娘B內(nèi)失血現(xiàn)象是在進(jìn)行了隨機(jī)抽樣以后但是在進(jìn)行血管成形術(shù)之前發(fā)生的。表15失血并發(fā)癥和血液學(xué)測量安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸+滲透(N＝696)(N＝695)(n＝708)嚴(yán)重失血(％)*46(7％)76(11％)97(14％)輸血**紅細(xì)胞49(7％)92(13％)109(15％)血小板18(3％)29(4％)39(6％)血計(jì)數(shù)Nadir血細(xì)胞比容↑35(32，38)34(29，38)33(29，37)Δ血細(xì)胞比容↑5.3(3.2，7.9)6.5(4.2，9.8)6.8(4.1，10.5)指數(shù)↑1.8(1.1，2.7)2.2(1.4，3.5)2.3(1.4，3.8)Nadir血小板↑196(159，240)194(153，236)193(154，231)血小板計(jì)數(shù)24(3.5％)29(4.2％)42(5.9％)＜100,000*P＝0.001**P＜0.001↑中間值(第25，75百分分布)在這些治療結(jié)果中，次級(jí)臨床癥狀發(fā)生的頻率很低并沒有很大的差別。在安慰劑組、濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組中的情況分別是30天心衰發(fā)生率(2.3％，2.4％，2.3％)，持續(xù)的低血壓(3.0％，3.6％，4.1％)，心室纖維性顫動(dòng)(3.0％，2.6％，3.4％)以及臨床局部缺血的發(fā)生率(21％，17％，18％)。當(dāng)把患者按照急性梗塞、非持續(xù)性絞痛或高度解剖性危險(xiǎn)分組治療以評(píng)價(jià)c7E3Fab的效果時(shí)(參見圖11)，在所有3個(gè)選定的組內(nèi)都見到了c7E3Fab的有益效果。相似地，其效果在按年齡或性別所分的亞組中都是相同的。雖然其效果對(duì)體重較大的患者更為明顯，但是作為體重的一個(gè)函數(shù)，c7E3Fab濃縮藥丸及滲透的有益效果在整個(gè)患者群中都是存在的。在僅接受了濃縮藥丸的患者中以及接受了濃縮藥丸和滲透的患者中，發(fā)生嚴(yán)重失血的危險(xiǎn)性在較輕體重的患者中高于體重較重的患者。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對(duì)于體重最輕的患者來說，發(fā)生嚴(yán)重失血的數(shù)字分別是21％、15％和7％，而在體重最重的患者中相應(yīng)地分別為8％、7％和7％。在接受了濃縮藥丸及滲透的組、僅接受了濃縮藥丸的組和安慰劑組的患者中，對(duì)于體重最輕的患者來說，接受了輸血的患者的數(shù)字分別是24％、20％和11％，而在體重最重的患者中相應(yīng)地分別為11％、7％和4％。討論這些結(jié)果確認(rèn)了血小板、推測的血小衍生的調(diào)節(jié)子和血小板功能對(duì)于那些進(jìn)行經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈成形術(shù)的患者在發(fā)生急性局部缺血的情況下的重要性。在設(shè)計(jì)EPIC試驗(yàn)時(shí)，特別考慮了要選擇一組具有高度發(fā)生急性血管堵塞(復(fù)發(fā)性堵塞)和其相伴隨的并發(fā)癥的危險(xiǎn)的患者。對(duì)于以前的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以表明有些患者可以被認(rèn)定為是具有高度危險(xiǎn)的患者，依據(jù)的是他們的臨床血栓病癥，例如急性梗塞(Stack，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，111141-49(1988))，嚴(yán)重的非延續(xù)性絞痛(Myler，R.K.etal.，Circulation，82(SupplII)II-88-II-95(1990))，或血管造影顯示了血栓(Sugrue，D.D.etal.，Br.HeartJ.，5662-66(1986)；Hettleman，B.D.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，15154A(1990))。其他的患者也是高度危險(xiǎn)的，依據(jù)的是生理上的因素，例如血管口徑窄小，滲血或血管形態(tài)畸形(Sinclair，I.N.etal.，Am.J.Cardiol.，6161G-66G(1988)；Ruocco，N.A.etal.，Am.J.Cardiol.，6969-76(1992)；Ellis，S.G.etal.，Am.J.Cardiol.，6330-4(1989))。在本試驗(yàn)中，這兩類患者都有相當(dāng)數(shù)量參加了本試驗(yàn)，使得我們能夠進(jìn)一步了解對(duì)每一類患者抑制血小板凝聚的內(nèi)在關(guān)系。收取這些高度危險(xiǎn)的患者被認(rèn)為會(huì)使發(fā)生局部缺血現(xiàn)象在安慰劑組中的發(fā)生率為15％，盡管對(duì)每一位患者都給予了阿斯匹林和大劑量的肝素，這一預(yù)測的缺血發(fā)生率幾乎與現(xiàn)實(shí)相一致。c7E3Fab使得組成事件的發(fā)生率降低了35％，其主要效果見于進(jìn)行緊急血管成形術(shù)或緊急冠狀動(dòng)脈分流術(shù)的需要以及非致命性心肌梗塞都被有效地降低了。c7E3Fab的濃縮藥丸延遲了這些事件的起始時(shí)間，相應(yīng)于對(duì)血小板凝聚的有效作用時(shí)間。然而，過了4～6小時(shí)以后，開始發(fā)生局部缺血現(xiàn)象。這一時(shí)間間隔相應(yīng)于在給予鼠c7E3Fab濃縮藥丸之后，血小板凝聚恢復(fù)到其初始值的約50％時(shí)的時(shí)間間隔。除了延遲效果外，聯(lián)合使用對(duì)血小板產(chǎn)生長效抑制的(見實(shí)施例4)濃縮藥丸和滲透還能夠防止急性局部缺血事件的發(fā)生。組成終點(diǎn)提供了對(duì)在進(jìn)行血管成形術(shù)期間的局部缺血現(xiàn)象的這種治療方法的總體評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)中最重要的發(fā)現(xiàn)之一是在不同的終點(diǎn)時(shí)的緩解效果的一致性。對(duì)心肌梗塞的緩解是實(shí)質(zhì)性的，并且與同時(shí)的對(duì)此后需要進(jìn)行緊急臨床搶救的降低是一致的。就經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈術(shù)的評(píng)價(jià)而言，對(duì)非致命性梗塞的分類是一項(xiàng)重要的任務(wù)。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)肌酸激酶MB異化酶高于正常上限，在所報(bào)導(dǎo)的情況中有4％～21％的患者發(fā)生了這種情況(Klein，L.W.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17621-6(1991)；Hunt，A.C.etal.，Eur.HeartJ.，12690-3(1991)；Pauletto，P.etal.，Am.J.Cardiol.，69999-1000(1987)；Spadaro，J.J.etal.，Cath.Cardiovasc.Diagn.，12230-4(1986))。當(dāng)這些酶的升高并不與相應(yīng)的臨床癥狀完全一致時(shí)，就沒有記載到出現(xiàn)長期的有害結(jié)果。因此，防止那些沒有伴隨著臨床局部缺血事件的孤立的酶的升高就可能不具有非常深遠(yuǎn)的意義。為了保證在這一模糊區(qū)的客觀性，就要有系統(tǒng)地采集酶和心電圖數(shù)據(jù)，采用盲點(diǎn)終點(diǎn)委員會(huì)，并且要確認(rèn)心肌梗塞就要求心肌特異性酶的提高至少要達(dá)到3倍以上。c7E3Fab降低所有情況的心肌梗塞，包括那些伴隨著中等程度的酶的升高、大量的酶的升高和產(chǎn)生Q波的心肌梗塞這一現(xiàn)象，再次確認(rèn)了那些被防止的病狀的臨床重要性，特別是進(jìn)行緊急冠狀動(dòng)脈再造手術(shù)的需要也被降低了。雖然沒有預(yù)期到也沒有觀察到對(duì)死亡率的作用，但因注意的是在濃縮藥丸和滲透組內(nèi)有3名沒有接受藥物的患者死亡。根據(jù)以治療為目的的原則，將這些死亡事件在主要分析中進(jìn)行處理。所有的其他的死亡的患者都實(shí)際上接受了為他們選定的治療。由于與血管成形術(shù)所伴隨的死亡率很低，因此要確認(rèn)對(duì)死亡率產(chǎn)生25％有益或有害治療效果，就需要進(jìn)行對(duì)20,000名以上的患者的試驗(yàn)。GPIIb/IIIa受體封閉對(duì)在高度危險(xiǎn)的血管成形手術(shù)中的臨床終點(diǎn)的有益效果是令人信服的，并且與近期開始進(jìn)行的用同樣的抗體在復(fù)發(fā)性非持續(xù)性絞痛患者的血管成形術(shù)的實(shí)驗(yàn)的良性結(jié)果相一致(Simoons，M.L.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21269A(1993))。由于本試驗(yàn)是第一次的大規(guī)模的IIb/IIIa受體封閉試驗(yàn)，因此就存在著對(duì)其引起血小板減少癥的危險(xiǎn)的關(guān)注。然而c7E3Fab僅產(chǎn)生了很小的、臨床上非顯著的血小板減少癥的增加。特別是，對(duì)這一試驗(yàn)結(jié)果的分析揭示出在接受了濃縮藥丸及滲透的治療組內(nèi)有更多的患者(5.2％)發(fā)生了血小板減少現(xiàn)象(血小板計(jì)數(shù)＜100,000/μL)，高于濃縮藥丸治療組(3.6％)和安慰劑組(3.4％)。因此，與安慰劑組相比，在濃縮藥丸及滲透處理組中的血小板減少現(xiàn)象的發(fā)生(血小板計(jì)數(shù)＜100,000/μL)被提高了(P＝0.062)。嚴(yán)重的血小板減少癥(血小板計(jì)數(shù)＜50,000/μL)發(fā)生在濃縮藥丸及滲透處理組中的11名患者中(1.6％)，在安慰劑組中有5名(0.7％)患者發(fā)生了這一現(xiàn)象。在濃縮藥丸及滲透組和安慰劑組中各僅有4名患者(＜1％)同時(shí)發(fā)生血小板減少癥和嚴(yán)重的、危及生命的或致死性負(fù)作用。所有的血小板減少癥的情況都是短暫的，并且一般都發(fā)生在最初的幾天內(nèi)。在治療的患者中，失血并發(fā)癥和輸血都有明顯的增加。這一增加主要是在股穿刺位點(diǎn)的失血的結(jié)果，并且在這3組中都沒有導(dǎo)致Nadir血細(xì)胞比容或危及生命的并發(fā)癥的明顯的變化。無論是否將進(jìn)行手術(shù)的患者包括或不包括在本分析中，這些趨勢都保持不變。在本盲點(diǎn)研究中，由于對(duì)所采用的治療方案的不確定性，就可能導(dǎo)致在某些試驗(yàn)地區(qū)出于對(duì)止血的關(guān)心而降低了進(jìn)行輸血的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)我們以往的經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)得到證實(shí)的是經(jīng)過重新修訂的用于處理失血和對(duì)接受了溶血?jiǎng)┑幕颊哌M(jìn)行輸血的守則，可以有效地減少使用血制品(Wall，T.C.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，21597-603(1993))。作為體重函數(shù)的治療效果與失血危險(xiǎn)之間的相互作用實(shí)際上比預(yù)期的更為復(fù)雜。雖然在安慰劑組患者中主要癥狀的發(fā)生率和嚴(yán)重失血的危險(xiǎn)性依據(jù)體重的變化是很小的，但是在c7E3Fab濃縮藥丸組和濃縮藥丸及滲透組的患者中非常清楚地存在著隨體重的降低而發(fā)生主要結(jié)果癥狀的增高和嚴(yán)重失血增高的趨勢。在進(jìn)行經(jīng)皮血管擴(kuò)張術(shù)之前、之中或之后對(duì)患者臨床采用本封閉GPIIb/IIIa受體的方法的判定要依據(jù)避免局部缺血現(xiàn)象對(duì)給予的血產(chǎn)品的相對(duì)平衡值來決定。在參加本試驗(yàn)的高度危險(xiǎn)的患者中，這一平衡表現(xiàn)出對(duì)患者是有益的。急性心肌梗塞和緊急重復(fù)血管擴(kuò)張術(shù)的預(yù)后影響是嚴(yán)重的，幸運(yùn)的是，進(jìn)行輸血的要求繼續(xù)下降(Donahue，J.G.etal.，N.Engl.J.Med.，327369-73(1992)；Dodd，R.Y.N.Engl.J.Med.，327419-21(1992)；Nelson，K.E.etal.，Ann.Intern.Med.，117554-9(1992))。努力采用降低不必要的失血和輸血以及更有效地使用抗血栓劑的實(shí)際計(jì)算方法，包括抗血栓劑和抗血小板劑，應(yīng)該可以進(jìn)一步提高在本試驗(yàn)中所觀察到的臨床效果。在實(shí)踐中，對(duì)那些帶器械的患者給予有效的、非腸道抗血栓劑時(shí)，必須注重依其體重來調(diào)節(jié)抗血栓藥劑的劑量(例如，肝素的劑量在此并不依據(jù)體重而進(jìn)行調(diào)節(jié))。在所有參加本試驗(yàn)的地區(qū)內(nèi)采用更加詳細(xì)的確定降低失血的方法的守則和評(píng)價(jià)方法，可以獲取更多的關(guān)于失血并發(fā)癥發(fā)生的信息。在患者群中，廣泛的有效治療的一致性是血栓形成在很多患者中為更重要因素的強(qiáng)有力的證據(jù)，盡管在某些病例中突然阻塞可能是血栓性的或生理性的。由濃縮藥丸劑所產(chǎn)生的對(duì)發(fā)病的延遲以及由濃縮藥丸和滲透共同產(chǎn)生的對(duì)發(fā)病的防止，都意味著在大多數(shù)情況下受到損害的動(dòng)脈的表面都在本程序之后的18～24小時(shí)喪失了其血栓形成功能。實(shí)際治療方案中應(yīng)該考慮到在有高度危險(xiǎn)發(fā)生急性血管堵塞的患者中對(duì)持續(xù)的抗血栓效果的需求?？偠灾?，本試驗(yàn)表明了在進(jìn)行高度危險(xiǎn)的經(jīng)皮血管擴(kuò)張手術(shù)的患者中提供有效的、持續(xù)的對(duì)GPIIb/IIIa受體的封閉可以降低和/或防止復(fù)發(fā)性閉塞及突發(fā)性堵塞。雖然這一有益效果的獲取是以增加失血的危險(xiǎn)性為代價(jià)的，但是基于臨床的和本程序前所做的血管造影的預(yù)測，對(duì)于那些患有急性局部缺血并發(fā)癥危險(xiǎn)的病人采取這種治療方法所得到的總體臨床效果則是對(duì)患者有益的。本試驗(yàn)首次為抑制細(xì)胞組分的功能提供了真實(shí)有效、意義深遠(yuǎn)的治療方法，并為將來在生物技術(shù)上選擇其它的細(xì)胞組分(integrin)目標(biāo)以及對(duì)這一特異性GPIIb/IIIa采取非抗體的或多肽方法鋪設(shè)了寬廣的道路。實(shí)施例7冠狀動(dòng)脈手術(shù)后早期使用抗GPIIIb/IIIa嵌合抗體片段降低臨床復(fù)發(fā)性狹窄在進(jìn)行了氣囊血管成形術(shù)或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈手術(shù)后發(fā)生的重復(fù)狹窄是極為常見的，在術(shù)后的6個(gè)月內(nèi)，有25％的病例導(dǎo)致了絞痛癥狀的重復(fù)發(fā)生以及需要重復(fù)進(jìn)行血管擴(kuò)張術(shù)，其總的花費(fèi)在美國每年高于20億美元(Popma，J.J.etal.，Circulation，841426-1436(1991)；Topol，E.J.etal.，Circulation，871489-1497(1993)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993))。重復(fù)狹窄的主要生物學(xué)起因是血管壁的損傷，由擴(kuò)張的氣囊或手術(shù)器械在手術(shù)位點(diǎn)造成，以及伴隨著的血小板凝聚的形成和內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞從它們的休止與收縮狀態(tài)到可移動(dòng)、繁殖和分泌功能狀態(tài)的表形上的改變(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729(1993))。盡管已經(jīng)有不同的藥物制劑在調(diào)節(jié)血管壁損傷后的特征性肌內(nèi)膜生長的試驗(yàn)中為成功性的，而且小型研究也建議它們可帶來在血管造影上的有益效果，但是迄今為止還沒有一個(gè)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)在患者中證實(shí)了藥劑的有效性，而且也沒有已知的能夠降低這些病狀的藥物治療(Popma，J.J.etal.，Circulation.841426-1436(1991)；Herrman，J.-P.R.etal.，Drugs，46249-262(1993)；MercatorStudyGroup，Circulation，86100-110(1992))。冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)是一種常規(guī)手術(shù)并輔助于口服阿斯匹林和靜脈內(nèi)注射肝素。然而，這種抗血栓方法只能對(duì)血小板的凝聚產(chǎn)生很弱的抑制。很多不同的拮抗劑包括凝血酶、膠原蛋白和二磷酸腺苷都可以激發(fā)血小板，甚至在有阿斯匹林存在時(shí)也是如此。對(duì)血小板的分子生物學(xué)的研究已經(jīng)闡明了GPIIb/IIIa組分是負(fù)責(zé)血小板凝聚的受體(Plow，E.F.etal.，Prog.Hemostas.Thromb.，296320-331(1988)；Coller，B.S.J.Clin.Invest.，76101-108，(1985))。嵌合7E3抗體的Fab片段，選擇性地與血小板的IIb/IIIa組分結(jié)合。當(dāng)最初的研究確認(rèn)了嵌合單克隆抗體Fab片段的初步安全性和有效性后，就在2,099名患者中進(jìn)行了多中心、雙盲、安慰劑控制的試驗(yàn)(見實(shí)施例6)。除了在急性狀態(tài)下的嚴(yán)重局部缺血現(xiàn)象得到降低的主要有效終點(diǎn)，即代表著對(duì)急性堵塞的抑制(見實(shí)施例6)之外，還確定了c7E3能夠降低臨床重復(fù)狹窄的發(fā)生，正如在其后6個(gè)月的追蹤期內(nèi)的局部缺血或進(jìn)行重復(fù)血管擴(kuò)張的需要的結(jié)果而證實(shí)的那樣。方法本研究的人群和守則的詳情都如實(shí)施例6中所述。簡而言之，合適的病人是指曾經(jīng)進(jìn)行過冠狀動(dòng)脈成形或定向性癍塊切除并正在發(fā)生或近斯內(nèi)發(fā)生過心肌梗塞、非頑固性絞痛或高度危險(xiǎn)的血管造影損傷形態(tài)的患者，正如美國心臟學(xué)會(huì)/和美國心內(nèi)科學(xué)院的標(biāo)準(zhǔn)所定義的那樣(ACC/AHATaskForceReport，J.Am.Coll.Cardiol.，12529-545(1988))。排除的原則是失血性素質(zhì)、年齡≥80歲、近兩年內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生過中風(fēng)或在過去的6周內(nèi)曾進(jìn)行過重大手術(shù)。該守則在所有56個(gè)參加的地點(diǎn)都得到了該處的學(xué)術(shù)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且或得了所有的患者的同意?；颊呖诜⑺蛊チ?325mg/天)，第一次服藥是在程序開始的至少2小時(shí)前進(jìn)行。靜脈注射肝素是在程序中進(jìn)行的，為的是獲得至少300秒的活化凝血塊的時(shí)間。除了阿斯匹林和肝素以外，患者隨機(jī)地被給予下述3種處理中的一種(1)安慰劑濃縮藥丸和12小時(shí)的安慰劑滲透；(2)0.25mg/kg的活性c7E3(Centocor，Malvern，PA)的濃縮藥丸和12小時(shí)的安慰劑滲透；或(3)同樣劑量的活性c7E3濃縮藥丸并隨后立即進(jìn)行12小時(shí)的10μg/分的c7E3滲透。濃縮藥丸的服用是在冠狀動(dòng)脈手術(shù)程序開始前的10分鐘進(jìn)行的。主要終點(diǎn)是30天內(nèi)的任何一種原因造成的死亡，其原因有心肌梗塞、對(duì)急性局部缺血進(jìn)行的冠狀動(dòng)脈分流術(shù)、對(duì)急性局部缺血進(jìn)行重復(fù)的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈手術(shù)，為了治療局部缺血而進(jìn)行主動(dòng)脈內(nèi)的氣囊泵放置和腔內(nèi)斯坦特。所有這些現(xiàn)象都由一個(gè)獨(dú)立的臨床終點(diǎn)委員會(huì)來進(jìn)行審核，該委員會(huì)在整個(gè)研究期間內(nèi)是盲目的，而且對(duì)每一癥狀進(jìn)行分類時(shí)至少得有2個(gè)審查委員的一致意見。在隨后的6個(gè)月的追蹤期內(nèi)繼續(xù)保持雙盲。除了隨后的死亡或致命性心肌梗塞之外對(duì)患者們進(jìn)行追蹤，以確定進(jìn)行包括經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈手術(shù)或冠狀動(dòng)脈分流術(shù)或進(jìn)行這兩種手術(shù)的重復(fù)性血管擴(kuò)張的需要。與急性階段終點(diǎn)不同，放入斯坦特或在主動(dòng)脈內(nèi)置入氣囊泵都不被包括在這一結(jié)果內(nèi)，因?yàn)楸痉椒ㄋ⒅氐氖沁M(jìn)行血管擴(kuò)張的需要，而不是作為突然局部缺血的替代品。出院后的心肌梗塞的確診的條件是兩個(gè)或更多個(gè)相鄰的電極上有新的顯著的Q波≥0.04秒或比相應(yīng)的R放大波的深度≥1/4的深度；或者肌酸激酶或肌酸激酶心肌帶超過正常上限的2倍以上。收集血管擴(kuò)張的數(shù)據(jù)以及最初的目標(biāo)血管是否經(jīng)過了重復(fù)的手術(shù)或經(jīng)皮血管擴(kuò)張的數(shù)據(jù)。追蹤的完成率是97.2％。為了評(píng)價(jià)6個(gè)月的調(diào)查結(jié)果是否與緊急階段的結(jié)果不同，在所進(jìn)行的分析中就包括了從開始到6個(gè)月期間的所有發(fā)病情況，接受了成功的早期手術(shù)的患者的30天終點(diǎn)以后的發(fā)病情況(其定義為根據(jù)臨床醫(yī)生的檢測證實(shí)獲得了最后的狹窄小于50％并且沒有局部失血并發(fā)癥)，以及接受了成功的早期手術(shù)的患者的48小時(shí)以后的發(fā)病情況。對(duì)于30天終點(diǎn)的選擇依據(jù)的是以前的很多心血管手術(shù)試驗(yàn)的病例。以48小時(shí)為一階段點(diǎn)，是因?yàn)橐阎x限定的幾乎所有的冠狀動(dòng)脈手術(shù)后的急性堵塞病狀都是在這一個(gè)期間內(nèi)發(fā)生的(Detre，K.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，13230A(1989)；Lincoff，A.M.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，19926-938(1992)；deFeyter，P.J.etal.，Circulation，83927-936(1991))。通過公爵大學(xué)(DukeUniversity)的數(shù)據(jù)采集中心用電話隨機(jī)對(duì)患者進(jìn)行采訪。隨機(jī)性是按照研究地點(diǎn)以及患者是否患有急性心肌梗塞而進(jìn)行的區(qū)分。這些數(shù)據(jù)被研究調(diào)查員記錄到6個(gè)月的病歷表格上，并且在數(shù)據(jù)輸入前由本研究的盲點(diǎn)監(jiān)察人員對(duì)表格的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)察。本研究的主持人對(duì)于隨機(jī)抽樣的密碼以及追蹤調(diào)查結(jié)果一直為盲目的，直至所有的追蹤調(diào)查完畢，并且所有的病例都被臨床終點(diǎn)委員會(huì)進(jìn)行了判斷，從而完成了數(shù)據(jù)庫的建立。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的治療之間的比較都是按以治療為目的的原則進(jìn)行的。對(duì)發(fā)病率的評(píng)價(jià)采用了Kaplan-Meier方法(Kaplan，E.L.andP.Meier，J.Am.Stat.Assn.，53457-481(1958))，并且以存活曲線用圖示的方法表示其結(jié)果。采用常規(guī)化的對(duì)數(shù)級(jí)別統(tǒng)計(jì)方法(log-rankstatistic)對(duì)安慰組、濃縮藥丸組、濃縮藥丸及滲透組的發(fā)病率進(jìn)行了劑量反應(yīng)的檢測(結(jié)果分別為0，1和2)。對(duì)安慰劑組與采用了c7E3的各組之間的比較也采用了對(duì)數(shù)級(jí)別統(tǒng)計(jì)的方法。部分危害模型(Proporstionalhazardsmodels)(Cox)適用于判定起始病征與結(jié)果之間是否存在著因果關(guān)系的檢驗(yàn)。這些都是結(jié)合了治療差異模式在所有的治療組中進(jìn)行的，并且對(duì)各治療組分別進(jìn)行了檢驗(yàn)以確定他們之間的差異。此外，部分危害回歸模式(Proporstionalhazardsregressionmodels)(Cox)適用于所有的在48小時(shí)追蹤后的組成終點(diǎn)以判定那些與后來發(fā)生的病狀或治療效果有關(guān)的因子。本分析中的這些因子包括治療方案，進(jìn)行過血管擴(kuò)張的單一損傷或多重?fù)p傷，治療期間的長短，在開始時(shí)的心肌梗塞或非頑固性絞痛或其它的高度危險(xiǎn)的入選病狀，性別，年齡≥65歲或＜65歲，體重以及糖尿病。結(jié)果病人的選取從1991年12月1日開始直到1992年11月18日截止，共選擇了2099名患者。在整個(gè)研究中的各種特征都在以上給出了(見實(shí)施例6，表10)。表16給出的是那些曾經(jīng)進(jìn)行了成功的先期血管成形術(shù)或癍塊切除術(shù)并使他們能夠入選為以后發(fā)生臨床重復(fù)狹窄的患者的初始病癥。在那些曾經(jīng)進(jìn)行了成功的先期手術(shù)的患者的起始病癥中并沒有由于治療方案而造成的顯著差異。表16進(jìn)行過成功的先期手術(shù)的患者的人口學(xué)特征安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透(N＝609)(N＝605)(N＝620)年齡(年)60.0±10.359.7±10.460.2±10.6性別(％)430(71.7％)434(71.7％)445(71.8％)體重(公斤)84.9±16.083.5±16.583.3±15.7危險(xiǎn)因素(％)糖尿病155(25.8％)146(24.1％)139(22.4％)高血壓321(53.7％)329(54.8％)314(50.8％)高膽固醇316(52.7％)337(55.7％)324(523％)吸煙377(64.7％)428(71.8％)423(69.5％)血管疾病外周的47(7.9％)52(8.7％)52(8.5％)大腦的21(3.5％)19(3.1％)27(4.4％)曾經(jīng)患過MI(％)無275(45.8％)239(39.5％)253(40.8％)＞30天109(18.2％)126(20.8％)128(20.6％)8-30天45(7.5％)55(9.1％)57(9.2％)＜8天171(28.5％)185(30.6％)182(29.4％)進(jìn)程前血管成形術(shù)145(24.3％)121(20.0％)139(22.6％)分流術(shù)88(14.7％)85(14.0％)95(15.3％)冠狀解剖(％)1血管疾病337(56.2％)324(53.6％)354(57.1％)2血管疾病170(28.3％)198(32.7％)191(30.8％)3血管疾病93(15.0％)83(13.7％)75(12.1％)手術(shù)種類氣囊540(90.0％)549(90.7％)561(90.5％)癍塊切除(atheretomy)37(6.2％)27(4.5％)34(5.5％)上述兩者23(3.8％)29(4.8％)25(4.0％)目標(biāo)血管LAD241(40.2％)229(37.9％)262(42.3％)LCX1.44(24.0％)1.59(26.3％)1.65(26.6％)RCA234(39.0％)253(41.8％)219(35.3％)LeftMain4(0.7％)1(0.2％)3(0.5％)移植35(5.8％)35(5.8％)43(6.9％)接受了c7E3濃縮藥丸的患者以及接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者們都顯示了明顯的失血并發(fā)癥的升高，主要發(fā)生在第一個(gè)48小時(shí)內(nèi)，并且其輸血率幾乎增加了一倍(安慰劑組7％，濃縮藥丸且13％，濃縮藥丸及滲透組15％，P＜0.001)。12小時(shí)的連續(xù)滲透在下述患者中沒有進(jìn)行完全，安慰劑組中48名患者(7.0％)，濃縮藥丸組85名患者(12.5％)，濃縮藥丸及滲透組患者107名(15.8％)。在接受了c7E3的患者中沒有見到血小板減少癥或過敏反應(yīng)的升高。人抗嵌合抗體(HACA)的陽性反應(yīng)在濃縮藥丸組中為5.2％，在濃縮藥丸及滲透組中為6.5％。大多數(shù)產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的患者都是低效價(jià)的反應(yīng)。濃縮藥丸組中產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的全部32名患者的效價(jià)都≤1∶1600。濃縮藥丸及滲透組中產(chǎn)生陽性HACA反應(yīng)的全體40名患者中的34名的效價(jià)都≤1∶1600。在濃縮藥丸及滲透組中有6名患者的HACA效價(jià)在1∶6400與1∶51200的范圍內(nèi)，而在濃縮藥丸組中沒有發(fā)生這種現(xiàn)象。到30天時(shí)，與安慰劑組(12.8％，P＝0.009)相比，接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者(8.3％)中的嚴(yán)重局部缺血現(xiàn)象(死亡，心肌梗塞，急性血管擴(kuò)張術(shù))被降低了35％(見實(shí)施6，表13)。表17給出的是6個(gè)月的數(shù)據(jù)，其中有死亡、心肌梗塞、以及需要進(jìn)行冠狀動(dòng)脈分流術(shù)或重復(fù)性冠狀動(dòng)脈手術(shù)的結(jié)果，并且伴隨針對(duì)下列各種情況的血管擴(kuò)張手術(shù)(a)所有入選的患者，(b)入選后的48小時(shí)內(nèi)沒有局部缺血并發(fā)現(xiàn)象但又進(jìn)行了成功的治療的患者，和(c)那些進(jìn)行了成功的先期治療并在第一個(gè)30天內(nèi)沒有發(fā)生病癥的患者。到6個(gè)月時(shí)局部缺血現(xiàn)象和血管擴(kuò)張手術(shù)被降低了23％(27％對(duì)35％，P＝0.001；見表17，所有入選的患者，死亡、MI、CABG、PTCA)。造成這種有益的長期效果的主要原因是在那些進(jìn)行了先期成功的手術(shù)的患者中降低了對(duì)再次進(jìn)行分流手術(shù)或血管成形術(shù)的需要，正如重復(fù)進(jìn)行的目標(biāo)血管擴(kuò)張?jiān)赾7E3濃縮藥丸及滲透組中(16.4％)與安慰劑組中(22.3％)相比所顯示的被降低而證實(shí)(P＝0.007；見表17)。在僅采用了濃縮藥丸的組的結(jié)果，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)而言并沒有產(chǎn)生比安慰劑組強(qiáng)很多的結(jié)果，并且是非顯著性的。在另外的一個(gè)分析中，對(duì)所有的在30天內(nèi)沒有經(jīng)歷主要病狀的患者的6個(gè)月的數(shù)據(jù)進(jìn)行了研究。這一分析的結(jié)果列于表18。這些數(shù)據(jù)指出在那些接受了c7E3濃縮藥丸及滲透的患者中，需要進(jìn)行重復(fù)性血管擴(kuò)張術(shù)的患者降低了21％。表176個(gè)月的結(jié)果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝696)(N＝695)(N＝708)所有受試患者死亡(％)3.42.63.00.827MI(％)10.58.06.90.016CABG(％)11.09.79.40.339PTCA(％)20.819.814.30.001復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)35.032.426.90.001任何血管擴(kuò)張術(shù)(CABG/PTCA)(％)29.427.223.10.008目標(biāo)血管重復(fù)擴(kuò)張(％)22.320.816.40.007所有進(jìn)行了成功的手術(shù)的患者在48小時(shí)(N＝606)(N＝618)(N＝639)死亡(％)2.72.33.00.664MI(％)2.62.42.50.860CABG(％)7.67.47.00.701PTCA(％)16.417.211.50.010復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)25.324.119.10.007任何血管擴(kuò)張術(shù)(CABG/PTCA)(％)23.022.518.00.025(所有患者)(N＝636)(N＝655)(N＝666)目標(biāo)血管重復(fù)擴(kuò)張(％)18.9％18.4％15.6％0.134所有進(jìn)行了成功的手術(shù)的患者在30天(N＝549)(N＝576)(N＝598)死亡(％)1.71.31.50.789MI(％)2.01.91.70.716CABG(％)5.65.74.70.438PTCA(％)12.514.410.00.180復(fù)合死亡，MI，CABG，PTCA(％)19.220.115.20.072任何血管擴(kuò)張術(shù)(CABG/PTCA)(％)18.418.314.60.077目標(biāo)血管重復(fù)擴(kuò)張(％)16.816.414.30.265表18在所有30天時(shí)沒有發(fā)生病狀的患者的6個(gè)月時(shí)的結(jié)果安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值(N＝601)(N＝611)(N＝643)死亡(％)1.81.31.00.38MI(％)2.42.52.20.85CABG(％)5.95.54.40.24PTCA(％)13.814.810.70.12CABG/PTCA(％)18.418.314.60.077復(fù)合死亡19.519.615.40.059MI，CABG，PTCA(％)從基線時(shí)的復(fù)合情況34.832.226.90.001(包括0-30天)(％)所有受試患者的所有病狀的數(shù)據(jù)(死亡，非致命性梗塞或需要進(jìn)行冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張術(shù))還在圖12中給出。那些進(jìn)行了成功的手術(shù)并且在30天內(nèi)沒有發(fā)生病癥的患者的數(shù)據(jù)還在圖13中給出。對(duì)急性階段終點(diǎn)而言，81％的病狀是在前48小時(shí)發(fā)生的。這一情況在所有各受試組都是相似的(安慰劑組82.0％，濃縮藥丸組79.7％，濃縮藥丸及滲透組是81.4％)。參考在進(jìn)行了成功的先期手術(shù)的患者的第一個(gè)48小時(shí)內(nèi)發(fā)生病狀的情況，就可以確定在第1個(gè)30天內(nèi)所要進(jìn)行的目標(biāo)血管擴(kuò)張術(shù)。正如在圖14中所示，對(duì)于c7E3濃縮藥丸組和c7E3濃縮藥丸及滲透組之間的亞急性局部缺血病狀直到30天以后才有明顯的差異。除了對(duì)包括沒有進(jìn)行先期治療的血管的復(fù)合死亡，心肌梗塞和血管擴(kuò)張術(shù)進(jìn)行分析外，對(duì)目標(biāo)血管擴(kuò)張術(shù)進(jìn)行單項(xiàng)分析也是很有意義的。對(duì)所有患者在6個(gè)月時(shí)而言，目標(biāo)血管擴(kuò)張?jiān)跐饪s藥丸及滲透組中比其他受試各組明顯地降低了26％(見圖15)。值得注意的是，按照本試驗(yàn)的條件進(jìn)行追蹤調(diào)查的結(jié)果顯示出僅采用濃縮藥丸的治療并沒有對(duì)目標(biāo)血管擴(kuò)張?jiān)斐扇魏斡绊?。在開始時(shí)對(duì)亞組間的分析以區(qū)別具有急性冠狀綜合癥(非頑固性絞痛，最近的或急性的心肌梗塞)的患者與那些患有頑固性絞痛但沒有高度危險(xiǎn)的血管形態(tài)的患者(表19)。這一研究表明在這兩個(gè)亞組中對(duì)復(fù)合事件都有顯著的降低效果，但是，對(duì)需要重復(fù)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈手術(shù)的降低只在患有頑固絞痛的患者中為顯著的(表19)。這一發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行了成功的手術(shù)的患者中的開始及48小時(shí)的結(jié)果之間是一致的。表19對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合癥與頑固性絞痛患者的亞組的分析從開始至6個(gè)月的事件安慰劑濃縮藥丸濃縮藥丸及滲透P值急性冠狀動(dòng)脈綜合癥N288306299復(fù)合事件33.1％28.8％25.5％0.039重復(fù)PTCA20.2％16.9％15.4％0.129頑固性絞痛N408389409復(fù)合事件36.3％35.3％28.0％0.012重復(fù)PTCA21.3％22.1％13.5％0.004從48小時(shí)至6個(gè)月時(shí)的事件急性冠狀動(dòng)脈綜合癥N252277271復(fù)合事件23.5％21.4％17.8％0.094重復(fù)PTCA14.8％15.2％11.9％0.325頑固性絞痛N354341368復(fù)合事件26.6％26.4％20.0％0.034重復(fù)PTCA17.5％18.7％11.1％0.013討論從本大規(guī)模、多中心、隨機(jī)試驗(yàn)所獲得的結(jié)果證實(shí)了在接受了濃縮藥丸及滲透以封閉血小板IIb/IIIa部分的進(jìn)行冠狀動(dòng)脈治療的患者中使復(fù)發(fā)性狹窄的臨床發(fā)生得到了降低。其有益效果的程度在6個(gè)月時(shí)為大約23％，包括所有的局部缺血事件，例如死亡、非致命性心肌梗塞和重復(fù)血管擴(kuò)張術(shù)，而在目標(biāo)血管擴(kuò)張術(shù)上的降低為26％。這些使用c7E3濃縮藥丸及12小時(shí)滲透所獲得的有益效果使急性堵塞和急性階段負(fù)反應(yīng)結(jié)果被降低到不需要進(jìn)行后來的冠狀動(dòng)脈血管擴(kuò)張術(shù)的程度。在本試驗(yàn)中所用的單克隆Fab片段對(duì)血小板IIb/IIIa表面部位有非常有效的結(jié)合性并且很少被解脫下來。前述的對(duì)接受了c7E3并進(jìn)行血管成形術(shù)的患者的研究表明在終止抗體的滲透以后還持續(xù)存在著對(duì)IIb/IIIa結(jié)合位點(diǎn)的至少36～48小時(shí)的占據(jù)，以及對(duì)血小板凝聚的至少72小時(shí)的抑制(見實(shí)施例4；又見，Ellis，S.G.etal.，Cor.Art.Dis.，41675-175(1993)；Tcheng，J.E.etal.，Circulation.88(1993))。雖然這些效果都隨時(shí)間逐步消失并回到基線值，但是c7E3對(duì)血小板凝聚的抑制效果的期間是非常有意義的，因?yàn)樵诒驹囼?yàn)的條件和標(biāo)準(zhǔn)下，濃縮藥丸及安慰劑滲透的治療中沒有觀察到在急性階段或6個(gè)月的結(jié)果中產(chǎn)生明顯的臨床效應(yīng)。這一觀察結(jié)果指明通過使用抗GPIIb/IIIa抗體來降低急性局部缺血或臨床復(fù)發(fā)性狹窄可能需要更長時(shí)間的接受這些制劑(正如采用濃縮藥丸及滲透藥物所示)，而且更長期地對(duì)GPIIb/IIIa的抑制可以產(chǎn)生進(jìn)一步改進(jìn)的治療效果。還值得注意的是，c7E3還被報(bào)導(dǎo)可與玻連蛋白受體相結(jié)合(Hynes，R.O.，Cell，6911-25(1992))，其原因可能是該受體含有GPIIb/IIIa的β3成分。這一玻連蛋白受體(vitronectin)可能參與對(duì)狹窄或復(fù)發(fā)性狹窄的調(diào)節(jié)，將抗GPIIb/IIIa的物質(zhì)與該受體結(jié)合可能有助于所觀察到的效果。其他GPIIb/IIIa受體的抑制物具有對(duì)目標(biāo)及同源成分的不同程度的特異性(Sutton，J.etal.，ClinicalResearchAFCR，41118A(1993))。進(jìn)行比較試驗(yàn)可以將這些分子相互作用分解到與之相應(yīng)的臨床效果。在本試驗(yàn)中，沒有進(jìn)行系統(tǒng)性的6個(gè)月的重復(fù)血管造影檢驗(yàn)以定量地確定各受試組中的效果。雖然重復(fù)的血管造影在很多的重復(fù)狹窄試驗(yàn)中都被進(jìn)行了(Forrester，J.S.etal..J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729，(1993)；Topol，E.J.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Adelman，A.G.etal.，N.Engl.J.Med.，329228-233(1993)；Serruys，P.W.etal.，Circulation，841568-1580(1991))，但是它有一個(gè)主要的缺陷，即在無癥狀的患者中對(duì)目標(biāo)血管狹窄的診治經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致在實(shí)際上不需要進(jìn)行的重復(fù)的治療。與之相反，本試驗(yàn)提供了對(duì)大量患者的臨床實(shí)際治療的一種模擬。復(fù)發(fā)狹窄試驗(yàn)的真正目的是顯示對(duì)需要重復(fù)血管擴(kuò)張術(shù)的顯著降低，因?yàn)樽罱M(jìn)行的一些復(fù)發(fā)狹窄試驗(yàn)記錄中的血管造影效果的本身并不是與臨床完全相關(guān)的或單項(xiàng)適合的。進(jìn)而言之，由于死亡及心肌梗塞在接受了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈治療的患者中并不是很常見的，因此由有效的藥物治療調(diào)節(jié)所得到的最重要的效果應(yīng)該是重復(fù)的目標(biāo)血管擴(kuò)張術(shù)，正如在本試驗(yàn)所見到那樣。因?yàn)樵诒驹囼?yàn)中的患者們接受的治療除了在使用的藥物、濃縮丸和滲透不一樣以外，在其他的方面包括在追蹤調(diào)查完成之前始終保持雙盲性方面都是一樣的，因此可以合理地得出的結(jié)論是對(duì)復(fù)發(fā)性狹窄的降低產(chǎn)生了所觀察到的臨床的有益的效果。這就顯示了本第一次的大型隨機(jī)試驗(yàn)表現(xiàn)出在是否需要進(jìn)行隨后的血管擴(kuò)張術(shù)方面的有益的臨床降低效果，并且可被解釋為在臨床上更少地發(fā)生了復(fù)發(fā)性狹窄。這些結(jié)果是通過IIb/IIIa封閉劑的濃縮藥丸及滲透而達(dá)到的，并且導(dǎo)致受傷血管壁的真正的愈合。盡管c7E3的滲透只進(jìn)行了12小時(shí)，但這種制劑的抗血小板效果可以延續(xù)數(shù)天，而且在急性階段沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)發(fā)生局部缺血事件的證據(jù)。更重要的是在6個(gè)月時(shí)降低目標(biāo)血管擴(kuò)張術(shù)的獨(dú)立的有益效果表明緊急c7E3藥物治療的持續(xù)效應(yīng)，并且可以被認(rèn)作是血管壁愈合的臨床證據(jù)。用血小板IIb/IIIa封閉而使臨床復(fù)發(fā)狹窄被降低這一現(xiàn)象進(jìn)一步地說明了血小板凝血在復(fù)發(fā)性狹窄中的作用，而這種血小板凝聚已經(jīng)被認(rèn)為是在血管成形術(shù)后或內(nèi)皮受傷的新內(nèi)膜損傷發(fā)生的關(guān)鍵(Schwartz，R.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，201284-1293(1992)；Toppl，E.J.MayoClin.Proc.，6888-90(1993)；Willerson，J.T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810624-10628(1991))。雖然內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞的增殖也可能在復(fù)發(fā)性狹窄中扮演非常重要的角色(Forrester，J.S.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，17758-769(1991)；Ip，J.H.etal.，J.Am.Coll.Cardiol.，1777B-88B(1991)；Casscells，W.，Circulation，86723-729，(1993))，但本試驗(yàn)的結(jié)果表明，有效的抗血小板及抗凝血途徑可能是對(duì)這一重要的臨床現(xiàn)象為非常有益的。本試驗(yàn)支持了這樣一種觀點(diǎn)，即現(xiàn)行的使用阿斯匹林作為唯一的抗血小板劑在冠狀動(dòng)脈治療中(Schwartz，L.etal.，N.Engl.J.Med.，3181714-1719(1988))是非常不夠的，無法完成血管損傷的血小板反應(yīng)的拮抗。實(shí)施例8隨機(jī)性雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)的其它發(fā)現(xiàn)管鞘尺寸和失血并發(fā)癥用EPIC試驗(yàn)(見實(shí)施例6和7)對(duì)失血并發(fā)癥進(jìn)行分析，確定在進(jìn)行PTCA/DCA時(shí)管鞘尺寸是否與失血并發(fā)癥相關(guān)。管鞘尺寸及導(dǎo)向?qū)Ч艿某叽缡怯舍t(yī)生臨床決定的。對(duì)主要的失血現(xiàn)象，如腹股溝失血、輸血、血管修補(bǔ)、nadirHct作了預(yù)測的分析。盡管對(duì)已知失血預(yù)測因素進(jìn)行了調(diào)整，包括插入導(dǎo)管期間使用的肝素以及治療方案(P＝0.0004)，管鞘尺寸仍舊可以預(yù)測腹股溝的失血。較多的血管的修復(fù)伴隨著較大的管鞘尺寸這一傾向并非顯著性的(P＝0.0004)。嚴(yán)重失血(10.5％)、輸血(11.8％)和nadirHct(34％)并不依據(jù)管鞘的尺寸而變化。接受了c7E3Fab的患者發(fā)生比不接受c7E3Fab的患者有更多的腹股溝失血(55％vs.30％，P＜0.006F-7.5F8F-8.5F9F-11Fn＝375n＝1416n＝291腹股溝失血140(38％)674(48％)147(51％)血管修復(fù)5(1.3％)17(1.2％)7(2.4％)這些結(jié)果表明大尺寸的管鞘伴隨著更多的腹股溝失血但并不影響PTCA/DCA的嚴(yán)重失血并發(fā)癥。c7E3與腹股溝的失血增加有關(guān)，但是可以通過采用較小尺寸的管鞘和導(dǎo)向?qū)Ч芏怪钚』?。冠狀?dòng)脈治療中抑制血小板GPIIb/IIIa受體后的局部缺血現(xiàn)象與失血現(xiàn)象的關(guān)系EPIC(評(píng)價(jià)c7E3在防止局部缺血并發(fā)癥中的作用)試驗(yàn)(見實(shí)施例6和7)表明用c7E3Fab這種血小板受體GPIIb/IIIa的有效拮抗劑的治療，可以防止在進(jìn)行高度危險(xiǎn)的冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)時(shí)的局部缺血并發(fā)癥，但是對(duì)于其失血現(xiàn)象則需要將輸血從安慰劑組的7％升高到c7E3Fab組的14％。為了對(duì)其進(jìn)行更深一步的調(diào)查，對(duì)失血指征(nadir血細(xì)胞比容，失血指數(shù)，血細(xì)胞比容的變化，所輸入的血紅細(xì)胞的單位數(shù))與本試驗(yàn)的主要終點(diǎn)(死亡，心肌梗塞，冠狀動(dòng)脈分流術(shù)(CABG)，或?qū)毙跃植咳毖M(jìn)行的PTCA或針對(duì)治療失敗而進(jìn)行的冠狀動(dòng)脈斯坦特插入)之間的關(guān)系進(jìn)行了調(diào)查。在失血與主要終點(diǎn)之間發(fā)現(xiàn)了很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系(對(duì)于所有失血指征P＝0.0001)。這一相關(guān)關(guān)系存在于下述各項(xiàng)治療中安慰劑，c7E3Fab濃縮藥丸，c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透。因此，具有顯著失血的患者就更容易發(fā)生局部缺血并發(fā)癥。這一很強(qiáng)的相互關(guān)系可能是由于伴隨主要終點(diǎn)事件(如CABG)的失血的增高而造成的。另外，失血以及所伴隨的低血壓也可能是造成術(shù)后的局部缺血并發(fā)癥的主要因素之一。支持這一點(diǎn)的是，在進(jìn)行了成功的PTCA后的患有低血壓(除了在主要結(jié)果事件以后的低血壓)的患者是非常明顯的更容易發(fā)生主要結(jié)果事件，并且更容易發(fā)生嚴(yán)重失血及主要結(jié)果事件。低血壓沒有低血壓P值數(shù)2391597-主要終點(diǎn)(％)46(16.1)103(6.5)＜.001終點(diǎn)+嚴(yán)重失血(％)18(39.9)10(9.7)＜.001其結(jié)論是，失血似乎是可以引起在某些患者身上的局部缺血并發(fā)癥，而降低失血的方法(例如改變肝素的劑量)可以進(jìn)一步地在冠狀動(dòng)脈治療中提高GPIIb/IIIa抑制的抗局部缺血的效率。在高度危險(xiǎn)血管成形術(shù)中積極性血小板抑制的經(jīng)濟(jì)益處及害處在2,100名患者的EPIC隨機(jī)試驗(yàn)中(見實(shí)施例6和7)采用高劑量的c7E3Fab的積極性血小板抑制使得高度危險(xiǎn)的冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)中發(fā)生的死亡、復(fù)發(fā)性梗塞和復(fù)發(fā)性局部缺血被降低了35％，但是，PTCA后的嚴(yán)重失血增加了一倍。為了評(píng)價(jià)這種臨床綜合效應(yīng)的經(jīng)濟(jì)學(xué)結(jié)果，進(jìn)行了更詳細(xì)的經(jīng)濟(jì)學(xué)方面的展望及研究。對(duì)每一位參加試驗(yàn)的患者收集了他們的參加試驗(yàn)后6個(gè)月的住院花費(fèi)(不包括服務(wù)費(fèi))和所用資源的數(shù)據(jù)。對(duì)于沒有復(fù)雜的住院過程的患者的平均基本住院花費(fèi)為9300美元。嚴(yán)重并發(fā)癥對(duì)基本住院花費(fèi)的影響是按照多變量線性回歸模型(multivariablelinearregressionmodel)進(jìn)行分析的平均住院花費(fèi)等于＝9065美元+5923美元(緊急PTCA)+28,219美元(緊急CABG)+3645美元[(復(fù)發(fā))梗塞]+3462美元(嚴(yán)重失血)這一模型顯示將緊急PTCA從4.5％減少到0.8％，緊急CABG從3.6％減少到2.4％以及將(復(fù)發(fā))梗塞從8.6％減少到5.2％就使得c7E3片段的治療方法比安慰劑治療方法對(duì)每個(gè)患者平均降低了費(fèi)用682美元。然而，由于嚴(yán)重失血被增加了一倍，即從7％至14％，那么這種方法就喪失了242美元的潛在的可能節(jié)約的優(yōu)勢，其結(jié)果是對(duì)每位患者來說實(shí)際上的花費(fèi)的凈節(jié)省值為440美元。實(shí)際上對(duì)于高劑量c7E3Fab(X＝$10,970±7,284)與安慰劑(X＝$11,376±12,555)之間的平均費(fèi)用的差距為406美元，與模型的預(yù)測值非常接近。因此，通過對(duì)高度危險(xiǎn)的PTCA的局部缺血并發(fā)癥的明顯降低，使用嵌合抗GPIIb/IIIa片段的對(duì)血小板的積極性抑制就提供了改善的醫(yī)療效果和凈花銷的節(jié)省。在保證治療的有益效果的同時(shí)，采用能夠使服用c7E3時(shí)的嚴(yán)重失血率被降低的方法還可以使預(yù)測的凈花費(fèi)的節(jié)省數(shù)升高到每位患者為700美元。在冠狀動(dòng)脈治療中用血小板GPIIb/IIIa拮抗劑可使活化的凝血時(shí)間得到提高活化的凝血時(shí)間(ACT)被用于經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)以監(jiān)測對(duì)凝血酶抑制的程度和在使凝血現(xiàn)象被最小化的嘗試中的抗凝聚作用。在引入有效的血小板抑制劑例如嵌合單克隆c7E3Fab抗體后，對(duì)在PCTA中的調(diào)節(jié)ACT的方法的實(shí)用性還沒有進(jìn)行檢驗(yàn)。直至目前為止，c7E3對(duì)ACT的影響還是未知的，并且還沒有被推測出來。血小板GPIIb/IIIa的拮抗機(jī)制的對(duì)ACT方法的可能的影響已經(jīng)被調(diào)查了。在該試驗(yàn)中接受了PTCA的2099名患者被隨機(jī)地給予安慰劑(n＝696)或GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab(n＝1403)。與安慰劑組相比，接受了很高劑量的肝素(＞14,000單位)的患者的數(shù)目比較少，盡管這些接受了c7E3Fab的患者也接受了相似劑量的肝素，但在根據(jù)體重進(jìn)行了校正之后他們都具有明顯的高的(P＜0.001)ACT。肝素劑量安慰劑對(duì)象％c7E3Fab對(duì)象％＜10,000單位或僅滲透112(16)265(19)10,000單位220(32)497(36)10,000-14,000單位141(21)298(22)＞14,000單位209(31)316(23)結(jié)論是，血小板GPIIb/IIIa拮抗劑c7E3Fab將活化凝血時(shí)間延長了35～40秒。這一點(diǎn)在肝素劑量輔助治療法以及在GPIIb/IIIa為指導(dǎo)的治療法中進(jìn)行冠狀動(dòng)脈治療時(shí)都具有非常重要的意義。使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體防止血管成形術(shù)的局部缺血并發(fā)癥的評(píng)價(jià)試驗(yàn)的性別差異進(jìn)行了使用單克隆抗血小板GPIIb/IIIa受體的抗體，即單克隆c7E3Fab抗體防止血管成形術(shù)中的局部缺血并發(fā)癥的評(píng)價(jià)試驗(yàn)的性別差異研究(見實(shí)施例6和7)。進(jìn)行經(jīng)皮治療(PTCA)的患者在治療前的不長時(shí)間內(nèi)接受了下述三者之一的盲點(diǎn)處理c7E3濃縮藥丸并隨后進(jìn)行12小時(shí)c7E3滲透、c7E3濃縮藥丸或安慰劑。盡管事實(shí)上女性都比男性的年齡稍大，體重稍輕，并且具有更多的心血管危險(xiǎn)因素，但是，女性及男性在下列各項(xiàng)目中都沒有顯出性別差異死亡頻率(2.2％vs.1.3％)，MI(7.5％vs.6.3％)，緊急PTCA(2.6％vs.3.1％)，緊急分流手術(shù)(1.7％vs.3.2％)，在30天內(nèi)的斯坦特置入、主動(dòng)脈內(nèi)氣囊泵的放置或復(fù)合的對(duì)那些局部缺血負(fù)作用事件的處理(10.5％vs.11.0％，P＝0.74)。對(duì)于這些復(fù)合處理的已知因素的調(diào)整(治療方案、體重、高血壓、外周血管疾病)，以及對(duì)任何涉及性別的潛在的統(tǒng)計(jì)學(xué)作用的調(diào)整都不會(huì)改變這些結(jié)果。用c7E3Fab濃縮藥丸及其滲透的治療在兩種性別中都對(duì)局部失血事件的頻率產(chǎn)生了相似的降低。女性顯示出比男性更多的嚴(yán)重失血(12.6％vs.9.8％)，需要更多的輸血(PRBC)(19.5％vs，9.0％)并且具有更高的失血指數(shù)(Δ血細(xì)胞比容/3+PRBC單位，2.4vs.1.9)。在預(yù)測失血指數(shù)的回歸模型中，盡管對(duì)已知的失血預(yù)測因子進(jìn)行調(diào)整(治療方案、年齡、體重、開始時(shí)的血細(xì)胞比容、高血壓)，性別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上仍舊是獨(dú)立的預(yù)測因子(P＝.0041)。結(jié)論是，在接受了高度危險(xiǎn)的血管成形術(shù)和c7E3Fab治療以后，女性顯示出了比男性更多的失血，但是，在其它的負(fù)作用上，并沒有顯示出增加。實(shí)施例9嵌合性7E3Fab對(duì)人血小板上的GPIIb/IIIa的親和性嵌合性7E3Fab和鼠7E3FabIgG對(duì)三位正常供者的血小板的結(jié)合在37℃進(jìn)行了研究，并且用直接結(jié)合等值點(diǎn)陣圖(directbindingisothermplots)和質(zhì)量作用定律的線性表達(dá)(linearrepresentationsofmassactionlaw)進(jìn)行了研究。標(biāo)記的抗體125I-鼠7E3IgG(m7E3IGg)用碘標(biāo)記來制備。特異性活性和蛋白質(zhì)濃度分別是4.1μCi/μg/和45μg/ml。用HAS-生理鹽水進(jìn)行1∶20的稀釋(0.1％人血清白蛋白在0.9％NaCl溶液中)，得到100,000cpm/10μl。125I-嵌合性7E3Fab(c7E3Fab)用碘標(biāo)記來制備。特異性活性和蛋白質(zhì)濃度分別是0.995μCi/μg/和0.29μg/ml。用HAS-生理鹽水進(jìn)行1∶62.5的稀釋得到100,000cpm/10μl?？贵w濃度為250μg/ml的工作溶液是用鼠7E3(m7E3)IgG和c7E3Fab制備的。用HAS-生理鹽水進(jìn)行了幾次稀釋得到所需要的濃度。在40μl冷的抗體制劑中加入固定相應(yīng)標(biāo)記的抗體，既10μl，所得到的混合物用于抗體結(jié)合檢測。血小板用常規(guī)方法制備富集血小板(PRP)。血液被收集在檸檬酸鈉抗凝聚劑中，然后在1小時(shí)內(nèi)將富集血小板調(diào)整到200-300,000血小板/μl。抗體結(jié)合檢測對(duì)抗體結(jié)合的檢測使用了修飾的Coller方法[Coller，B.S.，J.Clin.Invest.76101-108(1985)]。將50μl抗體溶液的等份試樣與450μl富集血小板混合，這兩種原料都預(yù)先加熱到37℃，然后將混合物在37℃培養(yǎng)30分鐘。該反應(yīng)混合物的100毫升等份試樣立即在200μl的30％蔗糖上展層，一式三份，然后以10,000xg離心5分鐘。沉淀中含有沉降的被結(jié)合的抗體(離心管的尖部)，上清液中未結(jié)合的抗體并被與沉淀分開，對(duì)這兩部分的放射性進(jìn)行確定并記錄。對(duì)來自三個(gè)不同供者的血小板各自進(jìn)行了本檢測。數(shù)據(jù)分析根據(jù)對(duì)每個(gè)檢測中的上清液和沉淀的放射性讀數(shù)，對(duì)每個(gè)抗體濃度中結(jié)合抗體的組分進(jìn)行測定。原理是結(jié)合的放射性標(biāo)記的抗體與冷的抗體相一致，因此，對(duì)根據(jù)標(biāo)記抗體測定的組分可以表示抗體分子的整個(gè)情況。這個(gè)結(jié)合抗體(Ab)組分，以及抗體的總濃度([Ab])被用來計(jì)算每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的結(jié)合抗體和游離抗體的摩爾濃度。首先，用[結(jié)合Ab]對(duì)于[游離Ab]做出結(jié)合等位圖。四個(gè)參數(shù)的曲線符合于蘋果計(jì)算機(jī)上的KaleidaGraph軟件(SynergySoftware，Reading，PA)。該公式和四個(gè)相符的數(shù)據(jù)是y＝m1+((m2-m1)/(1+(x/m3)^m4))其中y＝[結(jié)合Ab]，x＝[游離Ab]，四個(gè)參數(shù)為m1＝平臺(tái)上部數(shù)值(飽和結(jié)合時(shí)，總的抗原/表位濃度，[總Ag])；m2＝平臺(tái)下部數(shù)值(在加入很低濃度Ab時(shí)，[結(jié)合Ab]趨近于0的數(shù)值)；m3＝在中間y值時(shí)的x值(當(dāng)[游離Ab]與抗原表位的結(jié)合為50％時(shí)的數(shù)值)；以及m4＝該曲線上線性部分斜率的指數(shù)。在50％結(jié)合處的[游離Ab]值(上述計(jì)算中的第三個(gè)參數(shù))就是根據(jù)質(zhì)量作用定律的抗體和抗原之間進(jìn)行反應(yīng)的Kd值，假定為獨(dú)立的未交互作用的位置。另外，平臺(tái)上部的[結(jié)合Ab]數(shù)值(第一個(gè)參數(shù))就相當(dāng)于抗原位點(diǎn)全部飽和，給出了抗原位點(diǎn)的濃度。有了這個(gè)數(shù)值，就可以計(jì)算出每個(gè)血小板的GPIIb/IIIa受體數(shù)值。除了直接分析結(jié)合等位(bindingisotherm)之外，這些數(shù)據(jù)還用質(zhì)量作用定律的線性轉(zhuǎn)換進(jìn)行了分析?，F(xiàn)在共有六種可用的線性轉(zhuǎn)換，其中的一個(gè)是通常被稱作Scatchard點(diǎn)陣圖(具體見下面)(FazekasdeSt.Groth，S.，“TheQualityofAntibodiesandCellularReceptors”，InImmunologicalMethods，Vol.I，Lefkovits，I.AndB.Pernis，Editors，AcademicPress，Inc.NewYork，1-42，1979)。點(diǎn)陣圖的公式所有的公式都是從質(zhì)量作用定律推導(dǎo)出來的Kd＝[Ab]×[Ag]/[Ab∶Ag]其中[Ab]、[Ag]以及[Ab∶Ag]分別是游離Ab、游離Ag以及Ab∶Ag復(fù)合物的平衡摩爾濃度。結(jié)合等位[結(jié)合Ab]/[總Ag]＝1/(Kd+[游離Ag])×[游離Ab]點(diǎn)陣圖a[結(jié)合Ab]/[游離Ab]＝([總Ag]/Kd)-1/Kd×[結(jié)合Ab]點(diǎn)陣圖b1/[游離Ab]＝(-1/Kd)+([總Ag]/Kd×1/[結(jié)合Ab]點(diǎn)陣圖c1/[結(jié)合Ab]＝(1/[總Ag])+(Kd/[總Ag])×1/[游離Ab]點(diǎn)陣圖d[游離Ab]/[結(jié)合Ab]＝(Kd/[總Ag])+1/[總Ag]×[游離Ab]點(diǎn)陣圖e[游離Ab]＝Kd+[總Ag]×[游離Ab]/[結(jié)合Ab]點(diǎn)陣圖f[結(jié)合Ab]＝[總Ag]-Kd[結(jié)合Ab]/[游離Ab]被標(biāo)記抗體的結(jié)合力當(dāng)抗體被放射線同位素標(biāo)記后，一部分的抗體會(huì)失去活性以及同目標(biāo)抗原結(jié)合的能力。因此，非活性的被標(biāo)記的抗體的比率必須用實(shí)驗(yàn)來確定，并在制圖之前從抗體總濃度中減去[Trucoo，M.andS.dePetris，“DeterminationofEquilibriumBindingParametersofMonoclonalAntibodiesSpecificforCellSurfaceAntigens”，InImmunologicalMethods，Vol.II，Lefkovits，I.AndB.Pernis，Editors，AcademicPress，N.Y.1-26(1981)]。在此假設(shè)的是，非活性的抗體都由于標(biāo)記而完全失去活性，余下的抗體(即可發(fā)生結(jié)合的抗體)具有相同的親和常數(shù)。125I-標(biāo)記的7E3Fab和7E3IgG，濃度為0.14-0.2μg/ml，與濃度為大約300,000血小板/μl的血小板培養(yǎng)。在平衡時(shí)，結(jié)合的抗體比率被確定，對(duì)7E3Fab和7E3IgG分別為89％和78％。根據(jù)質(zhì)量作用定律推算的全部活性抗體的比率，在這些濃度時(shí)對(duì)這兩種抗體都是93％。因此，這些結(jié)果就表明有4％的7E3Fab和15％的7E3IgG為失活的，并很可能是放射性標(biāo)記的結(jié)果。結(jié)果實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)按照上述作圖(未顯示)，并制備了每個(gè)實(shí)驗(yàn)的具有相符曲線等式的結(jié)合等位圖和線性圖。表20給出了根據(jù)使用相符曲線等式從每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)確定的Ka數(shù)值和表位密度(即每個(gè)血小板所具有的GPIIb/IIIa分子的數(shù)目)。c7E3Fab與人血小板的結(jié)合遵循了常規(guī)的結(jié)合形式。結(jié)合等位揭示的平滑曲線如同根據(jù)均質(zhì)單克隆AbFab片段與均質(zhì)細(xì)胞表面抗原結(jié)合所得到的曲線。該反應(yīng)的解脫常數(shù)和結(jié)合常數(shù)經(jīng)過計(jì)算分別為5.15納摩爾和1.94E08M-1。在血小板上的GPIIb/IIIa抗原的數(shù)目為69590(約等于70000)。經(jīng)過比較，得到m7E3IgG與血小板的解脫常數(shù)和結(jié)合常數(shù)分別為3.56納摩爾和2.81E08M-1。對(duì)于7E3IgG的GPIIb/IIIa密度，計(jì)算結(jié)果為73355表位/血小板。這些數(shù)字指出，7E3Fab和7E3IgG的抗原結(jié)合位點(diǎn)的嚴(yán)緊反應(yīng)常數(shù)是相似的。根據(jù)這些數(shù)據(jù)以及考慮了比率常數(shù)，計(jì)算得到的m7E3IgG與血小板的結(jié)合是雙臂的結(jié)合。表207E3與人血小板結(jié)合的親和常數(shù)和血小板的表位密度供者抗體Ka，M-1表位/血小板#1091c7E3Fab1.26E0859,129m7E3IgG共價(jià)1.71E0872,540M7E3IgG單價(jià)2.72E0831,898#1253c7E3Fab1.33E0871,506m7E3IgG共價(jià)2.95E0868,841m7E3IgG單價(jià)3.53E0829,408#2010Bc7E3Fab3.23E0878,136m7E3IgG共價(jià)3.77E0878,685M7E3IgG單價(jià)3.62E0833,780平均c7E3Fab1.94E08±1.12E0869590±9647m7E3IgG共價(jià)2.81E08±1.04E0873355±4972M7E3IgG單價(jià)3.29E08±4.96E0831695±2193實(shí)施例10嵌合性7E3Fab對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上的玻連蛋白受體的結(jié)合血小板糖蛋白GPIIb/IIIa屬于一類整合蛋白受體，它們享有共同的結(jié)構(gòu)性和免疫學(xué)性特征。與GPIIb/IIIa緊密相關(guān)的一個(gè)整合蛋白是玻連蛋白受體(αvβ3)并使用與GPIIb/IIIa相同的β亞單位，但具有不同的α亞單位。玻連蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)并調(diào)節(jié)與各種胞外基質(zhì)蛋白的黏結(jié)(例如，玻連蛋白、纖連蛋白、vonWillebrand因子、血纖蛋白原、骨橋蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、膠原蛋白、基底膜(蛋白)聚糖)。GPIIb/IIIa與玻連蛋白受體之間具有足夠的同源性，所以，作為直接抗GPIIb/IIIa的抗體7E3還可以與內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的玻連蛋白受體結(jié)合。因而，本研究就針對(duì)嵌合性7E3Fab(c7E3Fab)與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用的特征來進(jìn)行，并確定該相互作用的任何可能的功能性后果?？贵w本研究中使用的抗體包括抗-GPIIb/IIIa嵌合性7E3Fab(c-116E；由木瓜蛋白酶對(duì)IgGFab酶解得到的產(chǎn)物)；抗-CD4嵌合性MT412Fab，用作同源相配嵌合性Fab片段對(duì)照(由細(xì)胞系C128A產(chǎn)生；公開于WO91/10722號(hào)國際申請(qǐng)中)；抗-E-選擇蛋白H18/7F(ab’)2(M.Bevilaqua贈(zèng)送品)；抗-ICAM-1#19(G.Riethmuller的贈(zèng)送品)；抗-CD51(AMAC)，一種識(shí)別玻連蛋白受體的α鏈的單克隆抗體；抗-IIIa(AMAC)，一種與GPIIIa反應(yīng)的單克隆抗體；鼠7E3IgG；抗-7E3是兔源的，可變區(qū)特異性抗-7E3多克隆抗體制劑；單克隆抗體LM609(D.A.Cheresh，ScrippsResearchInstitute，LaJolla，CA的贈(zèng)送品)，它與αvβ3復(fù)合物(玻連蛋白受體)結(jié)合，但是不與GPIIb/IIIa結(jié)合；單克隆抗體10E5，與GPIIb/IIIa反應(yīng)，但是不識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞αvβ3(Centocor)?？贵w的碘化嵌合性7E3Fab和嵌合性抗-CD4MT412Fab(cMT421Fab)通過孔徑0.22微米，13毫米大小的過濾器(Millipore，Millex-GV#SLGV01305)，然后再進(jìn)行放射性標(biāo)記?？贵w的放射性標(biāo)記采用Na125I(Amersham)和使用碘珠(Iodobeads，PierceChemicals，Rockford，IL)，通過瓊脂糖G25柱(PharmaciaPD-10SephadexG-25M)，去除未反應(yīng)的125I碘化物。事先對(duì)該柱用在磷酸鹽緩沖生理鹽水中的0.1％人血清白蛋白(Albuminar-25，ArmourPharmaceuticalCo.，Kankakee，IL)進(jìn)行封閉，并用0.01％Tween80-PBSS洗脫緩沖液平衡。碘化以后，抗體經(jīng)過0.22微米過濾，抗體的濃度用280納米的光吸收來確定，使用1.5OD/mgmL-1作為吸收系數(shù)。HUVEC的培養(yǎng)從細(xì)胞系統(tǒng)公司(CellSystem，Kirkland，WA)購買了第一代的HUVEC細(xì)胞，培養(yǎng)在用2％明膠涂敷過的組織培養(yǎng)燒瓶中的含有血清的培養(yǎng)基(HUVEC培養(yǎng)基，CellSystem)上，直到第四代，此時(shí)以5×106細(xì)胞/毫升冷凍。對(duì)于HUVEC結(jié)合以及活化實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞融化，以大約1×104細(xì)胞/井直接接種到2％明膠涂敷過的96井組織培養(yǎng)盤上，培養(yǎng)3到5天，直至融合，然后進(jìn)行檢測。對(duì)于檢測HUVEC的傳播和黏附的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞融化到用明膠涂敷過的T-150組織培養(yǎng)燒瓶中，生長到約85％融合。然后將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，接種到如下所述的涂敷過的基質(zhì)上。125I-c7E3結(jié)合HEVUC被接種到96井的去除細(xì)胞組織培養(yǎng)盤(Dynatech)，生長至融合。為了達(dá)到飽和結(jié)合，用含有10％FCS(或如果需要，用不含血清的)HUVEC培養(yǎng)基將125I-c7E3稀釋。一套細(xì)胞用示蹤物培養(yǎng)，加入0.02％疊氮化鈉來防止示蹤抗體的加帽和內(nèi)化。使用100倍的過量冷c7E3Fab來限制非特異性結(jié)合。細(xì)胞用示蹤物在37℃培養(yǎng)4小時(shí)，用200μl培養(yǎng)基洗兩次，移去細(xì)胞，用伽瑪計(jì)數(shù)器對(duì)放射性結(jié)合定量。對(duì)每個(gè)井中的細(xì)胞數(shù)量，用胰蛋白酶消化樣品井，用血細(xì)胞計(jì)記數(shù)。檢測一式三份。對(duì)于Scatchard數(shù)據(jù)分析，結(jié)合的125I-c7E3在橫坐標(biāo)上作圖，游離抗體濃度除以結(jié)合的數(shù)量在縱坐標(biāo)上作圖。對(duì)曲線的線性回歸得到了(-)的斜率，它被定為Kλ值。與X軸的交點(diǎn)被定為Bmax或最大抗體結(jié)合量。該Bmax值被轉(zhuǎn)換為每個(gè)細(xì)胞的位點(diǎn)數(shù)值，使用的公式如下結(jié)合的分子數(shù)/細(xì)胞＝Bmax(in摩爾)×(摩爾/1015摩爾)×(Avrogadro’s數(shù)/摩爾)/細(xì)胞數(shù)/井對(duì)于競爭結(jié)合，使用的方法與Scatchard分析所用相同，但是，使用了恒定的1μg/ml濃度的125I-c7E3Fab，雖然未標(biāo)記的競爭物的濃度有增加。該檢測是在含有10％FCS的HUVEC完全培養(yǎng)基中進(jìn)行的。對(duì)HUVEC活化的測定A.E-選擇蛋白和ICAM-1的表達(dá)HUVEC被接種到外突井的組織培養(yǎng)盤并生長至融合。用含有所示濃度抗體的100μlHUVEC完全培養(yǎng)基處理4或24小時(shí)。用50單位/ml的TNFα(Genzyme)作為陽性對(duì)照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1的表達(dá)。培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)基，換以含有1μg/ml的125I-抗-E-選擇蛋白抗體的HUVEC完全培養(yǎng)基50μl(對(duì)經(jīng)過4小時(shí)刺激的細(xì)胞)，或者換以含有1μg/ml的125I-抗-ICAM-1抗體的HUVEC完全培養(yǎng)基50μl(對(duì)經(jīng)過24小時(shí)刺激的細(xì)胞)。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，用200μl的培養(yǎng)基洗兩次，移去小井，用伽瑪計(jì)數(shù)器定量放射性結(jié)合。B.PMN與HUVEC的黏結(jié)HUVEC被接種到外突井的組織培養(yǎng)盤并生長至融合。用含有所示濃度抗體的100μlHUVEC完全培養(yǎng)基處理4或24小時(shí)。用50單位/ml的TNFα(Genzyme)作為陽性對(duì)照來提高E-選擇蛋白和ICAM-1的表達(dá)，并進(jìn)而提高對(duì)多形核白細(xì)胞(PMN)的黏結(jié)。PMN從被單聚溶解培養(yǎng)基(MonopolyResolvingMedium，F(xiàn)lowLabs)肝素化過的人血中分離。將PMN重懸浮于5ml的RPMI中，在室溫下用100μl111銦(Amersham)進(jìn)行15分鐘的111銦標(biāo)記。用50ml的RPMI對(duì)細(xì)胞洗兩次，重懸浮于含有10％FCS的RPMI中，達(dá)到4×106/ml。從HUVEC單層中移去培養(yǎng)基，每個(gè)小井中加入100μl的PMN，37℃培養(yǎng)30分鐘。用200μl的培養(yǎng)基洗兩次，除去為結(jié)合的PMN。用伽瑪計(jì)數(shù)器對(duì)每個(gè)小井計(jì)數(shù)來定量結(jié)合的PMN。實(shí)驗(yàn)一式三份。C.HUVEC對(duì)涂敷表面的黏結(jié)和傳播將HUVEC接種到用2％明膠涂敷的T-150燒瓶，當(dāng)?shù)竭_(dá)約85％融合時(shí)取用。細(xì)胞經(jīng)過短暫胰蛋白酶消化，清洗，重懸浮在HUVEC完全培養(yǎng)基，濃度為3×105細(xì)胞/毫升。用10μg/ml的c7E3Fab或CMT412Fab處理細(xì)胞，然后立即以300μl/井接種到8格的玻璃載玻片(NUNC#177402)上，或接種到8格的Permanox塑料載玻片(NUNC#177445)上，或者接種到48井的組織培養(yǎng)塑料盤(Corning)上，放入37℃的二氧化碳濕潤保溫箱內(nèi)。每種表面都在室溫下預(yù)先涂敷4小時(shí)，使用的涂料是20μg/ml的纖連蛋白(SigmaF2006)、40μg/ml的血纖蛋白原(SigmaF4883)或20μg/ml的玻連蛋白(SigmaV8379)，各自都稀釋于PBS。涂敷之后，用PBS短暫洗每個(gè)小井兩次。接種4小時(shí)后和24小時(shí)后，用安裝在反相對(duì)比顯微鏡上的照相機(jī)對(duì)細(xì)胞拍照。結(jié)果C7E3Fab對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合每個(gè)細(xì)胞的抗體親和性以及數(shù)量對(duì)使用125I-c7E3Fab的飽和結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行Scatchard分析(圖16和17A-17E)揭示了125I-c7E3Fab對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)親和性為大約Kλ＝1×108M-1(表21)。用TNFα處理之后，親和性沒有變化，而該處理正是提高內(nèi)皮細(xì)胞上炎癥調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)例如E-選擇蛋白和ICAM-1的處理。此外，當(dāng)使用不含血清的培養(yǎng)基或在有疊氮化鈉(0.02％)防止加帽和內(nèi)化的條件下進(jìn)行檢測的時(shí)候，親和性也沒有改變。表21125I-c7E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的Scatchard分析的總結(jié)結(jié)合的7E3Fab/細(xì)胞Kλ(M-1)未刺激的HUVEC677,0001.34×108未刺激的HUVEC/不含血清677,0001.19×108未刺激的HUVEC+疊氮化物677,0001.23×108用TNF刺激4小時(shí)的HUVEC677,0001.38×108用TNF刺激24小時(shí)的HUVEC602,0001.28×108HUVEC培養(yǎng)時(shí)，使用的是提高了濃度的125I-標(biāo)記的c7E3Fab，而且有或者沒有100倍過量的冷c7E3Fab來限定非特異性結(jié)合。按照上述對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Scatchard分析。Scatchard分析還揭示了每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合有約650,000個(gè)125I-c7E3Fab分子。該數(shù)值在用TNFα或在有不含血清的培養(yǎng)基或疊氮化物存在進(jìn)行刺激的時(shí)候都不發(fā)生變化。如果125I-c7E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞上的αvβ3結(jié)合的話，則所得到的每個(gè)細(xì)胞上的位點(diǎn)的數(shù)量，就會(huì)與用LM609這種識(shí)別αvβ3復(fù)合物的抗體進(jìn)行飽和結(jié)合分析得到的數(shù)字非常接近。Scatchard分析指出每個(gè)細(xì)胞結(jié)合有300,000個(gè)LM609抗體(圖18)。125I-c7E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合特異性進(jìn)行了競爭性實(shí)驗(yàn)來確定是否其它的抗-GPIIb/IIIa、抗-αvβ3、或其它的抗體可以抑制125I-c7E3Fab的結(jié)合(圖19)。LM609是一種與αvβ3復(fù)合物(玻連蛋白受體)結(jié)合但是不與GPIIb/IIIa結(jié)合的抗體，當(dāng)IC50≈0.03μg/ml時(shí)，它有效地與125I-c7E3Fab競爭。鼠的IgG形式的7E3和嵌合性Fab形式的7E3分別在IC50值約為0.2μg/ml時(shí)和IC50值約為1.0μg/ml時(shí)與125I-c7E3Fab發(fā)生結(jié)合競爭。一種兔的可變區(qū)特異性抗-7E3抗體在IC50值約為1.0μg/ml時(shí)也封閉了125I-c7E3Fab的結(jié)合。而一種等位相配的對(duì)照Fab片段MT412(抗-CD4)沒有與125I-c7E3Fab競爭結(jié)合。另一種與GPIIb/IIIa結(jié)合但是不識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞“GPIIb/IIIa”的抗體10E5也沒有競爭性?？?αv抗體(從AMAC購買的克隆AMF7)和抗-IIIa抗體(從AMAC購買的克隆SZ.21)以及玻連蛋白都沒有與125I-c7E3Fab競爭結(jié)合。嵌合性7E3Fab對(duì)HUVEC激活的效果LPS、IL-1以及TNFα都可以激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏結(jié)蛋白，例如E-選擇蛋白和ICAM-1。這些黏結(jié)蛋白調(diào)節(jié)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏結(jié)，使它們轉(zhuǎn)移到到炎癥位點(diǎn)。在體外，與活化試劑接觸4小時(shí)得到了E-選擇蛋白的最佳表達(dá)，24小時(shí)得到對(duì)ICAM-1的最佳表達(dá)。用HUVEC與c7E3Fab培養(yǎng)4小時(shí)和24小時(shí)都沒有改變E-選擇蛋白以及ICAM-1的表達(dá)(圖20A-20B)，這是用125I-抗體結(jié)合進(jìn)行的測定。嵌合性7E3Fab處理(0.01，0.1，1.0，10，或100μg/ml)或?qū)φ誇ab處理(1.0，10，或100μg/ml嵌合性MT412Fab)HUVEC都沒有明顯地提高HUVEC與PMN的黏結(jié)(圖21A-21B；100μg/ml)。在顯微鏡下，用100μg/mlc7E3Fab處理過4小時(shí)或24小時(shí)的細(xì)胞，與未處理的細(xì)胞在洗掉單分子層之前和之后都沒有任何明顯的區(qū)別。c7E3Fab對(duì)HUVEC與基底物涂敷的表面的黏結(jié)和在其上的傳播HUVEC分別進(jìn)行以下物質(zhì)處理(1)加培養(yǎng)基，接種到玻連蛋白涂敷的玻璃或塑料上；(2)用嵌合性7E3Fab(10μg/ml)處理，接種到a)玻連蛋白涂敷的玻璃或塑料上，b)血纖蛋白原涂敷的玻璃或塑料上，或c)纖連蛋白涂敷的玻璃或塑料上。注意，HUVEC在開始的時(shí)刻，已經(jīng)用胰蛋白酶處理了，并用10μg/ml的c7E3Fab處理過。然后，立即將細(xì)胞接種到小室載玻片或48井的組織培養(yǎng)盤上，于37℃培養(yǎng)。接種后6小時(shí)，用反相對(duì)比顯微鏡進(jìn)行相差顯微照相。接種到血纖蛋白原或纖連蛋白涂敷的塑料上的未處理的細(xì)胞看起來與在玻連蛋白涂敷的塑料上的未處理細(xì)胞很相似。親和性MT412處理過的細(xì)胞看起來與未處理的細(xì)胞很像。比較未處理的和cMT412Fab處理過的細(xì)胞表明，加入c7E3Fab6小時(shí)后對(duì)HUVEC與纖連蛋白、玻連蛋白、血纖蛋白原涂敷過的Permanox塑料、玻璃和組織培養(yǎng)塑料表面的黏結(jié)和在它們之上的傳播都沒有影響。在接種24小時(shí)后也沒有顯示任何效果。嵌合性7E3Fab對(duì)人的內(nèi)皮細(xì)胞的親和性與嵌合性7E3Fab對(duì)血小板上GPIIb/IIIa的親和性相似(Ka＝1.94×108M-1)。c7E3的親和性在有疊氮化合物時(shí)并沒有變化，表明抗體沒有發(fā)生內(nèi)化作用。在不含有血清的培養(yǎng)基中嵌合性也沒有變化，表明在小牛血清中的蛋白質(zhì)沒有改變c7E3Fab對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合有大約650,000個(gè)c7E3Fab分子，而每個(gè)血小板結(jié)合有大約80,000-100,000個(gè)c7E3Fab分子。假設(shè)內(nèi)皮細(xì)胞的表面積是500μm2，而血小板的表面積是22μm2，那么，c7E3Fab結(jié)合位點(diǎn)的密度在血小板上就是4500/μm2，在內(nèi)皮細(xì)胞上是1000/μm2。因此，雖然好象內(nèi)皮細(xì)胞上有很多7E3結(jié)合位點(diǎn)，但是，它的密度卻不到血小板上該結(jié)合位點(diǎn)密度的四分之一。競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，c7E3Fab通過玻連蛋白受體發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合，因?yàn)閷?duì)玻連蛋白受體為特異性的抗體LM609與c7E3Fab競爭對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。用玻連蛋白受體特異性抗體進(jìn)行的飽和結(jié)合測量的內(nèi)皮細(xì)胞上玻連蛋白受體的數(shù)量為大約300,000。這是c7E3Fab結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)目的一半。這種不一致性的原因可能是較小的c7E3Fab具有提高了的對(duì)不與LM609IgG的位點(diǎn)結(jié)合的能力，或者因?yàn)長M609IgG抗體的結(jié)合是二價(jià)的。c7E3Fab的結(jié)合沒有顯示出對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活的作用，既沒有象E-選擇蛋白或ICAM-1黏結(jié)蛋白質(zhì)那樣，也沒有象內(nèi)皮細(xì)胞與PMN結(jié)合那樣。在把c7E3Fab接種到玻連蛋白、纖連蛋白、或血纖蛋白原涂敷的玻璃或塑料表面之前與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，也沒有改變細(xì)胞在這些表面上的傳播能力和與這些表面的黏結(jié)能力。這種發(fā)現(xiàn)與以往的用m7E3IgG(20μg/ml)抑制HUVEC與血纖蛋白原或玻連蛋白涂敷的玻璃表面黏結(jié)的報(bào)導(dǎo)不同[Charoetal.，J.Biol.Chem.262，9935-9938，(1987)]。對(duì)這種差別的解釋可能包括(1)此處的檢測是在含有血清(10％FCS)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，而先前的報(bào)導(dǎo)中的檢測是在不含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行的；(2)此處的檢測使用了c7E3Fab，而以往用的是m7E3Fab；(3)此處使用的是10μg/ml的c7E3Fab，而以往使用的是20μg/ml的m7E3Fab。然而，在此處的HUVEC激活實(shí)驗(yàn)中，高達(dá)100μg/ml的c7E3Fab都沒有影響早已經(jīng)通過被接種到明膠涂敷的組織培養(yǎng)塑料盤上建立起來的HUVEC單層?？偠灾逗闲?E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞的玻連蛋白受體在體外發(fā)生結(jié)合。嵌合性7E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞上的大約650,000個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，親和性大約為Ka＝1×108M-1。該抗體顯示出通過玻連蛋白受體(αvβ3)與內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，因?yàn)棣羦β3-特異性的抗體LM609完全抑制c7E3Fab的結(jié)合。c7E3Fab與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合沒有顯示出對(duì)細(xì)胞的激活，正如對(duì)激活-特異性標(biāo)記物的分析結(jié)果一樣。特別是，E-選擇蛋白和胞內(nèi)黏結(jié)分子-1(ICAM-1)的表達(dá)在接受c7E3Fab處理時(shí)沒有被提高。與抗體的結(jié)合沒有顯示出對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞單層的干擾或妨礙它們?cè)诨|(zhì)蛋白涂敷的表面上的建立。讓HUVEC同c7E3Fab接觸并沒有改變HUVEC與經(jīng)過玻連蛋白、纖連蛋白、或血纖蛋白原涂敷的表面的黏結(jié)和在這些表面上的傳播。另外，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)對(duì)多形核白細(xì)胞(PMN)的黏結(jié)并沒有因?yàn)榭贵w的處理而被提高。總的來說，c7E3在體外與內(nèi)皮細(xì)胞上的玻連蛋白受體結(jié)合，而該結(jié)合并沒有顯示出對(duì)細(xì)胞的激活，或影響它們?cè)诨|(zhì)蛋白上的傳播和黏結(jié)。等同物本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以充分理解并且能夠使用不超出常規(guī)的試驗(yàn)方法而得出本發(fā)明所述具體實(shí)施方案的等同方案。這些等同物都是本發(fā)明的權(quán)利要求書所要包括的。權(quán)利要求1.一種抑制狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給患者以有效劑量的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的化合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體為特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或它的一部分。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的免疫球蛋白或其片段是包括非人源的抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分的人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白的片段。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體(例如，7E3單克隆抗體)為特異性的抗體衍生的。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab’、或F(ab’)2片段。7.一種抑制狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，包括給患有冠心病的病人以有效劑量的能夠與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體發(fā)生特異性結(jié)合的化合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的化合物是與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體具有特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其片段。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白片段。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體具有特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。12.一種抑制接受了冠狀動(dòng)脈手術(shù)治療后人體發(fā)生復(fù)發(fā)性狹窄的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的包括對(duì)血小板為特異性的非人源抗原結(jié)合區(qū)和人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的手術(shù)是血管成形術(shù)。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的手術(shù)是斯坦特的安放。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的手術(shù)包括血管成形術(shù)和斯坦特安放。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa受體為特異性的。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從單克隆抗體7E3衍生來的。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的免疫球蛋白選自Fab、Fab’、和F(ab’)2片段。19.一種抑制進(jìn)行過血管手術(shù)后人體發(fā)生狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa特異性結(jié)合的化合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的手術(shù)是斯坦特的安放。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的血管手術(shù)是冠狀動(dòng)脈介入術(shù)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的手術(shù)是斯坦特的安放。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的手術(shù)是血管成形術(shù)。24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的手術(shù)包括血管成形術(shù)和斯坦特的安放。25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa具有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa具有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源恒定區(qū)的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa為特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa為特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab’、和F(ab’)2片段。30.一種抑制進(jìn)行了血管手術(shù)后人體發(fā)生狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄的方法，該方法包括給所述的人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體特異性結(jié)合的化合物。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的手術(shù)是斯坦特的安放。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的血管手術(shù)是冠狀動(dòng)脈介入術(shù)。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的手術(shù)是斯坦特的安放。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的手術(shù)是血管成形術(shù)。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的手術(shù)包括血管成形術(shù)和斯坦特的安放。36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白和嵌合性免疫球蛋白片段。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的單克隆抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab’、和F(ab’)2片段。41.一種降低或防止人體血管成形術(shù)和/或斯坦特安放后發(fā)生局部缺血綜合癥的方法，該方法包括給所述人體以有效劑量的與糖蛋白IIb/IIIa特異性結(jié)合的化合物。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa有特異性的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是包括從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa有特異性的抗體衍生來的非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白和嵌合性免疫球蛋白片段。44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結(jié)合的化合物。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的化合物是對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結(jié)合的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有選擇性結(jié)合的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段是7E3單克隆抗體或其一部分。47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段是包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源恒定區(qū)的嵌合性免疫球蛋白或嵌合性免疫球蛋白片段。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)是從對(duì)糖蛋白IIb/IIIa和αvβ3玻連蛋白受體有特異性的抗體(例如，7E3單克隆抗體)衍生來的。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的免疫球蛋白片段是Fab、Fab’、或F(ab’)2片段。全文摘要本發(fā)明描述了對(duì)GPⅡb/Ⅲa和玻連蛋白受體為特異性結(jié)合試劑。該試劑可以被用來降低或防止閉塞、復(fù)發(fā)性閉塞(例如急性堵塞)、狹窄和/或復(fù)發(fā)性狹窄。在一個(gè)實(shí)施例中,本方法使用了一種免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段,例如包括非人的抗原結(jié)合區(qū)和人恒定區(qū)的血小板特異性嵌合免疫球蛋白或其片段。文檔編號(hào)A61K38/00GK1186439SQ96194312公開日1998年7月1日申請(qǐng)日期1996年6月5日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者巴瑞·S·科勒,大衛(wèi)·M·奈特申請(qǐng)人:森特克公司,紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)