專(zhuān)利名稱(chēng)：巖藻肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巖藻肽，其制備方法，其作為藥物的應(yīng)用，以及含該巖藻肽的藥物制劑。
選擇蛋白受體家族，通過(guò)內(nèi)皮和血小板參與識(shí)別各種循環(huán)細(xì)胞，并對(duì)某些疾病，包括癌癥、自身免疫絮亂、炎癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和血栓等起作用這一觀點(diǎn)，已被廣泛接受。已知該家族有三種成員L-選擇蛋白、P-選擇蛋白，和E-選擇蛋白。
E-選擇蛋白(也稱(chēng)為內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子ELAM-1)是在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。例如，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的產(chǎn)生，隨相鄰組織受到損傷或受到微生物感染而增加。E-選擇蛋白識(shí)別唾液基Lewis x(SLex)，該唾液基是在中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面糖類(lèi)配體，是通過(guò)必需的膜糖蛋白和/或糖脂，固定于細(xì)胞膜的外膜上。通過(guò)與E-選擇蛋白結(jié)合，SLex介導(dǎo)白細(xì)胞和單核細(xì)胞結(jié)合于激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，這樣這些白細(xì)胞可以擴(kuò)散進(jìn)損傷組織中。
但是，許多情況下，通過(guò)粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的白細(xì)胞補(bǔ)給出現(xiàn)反常且過(guò)剩，該結(jié)果會(huì)使組織損傷，而不是修復(fù)。
雖然SLex已被認(rèn)為能用作消炎藥，且為臨床評(píng)價(jià)，其大規(guī)模合成已得到開(kāi)發(fā)，但在急性癥狀情況下，該天然糖類(lèi)只能以注射形式使用，因若口服將失活，且在血中其半衰期很短。
因此，需要一種可以影響配位體與選擇蛋白結(jié)合，預(yù)防初期細(xì)胞粘附過(guò)程的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供式1化合物
其中i)R是CH3，而R1是式(a1)或(a2)基團(tuán)
其中m是2或3；n是2或3；M是陽(yáng)離子；R2是氫，或至多20個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基，其ω位可任意帶有甲酰基，或者C1-4醇的縮醛或C2-4二元醇的縮醛基，R3是H、-CH2OH、或-CH2CH2OH；和R4是H、C1-4烷基、CH2OH、-CH2CH2OH或-CH2CH2CH2OH，其先決條件是1)R3和R4之一是氫2)當(dāng)R4是H時(shí)，R3是-CH2OH或-CH2CH2OH和3)當(dāng)R3是H時(shí)，R4是CH3、-CH2OH、-CH2CH2OH或-CH2CH2CH2OH；或者R1是式(b)基團(tuán)
其中R5是
其中p是1或2；q是2或3；r是1或2；R6是H，NH2或-NHRx，其中Rx是氨基保護(hù)基；R7a是-CH2OH、-CH2CH2OH或-CH(OH)-CH2OH；R7b是H，或R7a和R7b各自為CH2OH；R11是H或-OH；R13是-(CH2)j-COOM或-SO3M，其中j是1、2或3M定義同上；(b4)中苯基的第二個(gè)羥基取代基可在任意一個(gè)間位上；或者R1是式(c)基團(tuán)
其中R8是OM1、OR14、Rs-Rp或-NHRy，其中M1是陽(yáng)離子，R14是飽和或不飽和烴基，Rs是間隔基，Rp是磷脂?；?，而Ry是飽和或不飽和親脂基；R9是
其中s是1或2t是1或2v是2或3M、R6、R11和R13定義同上；R10a是-CH2OH、-CH2CH2OH、或-CH(OH)-CH2OHR10b是H，或者R10a和R10b各自為CH2OH；(c2)中苯基的第二個(gè)羥基取代基是在任意一個(gè)間位上，或者其中ii)R1是OH，而R是式(d)基團(tuán)
其中w是1或2；R12a是-CH(OH)-(CH2)x-OH；R12b是H，或R12a和R12b各自獨(dú)立地是-CH2OH或-CH2CH2OH；x是2或3；R6和M定義同上。
M可以是H+或者羧基或硫酸根的成鹽陽(yáng)離子，以保持式I化合物的水溶性，例如是單價(jià)的，或多價(jià)的1當(dāng)量的陽(yáng)離子，如鋰、鈉或鉀之類(lèi)的堿金屬離子、鈣或鎂之類(lèi)的堿土金屬陽(yáng)離子，以及鋅、鐵和鋁離子及銨(NH4+)離子。M優(yōu)選H+、Li+或Na+。優(yōu)選該陽(yáng)離子M是藥物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子。如果該陽(yáng)離子是多價(jià)的，則存在適當(dāng)數(shù)量的式I分子或式I化合物與1個(gè)或多個(gè)乙酸根、氯離子、碳酸根等這類(lèi)適當(dāng)?shù)年庪x子同時(shí)存在的混合物。M1可獨(dú)自為上面為M給定的定義之一，優(yōu)選其與M相同。
若Rx是氨基保護(hù)基，其可以是“有機(jī)合成中的保護(hù)基”(T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY，2nd ed.，Chapter 7，1991，及其中的參考文獻(xiàn))一書(shū)中所介紹的基團(tuán)。優(yōu)選藥物學(xué)上可接受的氨基保護(hù)基，尤其是叔丁氧羰基或芐氧羰基。
若式(a1)基團(tuán)中R2是飽和或不飽和烴基時(shí)，它可以是C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20鏈炔基。帶有甲酰基的R2之實(shí)例包括2-氧代-乙基、3-氧代丙基、5-氧代-戊-3-烯基、8-氧代-辛基和10氧代-癸-4-烯基。如果R2是由C1-4醇或C2-4二元醇形成的烷基或烯基縮醛基時(shí)，它可以是由上述醛使用C1-4醇或C2-4二元醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇、仲丁醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇或1，3-丁二醇)制備的任何縮醛。優(yōu)選R2是氫。
式(a1)基團(tuán)中，R4代表任何C1-4烷基，優(yōu)選CH3。
若R8是Rs-Rp或NHRy，則所得式I化合物可以被用于，或者說(shuō)適宜于用在脂質(zhì)制劑中，作為脂質(zhì)膜之部份，成為使用所述化合物之手段。間隔基團(tuán)R8是將羰基連接到磷脂酰基的氧上之殘基，例如烴殘基。磷脂酰基是用飽和和/或不飽和脂肪酸(如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸或油酸)脂化的甘油磷酸酯。
Ry可以是任意含有功能基(如-CO-)或由該功能基斷開(kāi)的飽和或不飽和脂族殘基，例如是以帶有飽和或不飽和脂肪族殘基的二羧酸二酯為基礎(chǔ)的殘基。Ry優(yōu)選下式基團(tuán)
其中X和Y各自獨(dú)立地是C8-20烷基或C8-20鏈烯基，而Z是橋連基，例如聚乙烯氧基，優(yōu)選聚(3-50，優(yōu)選3-15)-乙烯氧基，或-C1-4亞烷基-CO-，或-亞苯基-CO基團(tuán)。
式I化合物中，下面的定義屬優(yōu)選，無(wú)論是各條單獨(dú)的，或任何各條相結(jié)合，次結(jié)合的情況均可1.R是CH3，而R1是式(a1)基團(tuán)。
2.式(a1)基中，R2是H。
3.式(a1)基中，R3是H，而R4是-CH2OH。
4.式(a1)基中，R3是H，而R4是CH3。
5.R是CH3，而R1是式(b)基團(tuán)。
6.式(b)基團(tuán)中，R5是基團(tuán)(b1)。
7.式(b1)基團(tuán)中，R7a是CH2OH或CH(OH)-CH2OH而R7b是H。
8.基團(tuán)(a2)和(b3)中，-OC1-4烷基優(yōu)選為OCH3。
9.R是CH3，而R1是式(c)基團(tuán)。
1O.式(c)基團(tuán)中，R8是C1-6烷氧基，優(yōu)選甲基或乙基。
11.式(c)基團(tuán)中，R9是基團(tuán)(c1)。
12.基團(tuán)(c1)中，R10a是CH(OH)-CH2OH，而R10b是H。
13.式(c)基團(tuán)中，R9是基團(tuán)(c2)。
14.式(c2)基團(tuán)中，R6是NH2。
15.R1是OH，而R是式(d)基團(tuán)。
16.式(d)基團(tuán)中，R12a是CH(OH)-(CH2)x-OH而R12b是氫。
式I化合物中，可能含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子。除非有所說(shuō)明外，應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明包括所有不同的異構(gòu)體形式，對(duì)映體和非對(duì)映異構(gòu)體，以及其混合物，例如外消旋體。
式(a1)基團(tuán)中，帶有R3的不對(duì)稱(chēng)碳原子優(yōu)選為下述構(gòu)型
式(b1)基團(tuán)中，若帶有R7a和R7b的碳原子是不對(duì)稱(chēng)的(即R7b是H)，其優(yōu)選有下述構(gòu)型
該結(jié)構(gòu)也同樣適用于基團(tuán)(c1)中帶有R10a，而R10b是H的情況下的不對(duì)稱(chēng)碳原子。
基團(tuán)(b2)和(c3)中，吡咯烷基部份優(yōu)選下述構(gòu)型
基團(tuán)(b4)和(c2)中，帶有取代的芐基部份的不對(duì)稱(chēng)碳原子，優(yōu)選下述構(gòu)型
式(c)基團(tuán)優(yōu)選下述立體化學(xué)式
式(d)基團(tuán)中，若R12b是氫，帶有R12a的不對(duì)稱(chēng)碳原子優(yōu)選下述構(gòu)型
本發(fā)明也包括生產(chǎn)式I化合物的方法。可用與已知方法類(lèi)似之法來(lái)生產(chǎn)。例如通過(guò)除去以保護(hù)形式(例如氨基和/或羥基保護(hù)形式)存在于式I化合物中的至少一個(gè)保護(hù)基生產(chǎn)之。
保護(hù)形式的式I化合物，是其中存在于巖藻糖部份的羥基(或多個(gè)羥基)被加以保護(hù)的重要化合物。用于本發(fā)明中封閉或保護(hù)羥基的基團(tuán)是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的，假如需要，所述基團(tuán)可優(yōu)選用不至于明顯破壞分子的其余部份之方法來(lái)除去，例如通過(guò)化學(xué)或酶促水解，溫和條件下用化學(xué)還原劑處理，用紫外光照射，或催化加氫。利于應(yīng)用的保護(hù)(封閉)羥基的基團(tuán)是碳水化合物(糖)化學(xué)中，尤其是針對(duì)伯醇、仲醇及順、反鄰二醇的常用基團(tuán)。
例如，適宜的保護(hù)羥基的基團(tuán)可以是乙?；⑷纫阴；?、苯氧羰基、芐氧羰基、二苯甲氧羰基、三苯甲氧羰基和2，2，2-三氯乙氧羰基之類(lèi)的?；皇羌籽跫谆推S氧甲基、烯丙基、芐基、對(duì)甲氧芐基、對(duì)硝基芐基、二苯甲基、三苯甲基或是三(C1-C6)烷基硅烷基(如三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、三異丙基硅烷基、異丙基二甲基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、甲基二異丙基硅烷基或甲基二叔丁基硅烷基)、叔丁基二苯基硅烷基、三芳基硅烷基[如三苯基硅烷基、三(對(duì)二甲苯基)硅烷基]、或三芳烷基硅烷基(如三芐基硅烷基)之類(lèi)的三有機(jī)硅烷基等醚基。這些例子和其它適宜的羥基保護(hù)基，例如保護(hù)1、2，或1、3-二羥基的保護(hù)基，又如任意取代的亞甲基縮醛或亞乙基縮醛之類(lèi)的環(huán)醚基，以及其形成和除去的方法是本領(lǐng)域已知的，例如參閱“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”，Second ed.，(T.W.Greene and P.G.M.Wuts，John Wiley & Sons，New York，1991，Chapter 2)一書(shū)，及其中的參考文獻(xiàn)。
將R6是NHRx的式I化合物除去氨基保護(hù)基團(tuán)Rx，也可轉(zhuǎn)換成R6是NH2的式I化合物。
如此獲得的式I化合物可以以游離的或其鹽的形式回收。
用作初始原料的，R是CH3，而R1是式(a)基團(tuán)的保護(hù)形式之式I化合物，可以按下述反應(yīng)路線1合成
反應(yīng)路線1
X是羥基保護(hù)基，如上面所示。R′是離去基團(tuán)，比如氨基保護(hù)基，例如Boc或Fmoc。為了獲得帶有所希望之構(gòu)型的式I化合物，優(yōu)選采用的初始原料為特定的對(duì)映體。
用作初始原料，R是CH3，R1是式(b)基團(tuán)的式I保護(hù)形式化合物，可以按下述反應(yīng)路線2制備
反應(yīng)路線2
Ry是離去基團(tuán)，例如鹵素，優(yōu)選F。步驟ii是還原反應(yīng)，它欲包括還原疊氮基的已知還原法，例如與膦(如三苯基膦)或氫化物(如氫化鋁鋰)的反應(yīng)。步驟iii是生成酰胺鍵的偶聯(lián)反應(yīng)，例如在肽化學(xué)領(lǐng)域中是已知的?；衔颕I可以從例如保護(hù)形式的ASP-Ser-OH，Glu-Ser-OH，Glu-(α-羥甲基)Ser-OH(如化合物10)中挑選。步驟iii也可以包括與保護(hù)形式的適當(dāng)氨基酸偶聯(lián)，接著再與反應(yīng)路線I所述的二元酸衍生物反應(yīng)。
R是CH3，而R1是式(c)基團(tuán)的保護(hù)形式式I化合物，可按下述反應(yīng)路線3制備
反應(yīng)路線3
R8a是C1-6烷基。Ra是氨基保護(hù)基?；衔颕V可以從例如保護(hù)形式的2-氨基-3，4-二羥基丁酸，α-羥甲基絲氨酸，或Glu-Tyr-OH中挑選，如(2S，3R)-N-Boc-2-氨基-4芐甲氧基-3-羥基丁酸。R9aCO是化合物IV的氨基酸殘基(可用二元酸殘基任意構(gòu)成氨基酸殘基)。步驟i)和ii)是按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的酰胺鍵偶聯(lián)反應(yīng)。步驟ii)也可以包括與保護(hù)形式的適當(dāng)氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)，接著再與二元酸衍生物反應(yīng)，如反應(yīng)路線1所述。步驟ii)還可進(jìn)一步包括將-COOR8a轉(zhuǎn)換成-COR8，例如轉(zhuǎn)換成酸、酸的鹽、親脂性的酯或親脂性的酰氨，如實(shí)例44和45所述的?；衔颕II可以以任一對(duì)映體的形式，或以其混合物的形式使用。上述方案3描述R是CH3，R1是式(c)基團(tuán)，帶有優(yōu)選構(gòu)型的式I化合物之制備方法。
用作初始原料，R1是OH、R是式(d)基團(tuán)(其中R12a是CH(OH)-(CH2)x-OH)的保護(hù)形式式I化合物可如下述反應(yīng)路線4制備之反應(yīng)路線4
在巖藻糖部份，優(yōu)選二個(gè)相鄰的X基團(tuán)(羥基保護(hù)基)連為一體，形成
上述反應(yīng)可以類(lèi)似的已知方法進(jìn)行，如下面實(shí)例所述。沒(méi)有具體介紹的初始原料之生產(chǎn)法，則所述化合物是已知的或可用類(lèi)似的本領(lǐng)域已知和實(shí)踐過(guò)的方法來(lái)制備。
下面的實(shí)施例是本發(fā)明的舉例說(shuō)明。所有溫度是℃。
采用下面的縮寫(xiě)AC＝-COCH3BD＝芐基
Boc＝叔丁氧羰基Fmoc＝9-芴基甲氧羰基DAST-三氟化二乙氨基硫EDCI＝1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽EDAC＝1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳化二亞胺DMF＝二甲基甲酰胺HOBT＝1-羥基苯并三唑TFA＝三氟乙酸實(shí)施例1
在鈀/碳催化劑上與氫氣反應(yīng)而使化合物6去保護(hù)基，然后用甲醇鈉處理，得到化合物7鈉鹽。1H NMR(500MHz，D2O)δ1.16(d，J＝6.3Hz，3H)，1.75-1.92(m，4H)，2.35(m，1H)，3.20(m，1H)，3.43(m，1H)，3.55(dd，J＝6.0，12.0Hz，1H)，3.67(dd，J＝3.0，12.0Hz，1H)，3.73(m，2H)，2.84-4.02(m，4H)；13C NMR(125MHz，D2O)δ16.6，21.6，24.5，34.3，35.4，37.5，56.5，63.4，68.2，68.7，70.8，71.9，72.6，74.4，166.8，172.5，177.0；電子噴射質(zhì)譜m/z 423〔(MH)+，C17H31O10N2的計(jì)算值為423〕。
用作原料的化合物6可制備如下a)將巖藻糖四乙酸酯，在無(wú)水乙腈中，于室溫下與烯丙基三甲基硅烷和三氟化硼醚合物反應(yīng)，得到化合物2(α∶β之比大于10∶1)見(jiàn)Kozikowsky，A.P.和Sorgi，K.L.Tetrahedron Lett.(1983)，241563
b)于三苯基膦存在下，將化合物2與臭氧反應(yīng)而分解。然后將所產(chǎn)生的醛不經(jīng)分離，直接在乙酸銨存在下，于鈀/碳催化劑上與氫氣反應(yīng)，進(jìn)行還原氨化，得到帶有2-氨基-乙基的相應(yīng)巖藻糖四乙酸酯(化合物3)。c)將上面獲得的化合物3，于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽溶液中與(1S，2R)-2-N-Boc-氨基-4-芐氧基-3-羥基丁酸(根據(jù)Wong等人，在Tetrahedron Lett，1995，36，4081中所述，將甘氨酸和O-芐基糖醛通過(guò)蘇氨酸醛縮酶催化而制備)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，形成酰胺化合物5，
d)用乙酸乙酯在酸性溶液中(4N HCl)處理以除去化合物5上的保護(hù)基。將該脫保護(hù)產(chǎn)物不經(jīng)分離直接與戊二酸酐(在三乙胺緩沖液中)反應(yīng)，得到化合物6。
采用與上面實(shí)施例1類(lèi)似之方法，可以制備下式化合物
其中R1、R2、n和m有下述表1所示之定義。
表I實(shí)施例 R1R2n m2CH2OH H 2 33CH3H 1 34H CH2OH 1 35a CH3H 1 25b CH2CH2OH H 1 25c CH2CH2OH H 1 3采用與實(shí)例1相似之方法，但使用適當(dāng)?shù)脑?，獲得實(shí)例6化合物
實(shí)施例7
將化合物11(122mg，0.12mmol)溶于甲醇中(2ml)、加入Pd(OH)2/C(20mg)，將該混合物在氫氣(latm)中攪拌12小時(shí)。通過(guò)硅藻土濾出催化劑，并用硅膠層析(CHCl3/甲醇3∶1)和生物膠P2層析(H2O)將產(chǎn)物提純。純化后獲得化合物12。
1H NMR(500MHz，D2O)δ1.48(d，3H，J＝7.0Hz，H-6)，1.47-1.74(m，4H)，1.74(s，9H)，2.00-2.11(m，3H)，2.47(m，1H)，3.64(s，1H，H-4)，3.76(m，1H)，3.97-4.25(m，6H，H-2，H-3，H-5)，4.65-4.74(m，2H)，5.31(d，1H，J＝3.5Hz，H-1).13C NMR(125 MHz，D2O)δ15.80，23.73，24.51，28.18，30.18，31.60，39.68，49.47，53.42，55.89，55.99，62.39，67.12，68.42，70.08，72.39，94.38，94.65，170.9，171.1，174.7，178.1.HRMS計(jì)算值C24H41N3O12Cs(M+Cs+)696.1745，實(shí)測(cè)值696.1717用作初始原料的化合物11制備如下a)
將2，3，4-三-O-芐基-L-巖藻吡喃糖，于0°溶解于無(wú)水二氯甲烷中，并將DAST(1.06g，0.0066mol)滴加入。將混合物于0°攪拌30分鐘后，加入水使反應(yīng)驟停。用二氯甲烷提取水溶液，并將有機(jī)層合并，以MgSO4干燥并過(guò)濾。蒸發(fā)溶劑，不經(jīng)提純即將該氟化物用于糖基化反應(yīng)。0°下，將4分子篩，氯化錫(II)(1.67g，0.0088mol)和高氯化銀(1.82g，0.0088mol)加入到該氟化物的無(wú)水二氯甲烷(20ml)溶液中。將該混合物攪拌5分鐘，并加入(R，R)疊氮環(huán)己醇(0.93g，0.0066mol)。反應(yīng)物升溫至室溫并攪拌6小時(shí)，用硅藻土過(guò)濾之后，將濾液濃縮，并用硅膠層析提純(己烷/乙酸乙酯8∶1)。獲得化合物8，為清徹油狀物。b)
將化合物8(1.3g，2.33mmol)溶于四氫呋喃(10ml，含1％水)中，并加入三苯基膦(638mg，2.56mmol)。于室溫下攪拌該混合物5小時(shí)。蒸走溶劑后，在硅膠柱中，以CHCl3/甲醇(50∶1-30∶1)層析提純殘留物。得到化合物9，為糖漿狀。c)
將O-芐基-N-Boc-L-天冬氨酸溶于無(wú)水二氯甲烷中，加入EDAC(640.3mg，3.34mnol)和N-羥基琥珀酰亞胺(384.4mg，3.34mmol)。于4°下將該混合物攪拌12小時(shí)，并蒸出溶劑。經(jīng)硅膠層析提純(乙酸乙酯/己烷1∶1.5-1∶1)獲得O-芐基-N-Boc-天冬氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯。
將O-芐基-N-Boc-天冬氨酸N-琥珀酰亞胺酯(603mg，1.44mmol，和O-芐基-絲氨酸(281mg，1.44mmol)溶于DMF(2ml)中，加入Et3N(1ml)。于室溫下攪拌該混合物1小時(shí)。蒸走溶劑并經(jīng)硅膠層析(CHCl3)后得到產(chǎn)物10。d)，于室溫下，將酸10(141mg，0.29mmol)，EDAC(81mg，0.42mmol)和HOBT(57mg，0.42mmol)溶于二氯甲烷(2ml)中并攪拌5分鐘。然后加入化合物9(148mg，0.56mmol)。將該混合物于室溫下攪拌3小時(shí)，蒸走溶劑，將殘留物加于硅膠柱(己烷/乙酸乙酯1.5→1∶1)上，獲得化合物11，為糖漿狀。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.20(d，3H，J＝6.5Hz，H-6)，1.08-1.60(m，4H)，1.44(s，9H)，1.73(m，1H)，1.94(m，3H)，2.71(m，1H)，3.05(m，1H)，3.65(dd，1H，J＝3.5，9.5Hz)，3.76(m，1H，H-4)，3.89(dd，1H，J＝3.0，9.5Hz)，3.98(dd，1H，J＝2.5，10.0Hz，H-3)，4.04(dd，1H，J＝3.5，10.0Hz，H-2)，4.10(m，1H，H-5)，4.44(m，1H)，4.61(m，1H)，4.68(m，1H)，4.95(d，1H，J＝3.5Hz，H-1)，4.45-5.17(m，10H)，5.68(m，1H)，7.33(m，25H).13C NMR(125MHz，CDCl3)δ16.72，23.34，23.82，28.20，36.29，36.59，50.42，50.65，52.45，52.58，52.82，66.69，66.72，66.78，69.26，73.09，73.18，74.80，75.98，75.98，77.73，79.35，94.52，128.0(m)，135.2，135.3，137.5，183.6，139.0，155.3，169.6，170.2，170.6，171.9.HRMS計(jì)算值C59H71N3O12Cs(M+Cs+)1146.4092，實(shí)測(cè)值1146.4035。
采用與上述實(shí)施例7類(lèi)似之方法，使用適當(dāng)原料，可制備下式化合物
其中R5如表2所示。表2實(shí)施例 R5HRMS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值8 611.1217 611.12419 611.1217 611.124110
485.2111 485.212711 625.1373 625.1355表2(續(xù))實(shí)施例 R5HRMS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值12 726.1850 726.183213 516.2169 516.216914
15 637.1373 637.1353表2(續(xù))實(shí)施例 R5HRMS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值16 672.1533 672.154617
實(shí)施例11的化合物1H NMR(500MHz，D2O)δ1.10(d，3H，J＝6.5Hz，H-6)，1.20(m，4H)，1.75(m，6H)，2.16(m，1H)，2.56(t，2H，J＝7.5Hz)，2.33(m，2H)，3.41(m，1H)，3.43(m，2H)，3.63(m，2H，H-2 andH-3)，3.69(m，1H，H-4)，3.78(m，1H，H-5)，4.09(ddd，1H，J＝2.5，6.0，8.5Hz)，4.46(d，1H，J＝2.5Hz)，5.02(d，1H，J＝3.0Hz，H-1).13C NMR(125MHz，D2O)δ15.85，21.96，23.71，24.60，28.84，31.41，35.38，35.45，53.67.55.19，62.73，67.13，68.26，69.88，71.65，72.22，75.19，93.31，172.3，176.實(shí)施例12的化合物1H NMR(500MHz，D2O)δ1.12(d，3H，J＝6.5Hz，H-6)，1.08-1.26(m，4H)，1.39(s，9H)，1.65-1.80(m，3H)，2.14(m，1H)，2.74(m，2H)，3.39-3.88(m，9H)，4.37(m，2H)，4.98(d，1H，J＝3.5Hz，H-1).13C NMR(125MHz，D2O)δ15.82，23.70，24.58，28.03，29.30，31.78，37.32，52.05，53.40，55.55，62.93，67.14，68.32，69.95，71.99，72.25，76.23，82.21，94.06，157.6，170.8，173.4，175.8.實(shí)施例13的化合物1H NMR(500MHz，D2O)δ1.15(d，3H，J＝6.5Hz，H-6)，1.10-1.40(m，4H)，1.66-1.85(m，3H)，2.16(m，1H)，2.59(dd，1H，J＝8.5，17.5Hz)，2.72(dd，1H，J＝5.0，17.5Hz)，3.40(m，1H)，3.51(dd，1H，J＝6.0，12.0Hz)，3.56(dd，1H，J＝3.5，10.0Hz，H-3)，3.60(m，1H)，3.64(dd，1H，J＝4.0，10.0Hz，H-2)，3.69(m，1H，H-4)，3.73(m，1H)，3.85(m，1H)，3.91(m，1H，H-5)，4.15(m，1H)，4.40(d，1H，J＝7.0Hz)，5.00(d，1H，J＝4.0Hz，H-1).13C NMR(125MHz，D2O)δ15.77，23.69，24.62，29.06，31.80，38.41，51.47，53.40，55.59，62.76，67.09，68.35，69.91，71.79，72.24，75.68，93.63，170.6，176.8，176.8.
實(shí)施例18
按實(shí)施例5的方法進(jìn)行加氫反應(yīng)而使化合物15的芐基裂解。得到化合物16(無(wú)定形)1H NMR(400MHz，D2O)δ4.98(d，J＝3.2Hz，1H，H-1)，4.61(d，J＝2.2Hz，1H)，4.56(d，J＝7.2Hz，1H)，4.46-4.44(dd，J＝2.2 and 6.4Hz，1H)，4.28-4.13(m，3H)，4.02-3.98(m，1H)，3.86-3.59(m，5H)，2.42-2.22(m，4H)，1.90-1.79(m，2H)，1.30-1.18(m，9H)；電子噴射負(fù)離子質(zhì)譜，去電離粒子點(diǎn)群的電位＝-80V)m/e523〔(M-H)；計(jì)算值C21H36N2O13524〕用作原料的化合物15可制備如下a)
根據(jù)Wong等人在J.Org.Chem.1994，59，864中所述方法，首先將L-巖藻糖轉(zhuǎn)化成亞磷酸三芐基巖藻糖酯。在二氯甲烷中，于0℃，用三氟甲磺酸(0.1當(dāng)量)作催化劑，將所得化合物(1.0當(dāng)量)與Boc-L-Thr-OEt(1.1當(dāng)量)偶聯(lián)，按標(biāo)準(zhǔn)方法處理和提純后得化合物13。
首先于25℃，在30％TFA(0.1M CH2Cl2中)中將化合物13(0.1M CH2Cl2中)處理30分鐘，使其保護(hù)基-Boc脫除。加水使反應(yīng)驟停，NaHCO3洗滌，硫酸鈉干燥，由閃柱層析提純，得到相應(yīng)的游離胺。于0℃，使用1.5當(dāng)量EDCI、1.5當(dāng)量HOBt、0.1M CH2Cl2，使該胺(1.0當(dāng)量)與1.1當(dāng)量(2S，3R)-N-Boc-2-氨基-4-芐氧基-3-羥基-丁酸偶聯(lián)，反應(yīng)30小時(shí)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)法處理和閃柱層析提純后，得到化合物14。
于25℃，30％TFA下，將化合物14(0.1M CH2Cl2中)處理30分鐘，使其脫去Boc保護(hù)基。然后加水使反應(yīng)驟停，用NaHCO3洗滌，并用硫酸鈉干燥。用閃柱層析提純后，于25℃，CH2Cl2中使其與1.1當(dāng)量戊二酸單芐酯、1.5當(dāng)量EDCl、1.5當(dāng)量HOBt偶聯(lián)，得化合物15?；衔?51H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.21-7.50.(m，25H)，6.75(d，J＝7.6Hz，1H)，5.12-4.57(m，11H)，4.35-3.99(m，7H)，3.80-3.60(m，5H)，2.45(t，J＝7.5Hz，2H)，2.43(t，J＝7.0Hz，2H)，1.98(t，J＝7.5Hz，2H)，1.20-1.26(m，6H)，1.06(d，J＝6.4Hz，3H)；HRMSC56H66N2O13+Cs+(M+Cs+)，計(jì)算值1107.3614，實(shí)測(cè)值1107.3667。
按與實(shí)施例18相似之方法，使用適當(dāng)初紿原料可制備下式化合物
其中R8和R9定義同表3表3實(shí)施例R8R9MS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值19H
ES (M-H-)496 49520Li+
ES (M-H+)495 49521H
ES (M-H-)543 542表3(續(xù))實(shí)施例R8R9MS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值22 C2H5 543.2166 543.217523 C2H5 543.2166 543.214824 C2H5 785.0299 785.032825 C2H5 -51951926 C2H5
表3(續(xù))實(shí)施例 R8R9MS計(jì)算值 實(shí)測(cè)值27 C2H5 669.1272 669.128728 C2H5 842.9708 842.9672實(shí)施例29
于室溫下，在90％TFA/H2O(1ml)中，將糖肽19(23.7mg，40μmol)的溶液攪拌。3小時(shí)后，將該溶液減壓蒸干，再與甲苯(2×5ml)共沸兩次。將粗產(chǎn)物進(jìn)行NMR分析，確信異亞丙基部份被除去，然后不經(jīng)提純將該產(chǎn)物進(jìn)行下步反應(yīng)。
按實(shí)例5之方法，將該糖肽粗產(chǎn)物加氫，得到白色固體化合物20R(4∶1∶1 nBuOH∶H2O∶HOAc)0.291H nmr(400MHz；D2O)5.23(d，J 3.7，H1α)，4.55(dd，J 7.9和4.7，H1β)，4.37-4.32(m，H2′(α+β))，4.15-4.05(m，H5α+H3′β)，3.95-3.92(m，H4α+H3′α)，3.86(d，J 3.4，H4β)，3.83(dd，J 10.3和3.2 H3α)，3.78(dd，J 10.3和3.7，H2α)，3.74-3.68(m，H5β)3.64-3.61(m，H3β+C6′H2(α+β))，3.55-3.44(m，H2β+C6HaHb(α+β))，3.42-3.31(m，C6HaHb(α+β))，2.62-2.48(m，C2″H2(α+β))+C3″H2(α+β))，1.76-1.47(m，C4′H2(α+β))+C5′H2(α+β))；13C nmr(100MHz；D2O)182.93，179.11，175.20，174.66，98.86，94.80，75.19，75.08，75.02，74.21，72.91，71.78，71.48，71.28，71.18，70.71，70.52，63.84，63.80，61.00，60.90，60.48，42.15，42.03，34.71，34.19，34.12，31.84，31.44，31.14高分辨質(zhì)譜(以NaI摻雜)實(shí)測(cè)值M+Na 447.1570，C16H28N2O11計(jì)算值M+Na 447.1591。
用作原料的化合物19可按下述方法制備a)
通氬氣，-20℃下，將EDCI(95.4mg，500μmol)加至攪拌著的6-氨基-6-脫氧-1，2，3，4-二異亞丙基-α-L-半乳糖苷(130mg，500μmol)、(2S，3RS)-2-N-Boc-氨基-6-芐氧基-3-羥基-己酸(177mg，500μmol)、HOBT(68mg，500μmol)和-甲基嗎啉(108μl，1000μmol)得無(wú)水DMF(5ml)溶液中。所得混合物于-20℃下攪拌1小時(shí)，然后使之慢慢升溫至室溫。14小時(shí)之后，將反應(yīng)溶液用5％W/V檸檬酸溶液(20ml)使反應(yīng)驟停，并用乙酸乙酯(6×25ml)提取。合并的有機(jī)提取液用飽和碳酸氫鈉溶液(50ml)及飽和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，用MgSO4干燥并減壓蒸干。殘留油狀物以閃柱層析(硅膠，使用含40％→50％→66％乙酸乙酯的己烷梯度液洗脫)提純，得到淺黃泡沫狀的化合物17Rf(75％乙酸乙酯的己烷溶液)0.66。b)
于室溫下通氬氣，將糖肽17(59.5mg，100μmol)在15％v/v三氟乙酸在無(wú)水4-(二氰亞甲基)-2-甲基-6-(4-二甲氨基苯乙烯基)4-H-吡喃(1ml)中的溶液攪拌2小時(shí)后，將該溶液減壓蒸干，并將殘留的油狀物溶解于正丁醇∶水∶甲醇(5∶3∶2)(10ml)中。在該溶液中加入DOWex(Cl-，用甲醇予洗滌，100mg)，將該混合物攪拌30分鐘，然后過(guò)濾，用甲醇(3×5ml)洗滌固體物，并將合并的濾液及洗滌液減壓蒸發(fā)。用閃柱層析(硅膠，使用19∶0.9∶0.1→9∶0.9∶0.1 DCM∶MeOH∶NH3(aq)梯度液洗脫)提純殘留之油狀物，得到淺棕色油狀的化合物18∶Rf(9∶0.9∶0.1 DCM∶MeOH∶NH3(aq))0.42。c)室溫下將琥珀酸酐(6.0mg，60μmol)加入到攪拌下的氨基糖肽18(27.7mg，56μmol)的甲醇(1ml)溶液中。1小時(shí)之后，將溶液于減壓下蒸干。用閃柱層析提純固體殘留物(硅膠，使用5-10％乙酸的乙酸乙酯梯度液洗脫)得到黃白色膠狀的化合物19。Rf(10％乙酸/乙酸乙酯)0.49IR(薄膜)cm-13303，2980，2935，1644，1558，1436，1382，1255，1211，1167，1109，1070，1006，9011H nmr(400MHz；CD3OD)7.32-7.23(5H，m，aromatic)，5.44(1H，d，J 5.0，2×H1)，4.59(1H，dd，J 7.9 and 2.1，2×H3)，4.48(2H，s，2×CH2Ph)，4.38-4.34(1H，m，2×H′2)，4.31(1H，dd，J 5.0and 2.4，2×H2)4.21(1H，d，J 7.9，2×H4)，4.00-3.89(1.5H，m，2×H5+H3′)，3.84-3.76(0.5H，m，H3′)，3.52-3.46(3H，m，2×C6HaHb+2×C6′H2)，3.27-3.20(1H，m，2×C6HaHb)，2.56-2.48(4H，m，2×C2″H2+2×C3″H2)，1.80-1.54(4H，m，2×C4′H2+2×C5′H2)，1.45(3H，s，丙酮化合物Me)，1.40(3H，s，丙酮化合物Me)，1.32(3H，s，丙酮化合物Me)，1.29(3H，s，丙酮化合物Me)13C nmr(100MHz；CD3OD)137.21，126.78，126.24，126.03，107.86，107.34，95.19，71.24，70.06，69.56，69.28，69.24，68.58，64.68，56.66，38.02，28.96，28.35，24.54，23.83，23.75，22.62，21.99高分辨質(zhì)譜(用CsI摻雜)實(shí)測(cè)值M+Cs，727.1875。C29H42N2O11理論值M+Cs，727.1843。
按實(shí)例29相似之法，使用適當(dāng)?shù)脑?，可制備下式化合?
其中RA和RB如表4所定義的表4實(shí)施例 RARB
表4(續(xù))實(shí)施例 RARB
表4(續(xù))實(shí)施例 RARB
實(shí)施例44
27R′＝Bn28R′＝H于化合物27(91.4mg，59.2μmol)的甲醇(5ml)溶液中，加入Pd/(OH)2/C(20mg)，在氫氣球通入氫氣下將該混合物攪拌2天。將催化劑濾出，并在真空下蒸發(fā)濾液。將殘留物進(jìn)行硅膠柱層析(CHCl3∶MeOH＝1∶1)，然后用Sephadex LH20凝膠過(guò)濾層析(以MeOH洗脫)獲得所需兩親性的化合物28。1H NMR(500MHz，CD3OD)d 0.80(6H，t，J＝6.5)，1.16(6H，d，J＝5.5)，1.23-1.41(52H，m)，1.60-1.71(4H，m)，2.04-2.17(2H，m)，2.31-2.60(6H，m)，2.66-2.77(2H，m)，2.97-3.09(2H，m)，3.31-3.40(3H，m)，3.50-3.71(14H，m)，3.79-3.87(1H，m)，3.88-3.98(1H，m)，4.04-4.26(4H，m)，4.44-4.56(3H，m)，4.95(1H，brs).HRMS計(jì)算值C62H114N4O17Cs(M+Cs)1319.7233，實(shí)測(cè)值1319.7264用作原料的化合物27制備如下
化合物21將亞磷酸二芐基2，3，4-O-三芐基-α-L-巖藻吡喃糖基酯(138mg，0.204mmol)、N-Fmoc蘇氨酸烯丙酯(77.5mg，1當(dāng)量)及分子篩4(470mg)的懸浮液，于室溫下攪拌18小時(shí)。于-15℃，將該混合物加入TMSOTf(13.6mg，0.3當(dāng)量)的CH2Cl2(1ml)溶液中。同溫度下攪拌2小時(shí)后，加入飽和NaHCO3水溶液使反應(yīng)驟停，然后用CH2Cl2使混合物稀釋。分出有機(jī)層用MgSO4干燥并真空蒸發(fā)。將殘留物進(jìn)行硅膠柱層析(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)獲得化合物21。化合物22于化合物21(104mg，0.13mmol)的CH2Cl2(5ml)溶液中加入Et2NH(0.72ml，53當(dāng)量)，將該混合物于室溫下攪拌18小時(shí)。真空除去溶劑和反應(yīng)劑，用硅膠柱層析(CH2Cl2～CH2Cl2∶MeOH＝100∶3)提純殘留物，得到化合物22?；衔?3在0℃下，于化合物22(242mg，0.42mmol)和N-芐基戊二酰胺-L-脯氨酸(135mg，1當(dāng)量)的CH2Cl2(5ml)溶液中依次加入HOBT(86mg，1.5當(dāng)量)和EDC(105mg 1.3當(dāng)量)。在此溫度下將反應(yīng)混合物攪拌20分鐘，并于18小時(shí)內(nèi)將溫度升至室溫。真空蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，并將殘留物溶解于EtOAc，依次用1N HCl、飽和NaHCO3和食鹽水洗滌該EtOAc溶液。用MgSO4干燥有機(jī)層并真空蒸發(fā)。將殘留物進(jìn)行硅膠柱層析(甲苯～甲苯∶丙酮＝2∶l)，得到化合物23?；衔?4于化合物23(169mg，0.192mmol)和嗎啉(167mg，10當(dāng)量)的THF(10ml)及DMF(1ml)溶液中，室溫通氬氣條件下，加入Pd(pph3)4(23mg，0.1當(dāng)量)。攪拌24小時(shí)后真空蒸發(fā)反應(yīng)混合物。用EtOAc溶解殘留物，并用1N HCl洗滌。分出有機(jī)層，用MgSO4干燥并真空蒸發(fā)。用硅膠柱層析提純殘留物(CH2Cl2～CH2Cl2∶MeOH 10∶1洗脫)、得到化合物24。b)脂部份的合成
化合物25在-78℃下，于草酰氯(1.54ml，2N CH2Cl2溶液)溶液中，以每2分鐘間隔，加入DMSO(277mg，1.5當(dāng)量)的CH2Cl2(3ml)溶液和2-〔2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基〕乙醇的CH2Cl2(5ml)溶液。同溫度下，將混合物攪拌30分鐘后，將Et3N(1.64ml)加入到混合物中(-78℃)，1小時(shí)內(nèi)使溫度回升到室溫。將反應(yīng)混合物傾入冰水中，用CH2Cl2提取。依次用1N HCl和飽和NaHCO3洗滌有機(jī)層，用MgSO4干燥并真空蒸發(fā)。不需進(jìn)一步提純?cè)摯之a(chǎn)物醛便可使用。在該醛的粗品和1′，3′連十六烷基-L-谷氨酸對(duì)-甲苯磺酸鹽(500mg，1當(dāng)量)，的THF(3ml)和MeOH(9ml)溶液中加入NaCNBH3(41mg)(0℃下)。將該混合物于0℃攪拌1小時(shí)，18小時(shí)內(nèi)將溫度升至室溫。真空蒸出溶劑，用CH2Cl2溶解殘留物。用1N HCl洗滌溶液后，用MgSO4干燥有機(jī)層并真空蒸發(fā)，殘留物進(jìn)行硅膠柱層析(Hex-EtOAc＝4∶1)，獲得化合物25?；衔?6在化合物25(320mg，0.427mmol)的MeOH(13ml)、THF(3ml)和1N HCl(1.3ml)溶液中加入Pd/C(99mg)，通氫氣下將該混合物攪拌2天。濾出催化劑，真空蒸發(fā)濾液。殘留物中加入飽和NaHCO3，并用EtOAc提取該混合物。用MgSO4干燥有機(jī)層并真空蒸發(fā)，獲得化合物26。sLex模擬物與脂類(lèi)間的偶聯(lián)化合物27O℃下，在化合物24(94.6mg，0.113mol)和化合物26(81.7mg，1當(dāng)量)的CH2Cl2(5ml)溶液中，依次加入HOBT(23mg，1.5當(dāng)量)和EDC(29mg，1.3當(dāng)量)。0℃下攪拌該混合物，20小時(shí)內(nèi)使溫度升至室溫。真空蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，用EtOAc溶解殘留物。用飽和NaHCO3洗滌該溶液后，用MgSO4干燥有機(jī)層并真空蒸發(fā)。用硅膠柱層析提純?cè)摎埩粑?甲苯∶丙酮＝1∶1洗脫)，獲得化合物27。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.88(6H，t，J＝7.0)，1.12(3H，d，J＝6.0)，1.17(3H，d，J＝6.0)，1.21-1.41(52H，m)，1.57-1.65(4H，m)， 1.88-1.97(2H，m)，2.12-2.20(1H，m)，2.22-2.29(1H，m)，2.38(2H，t，J＝7.0)，2.45-2.83(5H，m)，3.18-3.27(2H，m)，3.42-3.59(10H，m)，3.63(1H，brs)，3.66(1H，dd，J＝11.0，4.0)，3.82(1H，dd，J＝10.3，3.0)，3.84(1H，q，J＝7.0)，4.01-4.13(4H，m)，4.48-4.58(4H，m)，4.61(1H，d，J＝11.5)，4.64(1H，d，J＝11.5)，4.69(1H，d，J＝11.5)，4.74(1H，d，J＝11.5)，4.75(1H，d，J＝11.5)，4.92(1H，d，J＝11.5)，4.96(1H，d，J＝3.5)，5.06(2H，s)，7.10(1H，brt，J＝3.0)，7.25-7.43(20H，m)，7.87(1H，t，J＝9.0).m/z C90H138N4O171548(M+H)實(shí)施例45按實(shí)施例44之類(lèi)似方法，使用適當(dāng)原料，可獲得下面化合物
1H NMR(500MHz，CDCl3)d 4.80(d，J＝2.6Hz，1H)，4.46(t，J＝8.5 Hz，1H)，4.42-4.40(m，4H)，4.05-3.95(m，6H)，3.76-3.43(m，6H)，2.23(t，J＝7.7Hz，2H)，2.30-2.20(m，3H).212-2.01(m，2H)，h.98-1.91(m，4H)，1.85-1.77(m，1H)，1.57-1.50(m，4H)，1.25-1.13(br..＞50H)，1.11(d，J＝6.3Hz，3H).1.09(d，J＝6.6Hz，3H)，0.78(t，J＝6.7Hz，6H)；MS m/e calc′d for C59H106N4O16Cs(M+Cs+)1259.6658，found 1259.6620式I化合物及其藥物學(xué)上可接受之鹽具有藥理活性，因此可作為藥物使用。特別是，它們能抑制在其表面含有選擇蛋白(如E-選擇蛋白)的細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(如其細(xì)胞表面有SLex的HL-60細(xì)胞或中性白細(xì)胞)或合成的多-SLex或多-SLea產(chǎn)物之間的粘附作用。更特別的是，該式I化合物能抑制SLex結(jié)合到E-選擇蛋白上，實(shí)驗(yàn)方法如下所示a)制備溶解型E-選擇蛋白將與K輕鏈(mCk)的不變區(qū)融合的E-選擇蛋白胞外區(qū)克隆進(jìn)桿狀病毒穿梭載體pVL941(Invitrogen)中，并在SF-9細(xì)胞中表達(dá)。使用偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠上的鼠抗-小鼠Ck單克隆187.1抗體進(jìn)行親和層析，將該可溶性融合蛋白提純。細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)測(cè)試化合物I阻隔HL-60細(xì)胞粘附于固定在96孔板上的E-選擇蛋白之能力。將鼠抗-小鼠Ck抗體加于96孔板(20μg/ml，在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中，pH9.5)上，并于4℃保溫過(guò)夜。于室溫下，將該板以在檢測(cè)的緩沖液(20mM HEPES，pH7.4，含150mMNaCl和1mM CaCl2)中的3％BSA封閉8小時(shí)，并用檢測(cè)的緩沖液洗3次。加入E-選擇蛋白小鼠Ck融合蛋白(10μg/ml，于檢測(cè)的緩沖液中)，于37℃保溫2小時(shí)，或4℃保溫過(guò)夜。用檢測(cè)的緩沖液洗滌該板3次。然后加入欲檢測(cè)之化合物，并于37℃予保溫15-30分鐘。將檢測(cè)緩沖液中的1×105標(biāo)記HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)移到各孔中，使其于37℃粘附于E-選擇蛋白30-45分鐘。然后用檢測(cè)的緩沖液輕洗該板3-4次，除去未結(jié)合之細(xì)胞。用熒光測(cè)試法(Cytofluor 2350系統(tǒng))定量測(cè)定粘附的細(xì)胞。
用BCECF-AM熒光標(biāo)記HL-60細(xì)胞在補(bǔ)加有20％FCS、谷氨酰胺及非必需氨基酸的Iscove培養(yǎng)基中培養(yǎng)HL-60細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前一天將該細(xì)胞再次培養(yǎng)(1×106c/ml)。于37℃，在PBS中，通過(guò)以5μg/ml BCECF-AM(貯存液在DMSO中稀釋)保溫20分鐘未標(biāo)記該細(xì)胞(1×106c/ml)。材料ELISA板Nunc Immuno板MaxiSorp(439454)HL-60細(xì)胞從ATTC目錄獲得親和提純的E-選擇蛋白每批E-選擇蛋白均進(jìn)行功能性試驗(yàn)，以確定檢測(cè)使用的適當(dāng)濃度。
熒光染料雙一羧乙基一羧基熒光素乙酸基甲基酯(BCECFAM)，從Molecular Probes獲得。
該試驗(yàn)中，式I化合物在0.3-10mM濃度下抑制HL-60細(xì)胞與E-選擇蛋白的粘附。在濃度為10mM時(shí)，實(shí)施例12，13和18化合物抑制HL-60細(xì)胞與E-選擇蛋白粘附的比例為100％和80％(對(duì)后二者而言)。b)sLea-聚合物/E-選擇蛋白細(xì)胞無(wú)結(jié)合試驗(yàn)將由鼠雜交瘤細(xì)胞系187.1(ATCC)制備的鼠抗-小鼠Ck抗體(10μg/ml，碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液、pH9.5)涂復(fù)于微滴平板上，于4℃過(guò)夜。用檢測(cè)的緩沖液(20mM HEPES，pH7.5，含150mM NaCl和1mM CaCl2)洗滌該板二次，用含3％BSA的該檢測(cè)緩沖液封閉8小時(shí)(4℃)，并洗滌3次。各孔中加入E-選擇蛋白小鼠Ck融合蛋白(3μg/ml)，于檢測(cè)緩沖液中)，接著，于4℃保溫過(guò)夜。通過(guò)將20μlsLea-聚合物(1mg/ml)，在37℃，與80μl抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶，20μl胎牛血清和80μl不帶CaCl2的檢測(cè)緩沖液一起保溫2小時(shí)，形成了生物素化的sLea-聚合物(聚丙烯酰胺型糖共軛物，SyntesomeGmbH，Munich，Germany生產(chǎn)，含20％mol sLea＝0.81μmolsLea/mg聚合物)與抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶(BoehringerMannheim，Germany)之間的配合物(予形成的sLea-聚合物/抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶配合物于4℃經(jīng)幾個(gè)月時(shí)間后仍是穩(wěn)定的)。然后將該配合物以3∶10,000之比在檢測(cè)緩沖液中稀釋?zhuān)⑴c欲檢測(cè)之化合物一起加至E-選擇蛋白涂復(fù)的孔中。使該配合物于37℃結(jié)合2小時(shí)，然后用冷檢測(cè)緩沖液洗該板兩次。將ABTS過(guò)氧化物酶底物(Biorad)溶液加至孔中，10分鐘后停止反應(yīng)。在微板閱讀器中，測(cè)量405nm處的光密度而確定結(jié)合的sLea-聚合物配合物。在此實(shí)驗(yàn)中當(dāng)使用濃度為0.07-10nM時(shí)，式I化合物抑制sLea-聚合物/E-選擇蛋白結(jié)合的相互作用。
實(shí)施例12、13和18化合物抑制SLea-聚合物/E-選擇蛋白結(jié)合相互作用的IC50(50％抑制)分別是1mM，10mM和0.5mM。c)體內(nèi)試驗(yàn)式I化合物在體內(nèi)治療中可用作對(duì)SLea進(jìn)行一對(duì)一取代，例如由Mulligan等人在Nature 364149-151(1993)的鼠/眼鏡蛇毒素模型中所述，或Murohara等人在Cardiouascular Research 30，965-974(1995)中有關(guān)貓心肌局部缺血/再輸注損傷模型中所述。式I化合物在這些模型中均表現(xiàn)出有效。
因此，式I化合物用于治療和/或預(yù)防由選擇蛋白特別是E-選擇蛋白在細(xì)胞粘附中產(chǎn)生結(jié)合而介導(dǎo)的失調(diào)或疾病，例如急性或慢性炎癥，或者自身免疫病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、變態(tài)反應(yīng)癥狀、牛皮癬，接觸性皮炎、成人呼吸困難綜合癥、炎癥性腸病及眼炎癥)、感染疾病(如敗血癥休克、創(chuàng)害性休克、血栓形成及血小板不適當(dāng)聚集癥狀)，心血管疾病(例如心臟病發(fā)作)，再輸注損傷、多發(fā)性硬化癥、和包括有轉(zhuǎn)移癥狀的腫瘤病、中風(fēng)、以及急性或慢性的器官或組織移植排斥。
當(dāng)然，上述應(yīng)用所需劑量，根據(jù)給藥方式、要冶療的具體癥狀，和所期望之效果而有所不同。但一般來(lái)說(shuō)，每公斤動(dòng)物體重用約0.5-80mg之前量比，便可達(dá)到滿意結(jié)果。對(duì)大型哺乳動(dòng)物，例如人來(lái)說(shuō)，適宜的日劑量是約100mg-1.5g/天數(shù)量級(jí)，以方便的一次給藥，分成每天2-4次，或持續(xù)釋放型式均可。單位劑型宜含約25mg-0.750g式I化合物及藥物學(xué)可接受的稀釋劑或其載體。
式I化合物可以游離形式或以藥物學(xué)可接受的鹽的形式給藥。所述鹽可以常規(guī)方法制備，且其活性與游離化合物為同一數(shù)量級(jí)。本發(fā)明也提供含本發(fā)明化合物的藥物組合物，其中本發(fā)明化合物以游離堿形式，或以藥物學(xué)可接受鹽形式與藥物學(xué)可接受之稀釋劑或載體在一起。此種組合物可按常規(guī)方法配制。本發(fā)明組合物可以任何常規(guī)途徑給藥，例如以可注射溶液或懸浮液腸道外給藥、或以鼻給藥，或者以栓劑形式給藥。
根據(jù)前面所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供a)可用作藥物的本發(fā)明的化合物或藥物學(xué)可接受的鹽；b)預(yù)防或治療需要所述處置的個(gè)體中如前所示的各種疾病的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用有效量的式I化合物或其藥物學(xué)可接受之鹽；c)本發(fā)明化合物或藥物學(xué)可接受之鹽在制備如上面b)所述方法中所用的藥物組合物中的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.式I化合物
其中i)R是CH3，和R1是式(a1)或(a2)基團(tuán)
其中m是2或3；n是2或3；M是陽(yáng)離子R2是氫，或至多20個(gè)碳原子的飽和或不飽和烴基，其ω位可任意帶有甲?；?，或者C1-4醇的縮醛或C2-4二元醇的縮醛基，R3是H、-CH2OH、或-CH2CH2OH；和R4是H、C1-4烷基、CH2OH、-CH2CH2OH或-CH2CH2CH2OH，其先決條件是1)R3和R4之一是氫，2)當(dāng)R4是H時(shí)，R3是-CH2OH或-CH2CH2OH和3)當(dāng)R3是H時(shí)，R4是CH3、-CH2OH，-CH2CH2OH或-CH2CH2CH2OH；或者R1是式(b)基團(tuán)
其中R5是
其中p是1或2；q是2或3；r是1或2；R6是H，NH2或-NHRx，其中Rx是氨基保護(hù)基；R7a是-CH2OH、CH2CH2OH或-CH(OH)-CH2OH；R7b是H，或R7a和R7b各自為CH2OH；R11是H或-OH；R13是-(CH2)j-COOM或-SO3M，其中j是1、2或3；M定義同上；(b4)中苯基的第二個(gè)羥基取代基在任意一個(gè)間位上；或者R1是式(c)基團(tuán)
其中R8是OM1、OR14、Rs-Rp或-NHRy，中M1是陽(yáng)離子，R14是飽和或不飽和烴基，Rs是間隔基，Rp是磷脂酰基，而Ry是親脂基；R9是
其中s是1或2t是1或2v是2或3M、R6、R11和R13定義同上；R10a是-CH2OH、-CH2CH2OH、或-CH(OH)-CH2OHR10b是H，或者R10a和R10b各自為CH2OH；(c2)中苯基的第二個(gè)羥基取代基是在任意一個(gè)間位上；或者其中ii)R1是OH，而R是式(d)基團(tuán)
其中w是1或2；R12a是-CH(OH)-(CH2)x-OH；R12b是H，或R12a和R12b各自獨(dú)立地是-CH2OH或-CH2CH2OH；x是2或3；R6和M定義同上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R是CH3，而R1是式(c)基，R9是(c1)或(c3)基。
3根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1是OH，而R是式(d)基。
4.下式之化合物
<p>表5(其2)
</p>
其中M是陽(yáng)離子。
7.制備權(quán)利要求1的式I化合物的方法，包括除去以保護(hù)形式存在于式I化合物中的至少一個(gè)保護(hù)基，且在需要時(shí)，回收如此獲得的游離形式或其鹽形式的式I化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項(xiàng)的化合物，其可用作藥物。
9含有權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項(xiàng)的化合物和藥物學(xué)可接受之稀釋劑或載體的藥物組合物。
10.預(yù)防或治療需要所述處置的個(gè)體中由選擇蛋白在細(xì)胞粘附作用中的結(jié)合所介導(dǎo)的失調(diào)或疾病之方法，該方法包括給所述個(gè)體施用權(quán)利要求1-6中任一權(quán)項(xiàng)的化合物。
全文摘要
式Ⅰ化合物具有唾液基Lewis X樣之藥理活性,例如用于預(yù)防、治療由選擇蛋白在細(xì)胞粘附作用的結(jié)合所介導(dǎo)的失調(diào)或疾病。式中R是CH
文檔編號(hào)A61P31/04GK1184483SQ96193857
公開(kāi)日1998年6月10日 申請(qǐng)日期1996年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月21日
發(fā)明者翁啟惠, 林俊成, 梶本哲也 申請(qǐng)人:諾瓦蒂斯有限公司, 斯克里普斯研究學(xué)院