專利名稱：：在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷酯酰絲氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制造在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷酯酰絲氨酸的方法，更詳細(xì)地說，是涉及制造對于帕金森病及阿爾茨海默病類之類癡呆癥的預(yù)防及治療有效的，并具有增強對于人腦緊張的抵抗能力，進而可提高學(xué)習(xí)效果，改善腦功能效果的油脂組合物。
背景技術(shù)：
：由布魯尼等報告(A.Brunietal.，Nature，vol.260，p.331，1976)中論述了，在將從牛腦提取的磷脂酰絲氨酸(PS)注射到小鼠尾部靜脈時，該小鼠腦內(nèi)葡萄糖濃度，可提高到對照組的4倍左右。另外，由扎諾替等報告(A.Zanottietal.，PsychopharmacologyBerl.，vol.99，p.316，1989)中，敘述了通過將從牛腦提取的磷脂酰絲氨酸，經(jīng)口給藥于記憶力降低的老齡白鼠12周，發(fā)現(xiàn)該老齡白鼠的行動得以改善。進而，對于人也進行臨床試驗，由雙盲對照試驗可確認(rèn)來自牛腦的磷脂酰絲氨酸對于阿爾茨海默病及老年期記憶障礙的改善是有效的(P.J.Delwaideetal.，ActaNeurol.Scand.，vol.73，p.136，1986；R.R.Engeletal.，Eur.Neuropsychopharmacol.，vol.2，p.149，1992；T.Cenaccietal.，AgingClin.Exp.Res.，vol.5，p.123，1993)。這樣，顯示腦內(nèi)葡萄糖濃度的增加效果的，并來自牛腦的磷脂酰絲氨酸，具有改善小鼠和人腦功能的效果。因此，腦內(nèi)葡萄糖濃度增加的程度，可認(rèn)為是選擇具有改善腦功能作用的物質(zhì)時的重要指標(biāo)?？墒牵m然在磷脂質(zhì)的2位(β位置)上，一般，結(jié)合不飽和脂肪酶，但在來自天然的，例如動物腦的磷脂酰絲氨酸時，2位的脂肪酸的92％以上是油酸(B.F.Szuhaj&G.R.List，“Lecithins”，Am.OilChem.Soc.，U.S.A.，p.145，1985)。另一方面，使用工業(yè)的磷脂質(zhì)的制造方法中的磷脂酶D(PLD)，用磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)配制的磷脂酰絲氨酸，大部分的2位脂肪酸與起始原料脂肪酸相同，例如若使用大豆卵磷脂，亞油酸和亞麻酸是大部分，另外，若是卵黃卵磷脂，油酸和亞油酸是大部分。近來，對于n-3類或n-6類多元不飽和脂肪酸，進行各種研究，特別是對于n-3類多元不飽和脂肪酸，涉及包括提高學(xué)習(xí)能力的許多生理活性，進行了動物實驗。從這些背景，可認(rèn)為只要能制造這些多元不飽和脂肪酸和磷脂酰絲氨酸組合的物質(zhì)，例如在分子內(nèi)含有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸，就可期待兩者相加效果乃至相乘效果，有得到更優(yōu)良的腦功能改善物質(zhì)的可能性?？墒?，現(xiàn)在可以得到的磷脂酰絲氨酸中，尚未見到在工業(yè)上可價廉制造且在2位上富含n-3類、n-6類(除去亞油酸之外)的多元不飽和脂肪酸的物質(zhì)。例如，如上所述，作為期待兩者相加效果乃至相乘效果，多元不飽和脂肪酸和磷脂酰絲氨酸組合的物質(zhì)，公開具有使蛋白激酶C(PKC)活性化效果的，在甘油骨架的2位上具有特定的脂肪酸的磷脂酰絲氨酸衍生物(日本特許公報特開平6-279311)。該公報中敘述了臨床上腦改善效果的顯示，是在來自牛腦的磷脂酰絲氨酸是由各種脂肪酸構(gòu)成的混合物，不知構(gòu)成脂肪酸特定情況下的效果的前提下開始試驗，及該試驗的結(jié)果，1位是飽和脂肪酸(碳數(shù)14～18)、2位是亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、廿二碳六烯酸(DHA)時，特異地發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C的活性化。作為具有這樣特異結(jié)構(gòu)的磷脂酰絲氨酸的制造方法，該公報所公開的是將磷脂酶A2與二?；土字|(zhì)作用，變換成溶解型磷脂質(zhì)，將用化學(xué)合成法，使脂肪酸與其結(jié)合得到的特異型磷脂質(zhì)，通過由磷脂酶D的磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，變換成磷脂酰絲氨酸的方法。對于這種制造方法，由于經(jīng)過復(fù)雜的多段反應(yīng)和化學(xué)合成，所以不適于食品用途，另外，制造成本也高。另外，也公開了在1位和2位的脂肪酸上，具有特定結(jié)構(gòu)的甘油衍生物具有提高學(xué)習(xí)能力的效果(日本特許公開公報特開平6-256179號)?？墒牵摴珗蟊砻鳎@示提高學(xué)習(xí)能力效果的主體是甘油衍生物的1位、2位的脂肪酸結(jié)構(gòu)，而3位的殘基結(jié)構(gòu)，即甘油-3-磷?；?X(X是羥基、膽堿基、或乙醇胺基)是認(rèn)為不直接與提高學(xué)習(xí)能力有關(guān)，因此，此甘油衍生物和具有提高學(xué)習(xí)能力的脂肪酸組合，與上述期待的相加或相乘效果的磷脂酰絲氨酸不同。進而，該特許公報公開的甘油衍生物的制造方法，是從天然物進行分離或化學(xué)合成法或者用磷脂酶C處理的制造方法，難以被稱為工業(yè)上有利的，另外是適用于食品用途的制造方法。發(fā)明的公開本發(fā)明的主要目的在于解決如上所述的各個問題，提供用比較簡便的，即工序少地制造在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供容易地制造具有n-3類或n-6類多元不飽和脂肪酸的脂肪酸組成的磷脂酰絲氨酸的方法。按照本發(fā)明的一個方案，制造在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸的方法，其特征是作為側(cè)鏈的脂肪酸，將含有多元不飽和脂肪酸的天然卵磷脂用作基質(zhì)，以絲氨酸存在下，使磷脂酶D與上述天然卵磷脂作用。按照本發(fā)明另一方案，將含有從n-3類的α-亞麻酸，廿十碳五烯酸、廿二碳六烯酸及n-6類的亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸組成群選出的至少1種多元不飽和脂肪酸的天然卵磷脂用于上述基質(zhì)。按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，是將從海產(chǎn)魚類的頭部組織提取的卵磷脂用于上述基質(zhì)。按照本發(fā)明另一優(yōu)選方案是從給食含有多元不飽和脂肪酸的魚油和/或植物油的母雞生的蛋提取的蛋黃磷脂用于上述基質(zhì)。按照本發(fā)明的又一優(yōu)選方案是將從上述天然卵磷脂分級濃縮的磷脂酰膽堿用于上述基質(zhì)。按照本發(fā)明的又另一優(yōu)選方案是將從上述天然卵磷脂分級濃縮的磷脂酰乙醇胺，用于上述基質(zhì)。本發(fā)明的基本理論是根據(jù)以下新的見解而確定的，即通過將作為2位(β位置)的側(cè)鏈，具有多元不飽和脂肪酸的天然卵磷脂用于磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的基質(zhì)，可得到在2位的側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂?；?L-絲氨酸。按照此新的見解，可通過簡單的一階段的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，容易地制造富含多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸。這樣制造的磷脂酰絲氨酸，由于富含多元不飽和脂肪酸，所以可成為相加或相乘地發(fā)揮磷脂酰絲氨酸和多元不飽和脂肪酸的各種效果的優(yōu)良腦功能改善物質(zhì)。即，本發(fā)明的制造方法，是通過將具有多元不飽和脂肪酸作為側(cè)鏈脂肪酸的天然卵磷脂用于磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的基質(zhì)，通過在絲氨酸的存在下，使磷脂酶D與該天然卵磷脂作用，可得到在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸。本發(fā)明中所用的、特別適宜的天然卵磷脂是含有從n-3類的α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、廿二碳六烯酸(DHA)及n-6類的亞油酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸組成群選出至少1種的多元不飽和脂肪酸。這樣的多元不飽和脂肪酸具有提高學(xué)習(xí)能力效果及各種生理活性效果。因此，由于從這樣的天然卵磷脂得到的磷脂酰絲氨酸也含有這些多元不飽和脂肪酸，所以具有提高學(xué)習(xí)能力效果及各種生理活性效果。因此，通過本發(fā)明制造的磷脂酰絲氨酸是將具有磷脂酰絲氨酸本身的腦功能改善效果和具有含在其分子中的多元不飽和脂肪酸的上述各種效果相加或相乘地發(fā)揮的優(yōu)良腦功能改善物質(zhì)。按照本發(fā)明的方法，可不經(jīng)過以往的復(fù)雜多階段反應(yīng)和化學(xué)合成法，只是將含有多元不飽和脂肪酸的天然卵磷脂用于基質(zhì)的一階段磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)工序，就可簡便地制造在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸。因此，按照本發(fā)明，與以往方法相比，在工業(yè)上有利地，且適于食品用途，具有安全性地制造相加或相乘地發(fā)揮多元不飽和脂肪酸和磷脂酰絲氨酸的各個效果的腦功能改善物質(zhì)。另外，由于希望含在目標(biāo)產(chǎn)物磷脂酰絲氨酸中的上述各種生理活性效果的多價不飽和脂肪酸的含量多，所以本發(fā)明中作為基質(zhì)的天然卵磷脂，優(yōu)選的是選擇其本身多元不飽和脂肪酸的含量盡量多的。例如，作為2位的多元不飽和脂肪酸含量高的天然卵磷脂，可舉出從體組織，特別是頭部組織富含多價不飽和脂肪酸的海產(chǎn)魚類，具體地，從金槍魚，鰹魚，鯖魚，魚，秋刀魚，竹莢魚等提取的卵磷脂，或用含有多元不飽和脂肪酸的飼料飼養(yǎng)的母雞生的雞蛋提取的蛋黃卵磷脂。實際上，作為得到含有γ-亞麻酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、廿二碳六烯酸等的多元不飽和脂肪酸的蛋黃卵磷脂的方法，將含有這樣的多元不飽和脂肪酸的魚油和/或大豆油、紫蘇油、棉籽油、芝麻油、玉米油、葵花子油等的植物油，添加到飼料中，利用給食該飼料的母雞生的雞蛋的方法是簡便的。在從給食這種多元不飽和脂肪酸，飼養(yǎng)的母雞得到的雞蛋的蛋黃中，由于存在富含多元不飽和脂肪酸的卵磷脂，所以只要能從該雞蛋中提取蛋黃卵磷脂就可以。另外，這些天然卵磷脂主要含有特定的磷脂質(zhì)，即磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺，有時進一步含有磷脂酰甘油。因此，除了將這些天然卵磷質(zhì)直接用于反應(yīng)基質(zhì)之外，也可將分級濃縮成特定的磷脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的卵磷質(zhì)作為磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的基質(zhì)使用。通過從以上各種天然卵磷質(zhì)或其分級濃縮了的物質(zhì)中，選擇所希望的卵磷脂，在絲氨酸存在下，使磷脂酶D與其作用，以絲氨酸作為受體，進行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，可得到含有高含量的目標(biāo)產(chǎn)物種類的多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸。實施發(fā)明的最佳方案實施例1作為本發(fā)明的實施例1，是將含有DHA的蛋黃卵磷脂用作原料，制造磷脂?；?L-絲氨酸。在此所用的蛋黃卵磷脂，是從給食含有多元不飽和脂肪酸的魚油及植物油，飼養(yǎng)的母雞的蛋中提取的，這是一般可從市場上得到的。首先，將市售的含有10％DHA蛋黃卵磷脂1g和，醋酸乙酯2ml和L-絲氨酸120mg的溶液400μL和磷脂酶D(商品名磷脂酶D-Y1，ヤクルト本社，日本)150單位的300μL酶水溶液，氮氣流下密塞在安瓶中，一邊將其在50℃下，振蕩攪拌10小時，一邊培育，進行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)終了后，通過冷卻，將在安瓶內(nèi)沉淀的糊狀部分，溶解在氯仿中，通過薄層色譜展開(展開液是氯仿∶甲醇∶醋酸＝13∶5∶2)得到的溶液，進行分離后，在薄層板上，噴霧dead馬來斯它(デイツトマ一レスタ一)試劑，使磷發(fā)色，通過圖像解析裝置(商品名gel博士，三谷商事，日本)，進行磷脂質(zhì)分析。其結(jié)果，可確認(rèn)磷脂質(zhì)中，生成27.2％的磷脂酰基-L-絲氨酸。另外，刮取上述薄層板的磷脂?；?L-絲氨酸的斑點部分的固定相，從其刮取部分的氯仿萃取流分，進一步通過毛細(xì)管柱色譜分離取出脂肪酸流分。在分析該脂肪酸時，可確認(rèn)約含DHA(碳數(shù)22，雙鍵6個)13％。這樣，通過將含有DHA的蛋黃卵磷脂用于反應(yīng)基質(zhì)，由磷脂酶D發(fā)生磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，可生成含有DHA的磷脂?；?L-絲氨酸。如所述的表1所示，在該生成物中，除含有率約13％的DHA(C226)以外，還含有約3％的亞油酸(C182)、約6％的花生四烯酸(C204)。實施例2作為本發(fā)明的第2實施例，是使用由黃肌金槍魚的頭部肌肉得到的卵磷脂為原料，制造磷脂?；?L-絲氨酸的。首先，粉碎黃肌金槍魚頭部(約1.6kg)，通過冷凍干燥，得到干燥粉末。在該干燥粉末100g中，加入異丙醇∶己烷∶水＝10∶20∶3的混合溶劑，萃取脂質(zhì)流分，在減壓下，濃縮干燥該萃取液。在得到的脂質(zhì)干燥物約18g中，加入丙酮后，進行冰冷，干燥由此生成的沉淀物，得到約300mg的磷脂質(zhì)。使用由以上操作得到的磷脂質(zhì)，制造磷脂?；?L-絲氨酸。即，在氮氣流下，將含有磷脂質(zhì)100mg、醋酸乙酯2mL、L-絲氨酸120mg的溶液400μL和磷脂酶(商品名磷脂酶D-Y1ヤクルト公司，日本)15單位的300μL酶水溶液，密閉在安瓶內(nèi)，一邊將其在50℃下振蕩攪拌10小時，一邊進行培育，進行磷脂酰?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)終了后，進行冷卻，對于沉淀在安瓶內(nèi)的糊狀部分，與實施例1相同，用薄層色譜及圖像解析，進行磷脂質(zhì)的分析。其結(jié)果，表明在磷脂質(zhì)中，生成34.5％的磷脂?；?L-絲氨酸。另外，與實施例1相同，刮取薄層上的磷脂酰基-L-絲氨酸的斑點部分的固定相，從該刮取部分的氯仿萃取流分，進一步用毛細(xì)管柱色譜分離脂肪酸流分。分析該脂肪酸，如后述的表1所示，DHA(C226)的含量約為45％、EPA(C205)的含量約為4％。這樣，在本實施例2中，通過將從黃肌金槍魚頭部提取的卵磷脂用于基質(zhì)，由磷脂酶進行的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，可得到DHA含量高的磷脂酰基-L-絲氨酸。實施例3作為本發(fā)明的第3實施例，使用由南金槍魚頭部肌肉得到的卵磷脂為原料，制造磷脂?；?L-絲氨酸。首先，粉碎約1.2kg南金槍魚頭部，通過冷凍干燥，得到干燥粉末。在該干燥粉末100g中，加入異丙醇∶己烷∶水＝10∶20∶3的混合溶劑，萃取脂質(zhì)流分，在減壓下，濃縮干燥該萃取液。在得到的脂質(zhì)干燥物約10g中，加入丙酮后，進行冰冷，通過干燥由此生成的沉淀物，得到約250mg的磷脂質(zhì)。使用由以上操作得到的磷脂質(zhì)，制造磷脂?；?L-絲氨酸。即，在氮氣流下，將含有磷脂質(zhì)100mg、醋酸乙酯2ml和L-絲氨酸120mg的懸浮溶液400μL和，含有磷脂酶(商品名磷脂酶DY1，ヤクルト公司，日本)150單位及CaCl25mg的300μL酶水溶液，密塞在安瓶內(nèi)，在50℃下，一邊將其激烈攪拌10小時，一邊進行培育，進行磷脂酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)終了后，進行冷卻，對于沉淀在安瓶內(nèi)的糊狀部分，與實施例1相同，用薄層色譜及圖像解析，進行磷脂質(zhì)分析。其結(jié)果表明，在磷脂質(zhì)中，生成82％的磷脂?；?L-絲氨酸。另外，與實施例1相同，刮取薄層上的磷脂酰基-L-絲氨酸的斑點部分的固定相，從該刮取部分的氯仿萃取流分，進一步，用毛細(xì)管柱色譜，分離脂肪酸流分。分析該脂肪酸時，如后述表1所述，EPA(C205)的含量特別高，約為88％，DHA(C226)的含量約為3％。這樣，在本實施例3中，將從南金槍魚頭部提取的卵磷脂用于基質(zhì)，通過由磷脂酶D進行的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)可得到EPA含量特別高的磷脂酰基-L-絲氨酸。實施例4作為本發(fā)明的實施例4，使用從鰹魚頭部肌肉得到的卵磷脂為原料，制造磷脂?；?L-絲氨酸。粉碎鰹魚頭部約0.5kg，通過冷凍干燥，得到干燥粉末。在該干燥粉末100g中，加入異丙醇∶己烷∶水＝10∶20∶3的混合溶劑，提取脂質(zhì)流分，在減壓下，濃縮干燥該提取液。在得到的脂質(zhì)干燥物約11g中，加入丙酮后，進行冰冷，干燥由此生成的沉淀物，得到約300mg的磷脂質(zhì)。使用由以上操作得到的磷脂質(zhì)，制造磷脂?；?L-絲氨酸。即，在氮氣流下，將含有磷脂質(zhì)100mg、醋酸乙酯2mL和L-絲氨酸120mg的溶液400μL和，磷脂酶D(商品名磷脂酶D-Y1，ヤクルト公司，日本)15單位的300μL酶水溶液，密塞在安瓶內(nèi)，在50℃下，一邊將其進行振蕩攪拌10小時，一邊培育，進行磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)終了后，進行冷卻，對于沉淀在在安瓶內(nèi)的糊狀部分，與實施例1相同，通過薄層色譜及圖像解析，進行磷脂質(zhì)的分析。其結(jié)果表明，在磷脂質(zhì)中，生成34％的磷脂?；?L-絲氨酸。另外，與實施例1相同，刮取薄層上的磷脂?；?L-絲氨酸的斑點部分的固定相，從該攪拌部分的氯仿的提取流分，進而，用毛細(xì)管柱色譜，分取脂肪酸流分。分析該脂肪酸時，如后述的表1所示，DHA(C226)的含量約為45％、EPA(C205)的含量約為8％。這樣，在本實施例4中，使用從南金槍魚頭部提取的卵磷脂作為基質(zhì)，通過由磷脂酶進行的磷脂酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)，可得到含有DHA和EPA的磷脂酰基-L-絲氨酸。以下的表1表示由上述的各實施例得到的磷脂?；?L-絲氨酸的各種脂肪酸的含量。表1</tables>權(quán)利要求1.在側(cè)鏈上，具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸的制造方法，其特征是，使用含有多元不飽和脂肪酸作為側(cè)鏈脂肪酸的天然卵磷脂為基質(zhì)，在絲氨酸存在下，使磷脂酶D與上述天然卵磷脂作用。2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征是上述天然卵磷脂含有從n-3類的α-亞麻酸，二十碳五烯酸，廿二碳六烯酸及n-6類的亞油酸，γ-亞麻酸，花生四烯酸組成群選出至少1種的多元不飽和脂肪酸。3.權(quán)利要求1的方法，其特征是將從海產(chǎn)魚類頭部組織提取的卵磷脂，用作上述基質(zhì)。4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征是將從給食含有多元不飽和脂肪酸的魚油和/或植物油的母雞生的蛋提取的蛋黃卵磷脂，用作上述基質(zhì)。5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征是將從上述天然卵磷脂分級濃縮的磷脂酰膽堿用作上述基質(zhì)。6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征是將從上述天然卵磷脂分級濃縮的磷脂酰乙醇胺用作上述基質(zhì)。全文摘要本發(fā)明是在側(cè)鏈上具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸的制造方法。對于該方法,將含有多元不飽和脂肪酸作為側(cè)鏈的脂肪酸的天然卵磷脂,用作原料。將該天然卵磷脂用作基質(zhì),在絲氨酸的存在下,使磷脂酶作用。只用一個階段的反應(yīng)工序,就可容易地得到在側(cè)鏈具有多元不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸。文檔編號A61P25/28GK1177381SQ96192358公開日1998年3月25日申請日期1996年11月6日優(yōu)先權(quán)日1995年11月8日發(fā)明者酒井正士,大和矢秀行,工藤聰申請人:株式會社雅庫路特本社