專利名稱：：乙肝疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的疫苗制劑、制備該制劑的方法以及其在治療中的用途。本發(fā)明特別涉及新的用于治療肝炎感染的制劑以及包含有乙肝疫苗成分的組合疫苗制劑。由A、B、C、D及E型肝炎病毒引起的病毒性肝炎是非常常見(jiàn)的病毒疾病。特別是由B和C型病毒引起的肝炎還是造成很多肝癌病例的主要原因。因此極需研制出有效的疫苗，但是此項(xiàng)工作雖然已取得顯著的成就，其仍然是一項(xiàng)正在進(jìn)行的事業(yè)。在“柳葉刀”(Lancet)，1990年5月12日，第1142頁(yè)(A.L.W.F.Eddleston教授)中可查得對(duì)當(dāng)今肝炎疫苗的評(píng)論(包括很多主要的參考文獻(xiàn))。也可以參見(jiàn)“病毒性肝炎和肝病”(ViralHepatitisandLiverDisease)(Vyas，B.N.，Dienstag，J.L..，及Hoofnagle，J.H.，eds，Grune和Stratton，Inc.(1984))以及“病毒性肝炎和肝病”(ViralHepatitisandLiverDisease)(“1990年國(guó)際專題討論會(huì)會(huì)報(bào)”(Proceedingsofthe1990IntemationalSymposium)，edsF.B.Hollinger，S.M.Lemon及H.Margolis，由WilliamsandWilkins出版)。如文中所用到的，用“乙肝抗原”一詞來(lái)指任何來(lái)自乙肝病毒的抗原物質(zhì)，這些抗原物質(zhì)可被用來(lái)誘導(dǎo)人體對(duì)該病毒的免疫。乙肝病毒(HBV)感染是個(gè)有普遍性的難題，但是目前可以購(gòu)買到可用于大量免疫接種的疫苗，例如通過(guò)遺傳工程技術(shù)獲得的′Engerix-B′產(chǎn)品(SmithKlineBeechanplc)。有很多資料報(bào)道了乙肝表面抗原(HBsAg)的制備。例如，參見(jiàn)Harford等人[“發(fā)育生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)54”(Develop.Biol.Standard)，第125頁(yè)(1983)]、Gregg等人[“生物技術(shù)”(Biotechnology)，5，第479頁(yè)(1987)]、EP-A-0226846、EP-A-0299108以及本文中的參考文獻(xiàn)。如文中所用到的，“乙肝表面抗原”或“HBsAg”一詞包括任何表現(xiàn)HBV表面抗原的抗原性的HBsAg抗原或其片段?？梢岳斫獾氖牵_(kāi)HBsAgS抗原的226個(gè)氨基酸序列(參見(jiàn)Tiollais等人，“自然”(Nature)，317，489(1985)及文中的參考資料)之外，如果有必要，文中所述的HBsAg可以包括有如上述參考文獻(xiàn)及EP-A-0278940中所述的前-S序列的全部或部分。特別述參考文獻(xiàn)及EP-A-0278940中所述的前-S序列的全部或部分。特別是，HBsAg可以包含有一個(gè)多肽，該多肽具有一段含有第12-52殘基的氨基酸序列，接著是第133-145殘基，再接著是與ad血清型的乙肝病毒上的可讀框有關(guān)的HBsAg的L-蛋白的第175-400殘基。(將該多肽稱作L*，參見(jiàn)EP0414374)。本發(fā)明范圍內(nèi)的HBsAg也可以包括如EP0198474(Endotronics)所述的前S1-前S2-S多肽或其諸如EP034578(McCormick和Jones)中所述的那些多肽之類的類似物。文中所述的HBsAg也指一些突變體，例如，WO91/14703或歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)0511855A1中所述的“逃逸”突變體，尤其是其中145位的氨基酸取代是由甘氨酸至精氨酸的HBsAg。通常，HBsAg會(huì)處于顆粒狀態(tài)。例如這些顆?？梢灾话蠸蛋白，或者這些顆?？梢允墙M合顆粒，例如(L*，S)，其中L*是如以上定義的，且S指HBsAg的S-蛋白。所述顆粒最好是處于某種狀態(tài)，其中該顆粒就是以這種狀態(tài)在酵母中表達(dá)。雖然由實(shí)驗(yàn)獲得的和從市場(chǎng)上購(gòu)得的肝炎疫苗，例如Engerix-B，可產(chǎn)生很好的結(jié)果，但已承認(rèn)的事實(shí)是，最適宜的疫苗不僅應(yīng)激發(fā)中和的抗體，而且應(yīng)盡可能有效地激發(fā)通過(guò)T-細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。國(guó)際專利申請(qǐng)WO93/19780中公開(kāi)了一些組合疫苗，該組合疫苗是由基于一種乙肝表面抗原的乙肝成分、氫氧化鋁和3-去-O-酰單磷?；怉組成。但未建議一種含有磷酸鋁的制劑。出人意料之外的是，本發(fā)明提供了一種制劑，該制劑的有效性比WO93/19780中所述的那些制劑的有效性高，可達(dá)其4倍。因此，本發(fā)明提供了一種疫苗，其含有乙肝抗原，連同有3-去-O-酰單磷?；怉(文中縮寫(xiě)為MPL)以及磷酸鋁。前面已將3-O-去-酰單磷?；怉(或3-去-O-酰單磷?；怉)稱作3D-MPL或d3-MPL，來(lái)表明葡糖胺的還原性末端的第3位是去-O-酰的。至于制備，參見(jiàn)GB2220211A。在化學(xué)性質(zhì)上，其為3-去酰單磷?；怉與第4、5、6位酰化了的鏈的混合物。文中將3D-MPL(或d3-MPL)一詞縮寫(xiě)成MPL，因?yàn)椤癕PL”是RibiImmunochem.，Montana的一個(gè)注冊(cè)商標(biāo)，Ribi明確地用其來(lái)表示他們的3-O-去酰單磷?；怉產(chǎn)品。優(yōu)選在本發(fā)明的組合物中使用小顆粒的MPL。小顆粒MPL的顆粒大小通常小于120mm。這些制劑描述于國(guó)際專利申請(qǐng)NO.WO94/21292。GB2220211A提到，在保留免疫原性特征的同時(shí)，降低了以前應(yīng)用的腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的內(nèi)毒性。但是GB2220211指出這些發(fā)現(xiàn)僅僅與細(xì)菌(革蘭氏陰性菌)系統(tǒng)有關(guān)。但意外的是，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含有乙肝抗原的疫苗組合物具有如文中所述的特別有利的特性。特別有利之處在于，即使以非常低劑量的抗原，本發(fā)明的疫苗組合物也會(huì)非常有效地誘導(dǎo)防護(hù)性免疫。該新疫苗制劑會(huì)使得有與目前可購(gòu)得的乙肝疫苗制劑在兩劑后的免疫原性促進(jìn)作用相同的作用。特別是在人臨床試驗(yàn)中，兩劑疫苗后達(dá)到的抗體含量與3劑Engerix-B后的抗體含量相同。其提供了極好的抗原發(fā)性感染的保護(hù)作用，并且既有利地激發(fā)特異的體液(中和抗體)免疫應(yīng)答，也有利地激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)(DTH)的免疫應(yīng)答。更重要的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的疫苗組合物也可被用作治療用的疫苗。以上定義的MPL通常以10-100μg的范圍內(nèi)的劑量存在，優(yōu)選為25-50μg/劑，其中乙肝抗原通常以2-50μg/劑的范圍內(nèi)的劑量存在，并且磷酸鋁以500μg(Al3+)/劑的范圍內(nèi)的劑量存在。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是下文所述的HBsAg抗原(例如Engerix-B)與MPL及磷酸鋁混合。本發(fā)明的更特別的實(shí)施方案是如上文定義的(L*，S)顆粒的HBsAg抗原與MPL及磷酸鋁混合。本發(fā)明還有一個(gè)方面提供了文中所述的用于治療、特別是用于治療或預(yù)防肝炎感染的疫苗制劑。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的疫苗是一種可用于治療正在發(fā)生中的乙肝感染的治療疫苗。在另一方面，本發(fā)明的肝炎疫苗組合物含有其他抗原，因而其能有效治療或預(yù)防一種或多種其他細(xì)菌、病毒或真菌感染。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的肝炎疫苗制劑至少含有一種選自其他抗原(特別是甲肝抗原)的其他成分或本領(lǐng)域中所知的提供保護(hù)作用以抗一種或多種以下疾病的非肝炎抗原，這些疾病如白喉、破傷風(fēng)、百日咳、b型嗜血桿菌流感(Hib)以及脊髓灰質(zhì)炎。還可以包括有抗腦膜炎A、B或C的抗原。優(yōu)選本發(fā)明的疫苗包含有如上文定義的HBsAg。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的特殊組合疫苗，包括DTP(白喉-破傷風(fēng)-百日咳)-乙肝組合疫苗制劑、Hib-乙肝疫苗制劑、DTP-Hib-乙肝疫苗制劑和IPV(滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTP-Hib-乙肝疫苗制劑。肝炎疫苗或上述組合物也可以有利地包括抗甲肝的保護(hù)性成分，特別是如存在于Havrix中的由HM-175菌株衍生的滅活減毒菌株。用于這些疫苗的適宜成分早已可從市面上購(gòu)得，并可從世界衛(wèi)生組織獲得詳細(xì)資料。例如，IPV成分可以是索爾克滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗。包含有3種B.百日咳抗原(69KDa、百日咳毒素(滅活了的)和絲狀血凝素(FHA))的、與白喉抗原和諸如InfanrixDTPa之類的破傷風(fēng)抗原配制的百日咳疫苗可以包含有整個(gè)細(xì)胞或非細(xì)胞的產(chǎn)物。在一個(gè)方面，本發(fā)明的肝炎或組合疫苗可以是兒科疫苗。疫苗制備一般描述于“疫苗新動(dòng)向和發(fā)展”(NewTrendandDertlopmentsinVaccines)(由Voller等人編著，UniversityDarkPress，Baltimore，MarylandU.S.A1978)。例如Fullerton，美國(guó)專利4235877描述了在脂質(zhì)體中的封裝。還例如，Likhite，美國(guó)專利4,372,945以及Armor等人，美國(guó)專利4474757公開(kāi)了蛋白質(zhì)與大分子的綴合。以一種在典型疫苗中誘導(dǎo)免疫防御反應(yīng)而無(wú)重大、有害的副反應(yīng)的劑量，來(lái)選擇每一劑疫苗中的抗原的量。這一量會(huì)根據(jù)是使用哪一種特異抗原來(lái)變化。通?？赡苊縿?huì)含有1-1000μg的全抗原，優(yōu)選2-200μg。可通過(guò)涉及觀察抗體效價(jià)和實(shí)驗(yàn)對(duì)象的其他反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分析來(lái)確定特異疫苗的適宜劑量。在初次接種疫苗后，例如，在2和6個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)對(duì)象可接受一或多次加強(qiáng)劑。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備能有效防御或治療乙肝感染的疫苗的方法，其中該方法包括將文中定義的肝炎抗原和磷酸鋁以及MPL混合。使用這種方法，優(yōu)選將一或多種添加成份和HBsAg混合以生成組合疫苗?？梢允褂靡恍┗旌线@些成分的方法。在一種方法中，可將各種抗原分別吸附到磷酸鋁上，在一段時(shí)間后，于加入混合溶液之前，將MPL加入到各抗原上。將了解到的是，本發(fā)明還提供了在易感染乙肝或正受乙肝感炎的人體內(nèi)誘導(dǎo)10mU范圍內(nèi)的抗乙肝的中和抗體效價(jià)的方法，該方法是通過(guò)以不超過(guò)在另一方面，本發(fā)明提供了文中定義的組合物的用途，即將其用來(lái)制備用于在人體內(nèi)誘導(dǎo)效價(jià)在10mU范圍內(nèi)的抗乙肝的中和抗體的疫苗，該誘導(dǎo)優(yōu)選在不超過(guò)兩劑后。以下實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例1乙肝疫苗制劑MPL(3-去-O-酰單磷?；怉)從RibiImmunochemResearchInc獲得。磷酸鋁從Superphos(Denmark)獲得。將MPL以0.2-3mg/ml的變化濃度重懸于水中以用于注射，通過(guò)聲處理，直至顆粒的大小達(dá)到如由光散射(photocorrelationlightscattering)測(cè)得的于80-200nm之間。于室溫下通過(guò)攪拌將1-20μg以0.5-3mg/ml濃度溶于磷酸緩沖液的HBsAg(如EngerixB中的S-抗原)吸附到5-1000μg磷酸鋁(3-6AL3+mg/ml溶液)上，持續(xù)1個(gè)小時(shí)。于室溫下將該混合物存放15天，然后，于再處理前將其保持在4℃下。再將5-200μgMPL(0.2-10mg/ml的溶液)加入到該溶液中。用注射用水和鹽水將體積和滲透性調(diào)節(jié)至500-1000μl。加入硫柳汞(1％W/V)至終濃度為0.005％，以生成終產(chǎn)物。通過(guò)將上文中定義的組合(L*，S)抗原用作HBsAg成分，制備相似的制劑。在這一制劑中，制菌劑是2-苯氧乙醇。實(shí)施例2對(duì)用3-去酰單磷?；怉和磷酸鋁配制的乙肝表面抗原的臨床分析在臨床試驗(yàn)中，制備各種含疫苗的乙肝表面抗原。對(duì)以下各組進(jìn)行了研究第1組在1ml中有HBsAg(20μg)/MPL(50μg)/AlPO4(Al500μg)/硫柳汞(50μg)/150mMNaCl/pH6.1，如實(shí)施例1中所述來(lái)制備。第2組在1ml中有HBsAg(20μg)/MPL(50μg)/Al(OH)3(Al100μg)/硫柳汞(50μg)/10mM磷酸緩沖液+150mMNaCl/pH6.8。第3組在1ml中有HBsAg(20μg)/Al(OH)3(Al500μg)/硫柳汞(50μg)/10mM磷酸緩沖液+150mMNaCl/pH6.8。第4組類似Engerix第4組類似Engerix在1ml中有HBsAg(20μg)/MPL(0μg)/Al(OH)3(Al500μg)/硫柳汞(50μg)/10mM磷酸緩沖液+150mMNaCl/pH6.8。第5組在1ml中有HBsAg(20μg)/MPL(0μg)/AlPO4(Al500μg)/硫柳汞(50μg)/150mMNaCl/pH6.1。征召18-40歲的自愿者參加這次試驗(yàn)。在第0天和2個(gè)月后對(duì)每一組(于第0天，每組約60位成年人)于三角肌區(qū)肌肉內(nèi)接種疫苗。在第一次注射前、第一次注射后1和2個(gè)月和第2次注射后的1、2和4個(gè)月時(shí)收集血樣。用AUSAB試劑盒(Abbott)和校準(zhǔn)的WHO基準(zhǔn)，以mlU/ml測(cè)量抗HBs的抗體。應(yīng)答者效價(jià)≥1mlU/ml。對(duì)于每一時(shí)間點(diǎn)，計(jì)算血清轉(zhuǎn)變體的幾何平均效價(jià)(GMT)(GeometricMeanTitre)。結(jié)果每種疫苗的GMT見(jiàn)表1，表2列出了各組接種者體內(nèi)的抗體效價(jià)等級(jí)。GMT結(jié)果(表1)清楚地表明在2劑含有ALPO4+MPL(第一組)后，與使用購(gòu)買到的EngerixB(第4組)所達(dá)到的效價(jià)相比，在第2劑后觀察到效價(jià)增加了10倍多?？?HBs反應(yīng)也快得多，并且在第1劑后1和2個(gè)月時(shí)51％和70％的接種者具有保護(hù)性效價(jià)(與關(guān)于EngerixB的34％和16％相比)(表2)。向EngerixB(第3組)加入3D-MPL，只使用ALPO4(第5組)僅稍微增強(qiáng)抗-HBs反應(yīng)(與EngerixB相比)，但效價(jià)比使用ALPO4+MPL劑型仍要低4-5倍。將HBsAg吸附到劑量減少的Al(OH)3+MPL產(chǎn)生的效價(jià)與使用EngerixB產(chǎn)生的效價(jià)相同?？傊Y(jié)果表明，為了在2劑后在接種疫苗者體內(nèi)的抗-HBs反應(yīng)有一個(gè)最適宜的增加，AlPO4和MPL都是必需的。表1血清轉(zhuǎn)化率(％)和血清轉(zhuǎn)化物的抗-HBs抗體的幾何平均效價(jià)(GMT)初步分析表2個(gè)別抗-HBs抗體效價(jià)分布的初步分析</tables></tables><tablesid="table7"num="007"><tablewidth="847">組別時(shí)間人數(shù)＞＝10n％＞＝100n％＞+1000n％第一次注射后(第2個(gè)月)50816.000.000.0第二次注射后(第3個(gè)月)504692.03570.01122.0第二次注射后(第4個(gè)月)424095.23071.4511.9第二次注射后(第6個(gè)月)2525100.01872.0416.05注射前5900.000.000.0第一次注射后(第1個(gè)月)521528.859.611.9第一次注射后(第2個(gè)月)522038.535.800.0第二次注射后(第3個(gè)月)524892.33975.01426.9第二次注射后(第4個(gè)月)413995.13175.6922.0第二次注射后(第6個(gè)月)242291.71875.0520.8</table></tables>權(quán)利要求1.一種疫苗組合物，其包含有乙肝抗原連同3-O-去酰單磷酰基脂類A和磷酸鋁。2.一種如權(quán)利要求1中所要求的疫苗組合物，其中該抗原包含有乙肝表面抗原(HBsAg)或其變體。3.一種如權(quán)利要求2中要求的疫苗組合物，其中該HBsAg包含有HBsAg的S-抗原(226個(gè)氨基酸)。4.一種如權(quán)利要求3中所要求的疫苗組合物，其中HBsAg還包含有前-S序列。5.一種如權(quán)利要求3或權(quán)利要求4中所要求的疫苗組合物，其中該HBsAg是式(L*，S)的組合顆粒，其中L*指乙肝病毒的修飾過(guò)的L蛋白，該蛋白具有一段氨基酸序列，該序列包括有L蛋白的第12-52殘基，接著是第133-145殘基，接著是第175-400殘基，并且S指HBsAg的S-蛋白。6.一種如任何前述權(quán)利要求中所要求的疫苗組合物，其包括一種或多種肝炎抗原，并且至少包括有一種選自甲肝抗原或非-肝炎抗原的其他成分，該組合物提供抗一或多種下述疾病的保護(hù)作用白喉、破傷風(fēng)、百日咳、b型嗜血桿菌流感(Hib)、脊髓灰質(zhì)炎和腦膜炎A、B或C。7.一種如權(quán)利要求6的疫苗組合物，該組合物選自一種DTP(白喉-破傷風(fēng)-百日咳)-HBsAg組合、一種Hib-HBsAg組合、一種DTP-Hib-HBsAg組合以及一種IPV(滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗)-DTP-Hib-HBsAg組合。8.一種如權(quán)利要求7的疫苗組合物，其還包含有甲肝抗原。9.一種如任何前述權(quán)利要求中所要求的疫苗組合物，其中3-O-去酰單磷酰基脂類A以每劑10μg-100μg的劑量范圍存在。10.一種如本權(quán)利要求書(shū)所要求的用于藥物的疫苗組合物。11.將乙肝抗原連同3-O-去酰單磷酰基脂類A和磷酸鋁用于制備用來(lái)預(yù)防或治療肝炎感染的藥物中。12.一種在易感染乙肝或正被乙肝感染的人體內(nèi)誘導(dǎo)10mU范圍內(nèi)的中和抗體效價(jià)的方法，該方法是通過(guò)給藥如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物來(lái)誘導(dǎo)的。13.用于制備一種疫苗的如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物的用途，該疫苗是用于在人體內(nèi)誘導(dǎo)10mU范圍內(nèi)的抗乙肝的中和抗體。14.一種治療正被乙肝感染或易感染乙肝的人類實(shí)驗(yàn)對(duì)象的方法，該方法包括給藥有效劑量的如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的疫苗。15.一種治療患正在進(jìn)行的乙肝感染的人類試驗(yàn)對(duì)象的方法，該方法包括給藥有效劑量的如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的治療疫苗。16.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的疫苗的工藝，其包括將乙肝表面抗原吸附到磷酸鋁上，并且再加入3-O-去酰單磷?；怉。全文摘要提供了一種新的疫苗制劑,該制劑包含有與磷酸鋁和3－去－O－酰單磷?；怉結(jié)合的乙肝成分,尤其是乙肝表面抗原。文檔編號(hào)A61K39/295GK1176604SQ96192146公開(kāi)日1998年3月18日申請(qǐng)日期1996年2月15日優(yōu)先權(quán)日1995年2月25日發(fā)明者皮埃爾·豪澤,納撒利·M-J·C·加肯,皮埃爾·德斯蒙斯申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司