專利名稱：一種高分子微球及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物及蛋白載體，可用于制備靶向緩釋藥物或疫苗，屬生物醫(yī)學領域。
可生物降解高分子微球用作藥物載體可實現(xiàn)藥物的靶向性及控制釋放性，從而起到提高藥物的生物利用度、增強治療效果的作用；用作疫苗載體可減少免疫次數(shù)，產(chǎn)生佐劑效應，增強免疫效果，提高有效免疫覆蓋率。世界衛(wèi)生組織(WHO)將研制微球疫苗作為新一代疫苗劑型的方向。(J.Med.Vird.1990，31(1)，62～66)。
微球所用材料一般采用可生物降解的高分子，主要有白蛋白、明膠、淀粉等天然高分子及聚乳酸類合成高分子。聚乳酸類合成高分子具有生物相容性好、可生物降解、在體內較穩(wěn)定等優(yōu)點，是最早被認可為安全使用于人體內的合成材料(Polymer in Medicene and Surgery，R.L Kronen thal etal Eds.，Plenum，New York，1975，pp.119-137)?，F(xiàn)在用得較多的是乳酸與乙醇酸或ε-已內酯的共聚物(Polymer，1979，20，1459-1466)。然而，最近一種新型的嵌有親水性鏈段的聚乳酸—聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物被制備出來并受到關注(J.Appl Polym.Scl.1990，39，1-9)。該種聚乳酸類材料由于嵌入了親水性的聚乙二醇，使材料的親水性及結晶性得到了改善，成為一種作為藥物載體的優(yōu)良材料。
作為藥物載體的高分子微球，它的靶向效果及控釋能力與其粒徑密切相關。Jani等的研究(J.Pharm.Pharmacol 1989，41，809-812)表明，粒徑小于3μm的微粒通過口服或靜注可實現(xiàn)網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)組織的靶向性。Lewis的研究(J.Pharm.Pharmaool.1992，44271-274)認為粒徑小于10μm的微?？诜髮⑦M入血液循環(huán)，并進入炎癥組織，Eldridge(Molecular Immunology，1991，28，287-292)及Ohagan(Immunology，1991，73，239)的研究均表明了粒徑小于10μm的聚乳酸微球無論口服或靜注均可實現(xiàn)對淋巴系統(tǒng)組織等的網(wǎng)狀內皮組織靶向給藥。從以上文獻可知，對生物體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)產(chǎn)生靶向的藥物載體系統(tǒng)最關鍵的技術指標是粒徑。國內曾制備過10μm以上粒徑的聚乳酸微球(中國生物醫(yī)學工程學報，1987，6(2))。華西醫(yī)大藥學院曾制備過微米級的白蛋白微球(藥學學報，1993，28(1)，68-74)，以實現(xiàn)對動物肝臟的靶向，但未見有10μm以下的聚乳酸類微球的報道。
由于聚乳酸微球的制備須在油/水乳液體系中完成，微球的粒徑通常與乳液分散劑與輸入能有關。國外文獻提供的制備10μm以下聚乳酸微球的工藝參數(shù)，存有以下缺陷①工藝條件不穩(wěn)定；②特定分子量的分散介質及乳化設備增加產(chǎn)品成本，難以放大；③產(chǎn)品微球后處理困難，難以保證具生物活性的蛋白或藥物不喪失活性；④產(chǎn)品微球表面光潔度差、粒子之間粘連嚴重。
本發(fā)明的目的在于提供一種以聚乳酸—聚乙二醇為基質材料、粒徑在10μm以下可控，表面光滑無粘連、蛋白含量為10％，能對生物體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)產(chǎn)生靶向性的微球及其緩和的制備方法。
本發(fā)明的技術內容微球制備采用乳液溶劑蒸發(fā)技術，將微球基質材料乳酸類聚合物溶于油性溶劑，所得到的油性溶液逐滴加入水相分散介質溶液中，在攪拌條件下形成乳液，并通過控制前期轉速來控制微球粒徑。后期在室溫條件下，連續(xù)攪拌12-14小時，緩慢蒸干溶劑，用蒸餾水洗除分散介質，便得到產(chǎn)物微球。
在包裹蛋白或藥物時，應采用二次乳化技術，即聚合物基質溶液未加入水相分散介質之間將蛋白或藥物的溶液加入聚合物基質溶液中，通過超聲乳化技術使蛋白或藥物均勻地分散在聚合物基質材料中，再將此乳液加入到水相分散介質中，并按微球制備過程進行。
本發(fā)明微球基質材料選用分子量(Mη)50，000、聚乙二醇(PEG)嵌段為10％(W/W)的PLA-PEG共聚物。其它乳酸共聚物也可適用。作為本發(fā)明的微球，無論選用何種聚乳酸共聚物，分子量(Mn)應在以下范圍5×103～6×104。
作為本發(fā)明的水相分散介質，采用水解度88％～90％鏈節(jié)數(shù)為1700～1750的聚乙烯醇(PVA)與分子量(Mw)6×103～3×104的聚乙二醇(PEG)的混合水溶液，PVA的濃度范圍是4％～10％。PEG的濃度范圍是4％～6％。
作為本發(fā)明分散介質的商品PVA，需經(jīng)下法處理將原始商品PVA裝入透析袋(透析膜，截留分子量5,000)，在蒸餾水中透析三天以除去鹽類及小分子雜質，透析過的PVA按10％的濃度配成溶液。置于高壓釜中，于2.03×105N/M2壓力條件下，120℃保持30分鐘。
作為本發(fā)明基質材料的有機溶劑是二氯甲烷(DCM)或其與丙酮(AC)的混合溶劑DCM--AC，其體積百分比為70～100∶0～30。
作為本發(fā)明的功能輸入裝置采用普通電磁攪拌器，其攪拌速度范圍為600-1000轉/分。
作為本發(fā)明微球制備前期乳化時間至少應為15分鐘。
采用本發(fā)明可以制得具有優(yōu)良生物相容性及可生物降解，能攜載蛋白和藥物，能通過口服或靜脈注射實現(xiàn)對生物體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)組織產(chǎn)生靶向性的高分子微球。該微球粒徑在10μm以下可控，表面光潔、無粘連，粒徑可在以下數(shù)個區(qū)域＜3μm、＜5μm、＜10μm(

圖1、圖2)。經(jīng)同位素示蹤及組織斷裂顯微照像證實了本發(fā)明微球的靶向作用(圖3、圖4)。
本發(fā)明的積極效果是由于本發(fā)明采用了新型的PLA-PEG嵌段共聚物改善了聚乳酸類材料對藥物及蛋白的包接性能，所制備的微球粒徑小于10μm，并對生物體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)產(chǎn)生靶向作用，能在不影響生物活性的條件下，攜載藥物或蛋白，故而本微球將成為一種新的藥物劑型，實現(xiàn)對肝、脾、淋巴系統(tǒng)的靶向緩釋給藥。本微球的制備方法溫和、現(xiàn)實可行。PVA-PEG復合分散介質增強分散體系的均勻性，微球后期洗滌方便，在室溫下即可進行，乳化裝置采用電磁攪拌器，改善工藝的適用性，可方便地實現(xiàn)工藝放大。
下面為
具體實施例方式實施例1粒徑小于10μm的共聚物微球的制備。準確稱量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM中，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)80ml，PEG水溶液(10％)60ml，裝入500ml廣口瓶中，用電磁攪拌器以100轉/分的轉速攪拌混勻。攪拌10分鐘后，轉速增至400轉/分。將完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混勻的PVA-PEG水相分散介持中。加料完畢后，轉速增至600轉/分，維持此速度攪拌20分鐘，然后將速度降至300轉/分，持續(xù)攪拌12小時。待溶劑蒸發(fā)完畢，將乳液產(chǎn)物離心分離，離心速度5000轉/分，時間5分鐘，倒掉上層清液，用玻棒將下層白色沉淀攪勻，再加入蒸餾水，重新分散，離心洗滌，倒掉上層清液。重復洗滌過程，洗滌八次，收集白色沉淀，凍干貯存，產(chǎn)率80％。用掃描電子顯微鏡測試粒徑及其分布。
實施例2粒徑小于5μm的共聚物微球的制備。準確稱量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM-AC混合液(90/10)，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)100ml，PEG水溶液(10％)40ml，裝入500ml廣口瓶中，按實施例1混勻。將完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混勻的PVA-PEG溶液中。轉速增至800轉/分，維持此速度攪拌20分鐘，將速度降至300轉/分，持續(xù)攪拌12小時，待溶劑蒸發(fā)完畢，按實施例1洗滌，離心速度7000轉/分，時間5分鐘，產(chǎn)率81％。
實施例3粒徑小于3μm的共聚物微球的制備。準確稱量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DM-Aetlon混合液(80/20)，完全溶解。量取PVA水溶液(10％)110ml，PEG水溶液30ml，裝入500ml廣口瓶中，按實施例1混勻。將完全溶解的PLA-PEG溶液逐滴加入混勻的PVA-PEG溶液中。轉速增至800轉/分，維持此速度攪拌20分鐘，將速度降至300轉/分，持續(xù)攪拌12小時，待溶劑蒸發(fā)完畢，按實施例1法洗滌，離心速度9000轉/分，離心時間5分鐘，產(chǎn)率75％。
實施例4，人血清蛋白含量8％，粒徑小于3μm的共聚物微球的制備。準確稱量人血清的蛋白0.9g，溶于12ml蒸餾水中。準確稱量共聚物PLA-PEG 9g，溶于100ml DCM-AC混合液中。將PLA-PEG溶液置于超聲振蕩裝置中，用直徑10mm振頭振蕩。逐滴加入白蛋白水溶液于PLA-PEG溶液中，在輸入功率為150W條件下，超聲振蕩10分鐘，得到蛋白在PLA-PEG均勻分散的水/油乳液。按實施例3將該乳液液加入PVA-PEG溶液中。轉速增至800轉/分，維持此速度攪拌20分鐘，將速度降至300轉/分，持續(xù)攪拌12小時后，按實施例1法洗滌處理。凍干微球稱重8.34g產(chǎn)率84％。
實施例5，外膜蛋白含量5％，粒徑小于3μm的共聚物微球的制備，量取外膜蛋白水溶液(23mg/ml)15ml。稱取PLA-PEG共聚物1.8g，溶于25mlDCM-AC(80/20)混合液中。將共聚物有機溶液，置于超聲振蕩裝置中，在超聲振蕩條件下，逐滴加入外膜蛋白水溶液。將輸出功率設置為150W，超聲振蕩15分鐘，得到外膜蛋白在PLA-PEG中均勻分散的水油乳液。按實施例3將該乳液加入到30ml PVA-PEG溶液中。轉速增至800轉/分。維持此速度攪拌20分鐘，將速度降至300轉/分，持續(xù)攪拌12小時后，按實施例1法洗滌處理。凍干微球稱重1.872g，產(chǎn)率87％。
實施例6外膜蛋白微球蛋白含量的測試。
準確稱量100mg凍干包裹外膜蛋白的PLA-PEG微球。將該微球溶于10ml DCM溶液中。加入磷酸鹽緩沖溶液(PB，pH7.4，1/15M)10ml，在超聲振蕩器上分散10分鐘(100W)，將形成的乳液倒入分液漏斗中，靜置30分鐘，分離出水相。再在微球有機溶液中加入磷酸鹽緩沖溶液10ml，重復上述步驟一次。將兩次分離出的水相淬取液倒在一起，留做蛋白含量測試。測試前配制堿性銅溶液①配制4％的Na2CO3溶液200ml；②配制0.2N的NaOH溶液200ml；③配制0.04mol/ml的CuSO4溶液50ml；④配制2％的酒石酸鉀溶液50ml。按50ml①；加50ml②；加1ml③；加1ml④配得堿性銅溶液，再配制5％的牛血清白蛋白標準溶液。
取樣品1ml加5ml堿性銅溶液搖勻反應10分鐘，再加入酚試劑0.5ml，搖勻后在室溫下反應30分鐘，用紫外—可見分光光度計(Shimadzu，UV-120-02)檢測樣品在650nm處吸收，查標準曲線，得到樣品中外膜蛋白含量為4.973mg，微球中外膜蛋白濃度為5％，外膜蛋白包裹率為27.13％。
附圖及其說明圖1.采用本工藝所制備的PLA-PEG微球的掃描電子顯微鏡照片a.粒徑＜3μm，b.粒徑5μm，c.粒徑＜10μm。圖2.各種粒徑的PLA—PEG微球的粒徑分布統(tǒng)計圖。圖3.靜脈注射粒徑＜5μm的PLA-PEG微球，2)分鐘以后兔的活體顯像。
a.20分鐘后，僅有肝臟顯影；b.30小時后，僅有腸部顯影可見。圖4.口服粒徑＜5μm的PLA-PEG微球，10分鐘后的兔活體顯像。a.10分鐘后，僅有胃部顯影；b.30小時后，僅有腸部顯影。圖5.大白兔口服粒徑小于5μm，外膜蛋白含量2％的PLA-PEG微球，一個月后摘取網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)器官，對其深冷斷裂面的掃描電子顯像照片，可清楚地看見微球在肝、脾、淋巴結中的存在。
權利要求
1.一種可生物降解、生物相容的高分子微球，其特征在于微球基質成分為聚乳酸—聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物，微球粒徑在10微米以下，PLA-PEG的粘均分子量為5×103～6×104。
2.一種根據(jù)權利要求1的微球制備方法，依次包括以下步驟①PLA-PEG共聚物溶于有機溶劑中形成有機溶液；②在攪拌下加入到水相分散介質中；③連續(xù)攪拌待有機溶劑蒸發(fā)干；④用水在離心條件下洗去水相分散介質，其特征是水相分散介質為聚乙烯醇—聚乙二醇(PVA-PEG)混合水溶液，溶液濃度為4％～10％，PVA與PEG的重量百分比組成為40～70∶30～60。
3.根據(jù)權利要求1的微球，其特征是PEG在微球基質中的重量百分比為5～15％，PEG的分子量為6×103～2×104。
4.根據(jù)權利要求2的方法，其特征是有機溶劑為二氯甲烷(DCM)和丙酮(AC)的混合液，DCM與AC的體積百分比為70～100∶0～30。
5.根據(jù)權利要求2的方法，其特性是有機溶劑為DCM。
6.根據(jù)權利要求2、4或5的方法，其特征是PVA的水解度為87～90％，聚合鏈節(jié)數(shù)為1700～1750。
7.根據(jù)權利要求2、4或5的方法，其特征是PVA的水解度為87～90％，重均分子量為10,000至20,000。
8.根據(jù)權利要求2、4或5的方法，其特征是攪拌速度為400～1000RPM。
9.根據(jù)權利要求1或3的微球的用途，其特征是通過口服或靜注給藥得到生物體內網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)組織的靶向性。
10.根據(jù)權利要求1或3的微球的用途，其特征是微球作為攜載藥物或蛋白的載體，用于對生物的靶向給藥及緩慢控制釋放。
11.根據(jù)權利要求1或3的微球的用途，其特征是微球攜載人血清白蛋白，攜載量為微球重量的1-10％。
12.根據(jù)權利要求1或3的微球的用途，其特征是微球攜載外膜蛋白，攜載量為微球重量的1-5％。
13.根據(jù)權利要求1或3所述的微球的用途，其特征是載蛋白微球可用于一次性給藥長效免疫疫苗的制備。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可生物降解高分子微球及其制備方法和用途。該微球基質成分為聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物。以聚乙烯醇-聚乙二醇(PVA-PEG)混合溶液為分散介質，通過乳液分散溶劑蒸發(fā)法，在機械攪拌作用下制備出該微球。微球粒徑在10微米以下可控。該微球表面光滑、顆粒規(guī)則無粘連對生物體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)具有優(yōu)良的靶向性，能攜載藥物和蛋白，可生物降解，用于藥物及疫苗的靶向緩釋體系。
文檔編號A61K9/16GK1132758SQ9511130
公開日1996年10月9日 申請日期1995年4月6日 優(yōu)先權日1995年4月6日
發(fā)明者李雄偉, 肖錦, 王紅禮, 鄧先模 申請人:中國科學院成都有機化學研究所