專利名稱：一種淡紫灰葉鏈霉菌dkrs菌株及用它制備阿克拉希霉素a，b，y和糖苷配基的方法
專利說明 本發(fā)明涉及鏈霉菌屬的新菌株及通過培養(yǎng)該菌株制備抗癌阿克拉希霉素(aclacinomycin)A，B，Y和糖苷配基的方法。
阿克拉希霉素是含有吡咯基的蒽環(huán)系統(tǒng)抗癌藥并由三個(gè)脫氧吡喃糖殘基構(gòu)成。它通過被插入DNA的堿基對(duì)中以抑制核酸的合成而表現(xiàn)出細(xì)胞毒素活性。特別是不同于其他蒽環(huán)系藥如道諾紅菌素(daunorubicin)，亞德里亞霉素(doxorubicin)和洋紅霉素(carminomycin)，阿克拉希霉素選擇性地抑制RNA的合成。此外，它具有抵抗急性白血病和惡性淋巴瘤的活性，同時(shí)它對(duì)心臟毒性是低的。
阿克拉希霉素可分成三類阿克拉希霉素A，B和Y。它們基本上具有糖苷配基，稱作阿克拉菌素(aklavine)。它們當(dāng)中，阿克拉希霉素B在臨床中很少采用，這是因?yàn)樗@示出很強(qiáng)的副作用和表現(xiàn)出較低的抗腫癌活性。阿克拉希霉素A因其高抗癌或腫瘤活性和低副作用及高產(chǎn)率而已經(jīng)在實(shí)踐上采用了。另外，預(yù)想到阿克拉希霉素Y是最有用的抗癌藥，但是，與阿克拉希霉素A或B相比，它顯示出非常高的抗腫瘤活性和低的副作用。
通過加利利鏈霉菌(Streptomyces galilaeus)的發(fā)酵制備阿克拉希霉素的方法是已知的(授權(quán)于Hamao Umezawa的US專利No.3，988，315)。這篇專利報(bào)道了加利利鏈霉菌制備包括阿克拉希霉素A，B和Y的約18種類似物。但是產(chǎn)率是非常低的阿克拉希霉素A(主要產(chǎn)物)制得的量為46毫克/升培養(yǎng)基，阿克拉希霉素B制得的量為23毫克/升，而其它產(chǎn)物(包括阿克拉希霉素Y)制得的量是極低。因此，使用上述鏈霉菌株很難以工業(yè)規(guī)模制造阿克拉希霉素，從而需要提供能夠以高產(chǎn)率制造阿克拉希霉素的新菌株。
本發(fā)明人已作過廣泛的研究，以提供一種通過發(fā)酵以工業(yè)規(guī)模制造阿克拉希霉素的方法。結(jié)果是提供了淡紫灰葉鏈霉菌12/3A，它能夠制造阿克拉希霉素A和B。本發(fā)明人基于提供改進(jìn)了的菌株的目的，作了進(jìn)一步研究，該菌株能夠產(chǎn)生較大量的阿克拉希霉素，而這一目的可通過從菌株12/3A衍生的突變體淡紫灰葉鏈霉菌DKRS來實(shí)現(xiàn)。
因而，本發(fā)明的目的是提供淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的新菌株，它能夠產(chǎn)生大量的阿克拉希霉素A，B，Y和糖苷配基。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種通過培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的菌株而制造阿克拉希霉素的方法并從培養(yǎng)基和細(xì)胞中回收阿克拉希霉素的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種通過在培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的菌株之后用乙酸緩沖液或鹽酸將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到某數(shù)值來選擇性制造阿克拉希霉素A或Y的方法。
根據(jù)本發(fā)明，淡紫灰葉鏈霉菌12/3A(淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的親株)在培養(yǎng)基中可制得60毫克/升的阿克霉素A和10毫克/升的阿克拉希霉素B。
本發(fā)明的淡紫灰葉鏈霉菌DKRS可通過用化學(xué)誘變劑N-亞硝基甲基縮二脲(NMB)讓親株淡紫灰葉鏈霉菌12/3A變異而獲得。該突變體能夠產(chǎn)生阿克拉希霉素A，B，Y和糖苷配基，特別能夠產(chǎn)生大量的阿克拉希霉素Y。
通過以下方法選擇本發(fā)明的突變體，在完全固定體培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌12/3A達(dá)6-7天之后，加入殺菌后的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用0.05M三蘋果酸緩沖液(pH6.5)洗滌三次并用同樣的緩沖液稀釋到106-108孢子/毫升的數(shù)目。在向孢子懸浮液添加NMB至最終濃度為500μg/ml之后，讓該混合物在30℃下存放20分鐘。反應(yīng)完成之后，通過離心或過濾分離孢子，用無菌生理鹽水洗滌3次，然后成條狀植在完全瓊脂介質(zhì)中。在30℃下培養(yǎng)7-10天之后，在瓊脂盤上出現(xiàn)突變體的菌落并分離之。
本發(fā)明的突變體淡紫灰葉鏈霉菌DKRS已經(jīng)在1993年8月26日由韓國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心(韓國大田市)收藏，并收到入藏登記號(hào)KCTC 8539P。在1993年8月26日轉(zhuǎn)送布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)收藏，并收到入藏登記號(hào)KCTC 0092BP。
本發(fā)明所采用的完全培養(yǎng)基具有以下組成葡萄糖10.0%，酪素水解物0.2%，肉汗萃取物0.1%，酵母萃提物0.1%和瓊脂1.5%，pH7.0-7.2。
根據(jù)本發(fā)明的菌株淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)具有以下微生物學(xué)特性 1.形態(tài)學(xué)的特性 在顯微鏡下觀察在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時(shí)，基質(zhì)菌絲沒有分節(jié)，孢子呈橢球形并適當(dāng)?shù)匦纬刹惶L的鏈形。這些孢子測(cè)得大小為2.3μm×1.4μm并形成粉孢子，它們的表面是光滑的。
2.培養(yǎng)學(xué)的特性 當(dāng)在28℃下、在以下各種固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的菌株具有以下特性 (1)在Waksman培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有綠色生長物;出現(xiàn)粉紅色-褐色可溶性色素。
(2)在Gaus-Ⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落生成粉紅色-白色生長物，基質(zhì)菌絲帶有紅色-褐色;沒有可溶性色素。
(3)在燕麥粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落生成灰色生長物;基質(zhì)菌絲帶有紅色-褐色;沒有可溶性色素。
(4)在玉米粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有暗褐色生長物;暗褐色基質(zhì)菌絲。
(5)在Gans-Ⅱ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有綠褐色生長物;暗褐色基質(zhì)菌絲;生成暗褐色可溶性色素。
(6)在大豆粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有淡綠色生長物;褐綠色基質(zhì)菌絲;生成紅褐色可溶性色素。
(7)在Riestrick培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有褐色生長物，生成暗褐色可溶性色素。
(8)在Czapek-Dock培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落是帶有白色-粉紅色生長物;紅褐色基質(zhì)菌絲;沒有可溶性色素。
(9)在Bennet培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有淺砂色生長物;沒有可溶性色素。
(10)在肉胨瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有淺砂色生長物;生成褐色可溶性色素。
(11)在葡萄糖-天門冬酰胺培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落帶有綠色生長物;沒有可溶性色素。
3.生理特性 本發(fā)明的菌株是一種需氧菌，在28℃顯示出最佳的生長能力。它在含有玉米粉的培養(yǎng)基中有紅桔色生長物，顯示了胨化、淀粉水解和凝膠液化能力。作為碳源用麥芽糖和乳糖時(shí)菌株生長快;用鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等時(shí)生長緩慢;而用蔗糖、甘露醇和山梨糖醇時(shí)沒有生長。
在親株(12/3A)和本發(fā)明菌株淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)之間的形態(tài)學(xué)特性和生理特性方面的差異示于表1。
表1 淡紫灰葉鏈霉菌 DKRS(

本發(fā)明菌株) 12/3A(親菌株) I.形態(tài)學(xué)特性 孢子囊柄 垂直于基礎(chǔ)菌絲,并且 垂直于基礎(chǔ)菌絲,并且 是單純的螺旋形狀 是單純的螺旋形狀 大小:8.8-32μm 大小:10-12μm 孢子 矩形的橢球形 接近橢球形 大小:2.3×1.4μm 大小0.7×1.4μm 孢子化的程度 ++ +++ 核的形態(tài) 圓型或接近橢球形 球形或接近橢球形 表面 光滑 光滑 粉孢子 基質(zhì)菌絲和氣生菌絲體的粉孢子 沒有 發(fā)展快,且尺寸易變化 核的形態(tài) 非常大而且填充在整個(gè)細(xì)胞中 II.生理學(xué)特性 胨化 + + 淀粉水解 + + 凝膠液化 + + 糖類利用 麥芽糖 +++ ND 乳糖 +++ ND 鼠李糖 + + 葡萄糖 + +++ 果糖 ND +++ 木糖 + +++ 阿拉伯糖 + +++ 半乳糖 + +++ 蔗糖 - - 肌醇 ND +++ 甘露糖醇 - - 山梨糖醇 - ND a)+++:快速生長 +:一般生長 -:沒有生長 ND:沒有檢測(cè)使用本發(fā)明的菌株制造阿克拉希霉素的方法包括在含有碳源、氮源、無機(jī)物和其它營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的步驟和從培養(yǎng)基和細(xì)胞中回收阿克拉希霉素的步驟，而該培養(yǎng)基通常用于鏈霉菌株的發(fā)酵以在培養(yǎng)基和細(xì)胞中聚集阿克拉希霉素。
在本發(fā)明的培養(yǎng)中所使用的主要碳源可包括但不限于淀粉和大豆粉。在本發(fā)明的培養(yǎng)過程中所使用的氮源可包括但不限于大豆粉和硫酸銨。根據(jù)本發(fā)明在發(fā)酵中使用的無機(jī)組分可包括但不限于碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅和氯化鈉等。
發(fā)酵可在28-30℃和pH6.8-7.5下，在需氧條件下進(jìn)行4-5天?？捎糜袡C(jī)或無機(jī)堿性物質(zhì)，氨水和碳酸鈣等在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)pH值。
由菌株產(chǎn)生的產(chǎn)物，主要貯藏于細(xì)胞中，一部分分泌于細(xì)胞外，貯藏于培養(yǎng)基中。通過使用常規(guī)分離低分子物質(zhì)的方法從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離出阿克拉希霉素、例如，使用有機(jī)溶劑如丙酮或氯仿或甲苯和異丙醇萃取和使用硅酸的柱色譜法。優(yōu)選使用甲苯和異丙醇(30∶1-35∶1，按體積)的混合溶劑來分離或提純阿克拉希霉素和糖苷配基。
在本發(fā)明中，在細(xì)胞內(nèi)部聚集的阿克拉希霉素可通過使用甲醇和氯仿(20∶1)混合物來萃取并可用HPLC來分析。對(duì)于HPLC，硅石和氯仿∶甲醇∶乙酸∶水∶三乙胺(68∶20∶10∶2∶0.01(V/V))混合物可分別用來作靜止和移動(dòng)相。洗脫液以1.0毫升/分鐘的流速通過色譜柱，收集的各流分測(cè)定它們?cè)?32nm處的吸光度。通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)試樣的吸收停留時(shí)間和細(xì)胞內(nèi)部的那些試樣的吸收停留時(shí)間，可以計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)阿克拉希霉素A，B，Y和糖苷配基的濃度。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵后，通過改變分離條件和提純步驟可將阿克拉希霉素A轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒖死Ｃ顾豗，反之亦然。這種轉(zhuǎn)變不僅取決于分離和提純條件，而且與細(xì)胞的酶活性有關(guān)。如果用乙酸緩沖液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH4.4，那么在培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)部所含的絕大部分阿克拉希霉素A被轉(zhuǎn)變成Y，另一方面，如果用鹽酸將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH4.6，那么阿克拉希霉素Y被轉(zhuǎn)變成A。因此，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH而選擇性地從培養(yǎng)基中得到阿克拉希霉素A或Y是可能的。
已經(jīng)被本發(fā)明人證實(shí)，高純度分離出的阿克拉希霉素Y比阿克拉希霉素A或B表現(xiàn)出更高的抵抗結(jié)腸癌的抗癌活性，即使在較高的劑量時(shí)，毒性也很低。
通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不限制于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 用一鉑環(huán)的淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)給斜面培養(yǎng)基(Note 2)接種。在28℃下培養(yǎng)5天。這樣獲得的培養(yǎng)物被接種到500ml三角燒瓶內(nèi)的50ml種子培養(yǎng)基(Note 3)中，該培養(yǎng)基預(yù)先已調(diào)節(jié)到pH7.8并在121℃下消毒15分鐘。消毒后，在回轉(zhuǎn)式震蕩培養(yǎng)機(jī)中在250轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)2天。生產(chǎn)培養(yǎng)基(Note 4)被調(diào)節(jié)到pH7.5，并用上述種子培養(yǎng)物接種至濃度為10%。在通氣量2.0vvm，攪拌速度500轉(zhuǎn)/分，溫度28℃的條件下發(fā)酵4天。
在本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)基具有以下組成 Note 2斜面培養(yǎng)基;淀粉2%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，KNO30.1%，鹽0.05%，F(xiàn)e2(SO4)30.001%，瓊脂1.5-2%(pH7.2) Note3種子培養(yǎng)基;葡萄糖2%，淀粉1.5%，大豆粉1%，酵母萃提物1%，CaCO30.3%，MgSO40.2%，NaCl0.3%(pH7.8) Note 4生產(chǎn)培養(yǎng)基;葡萄糖3%，淀粉3.5%，大豆粉1%，CaCO30.5%，MgSO40.2%，F(xiàn)eSO40.001%，ZnSO40.001%(pH7.5) 通過按照與以上所述的同樣步驟培養(yǎng)本發(fā)明的親株和突變體，并測(cè)定在每一種培養(yǎng)基中產(chǎn)生的阿克拉希霉素A，B及Y的量。結(jié)果示于表2 表2 從表2可看出，與親菌株RS相比較，本發(fā)明的菌株DKRS產(chǎn)生了大量的阿克拉希霉素Y并顯示阿克拉希霉素B的產(chǎn)率提高了，因而可以認(rèn)為本發(fā)明的菌株DKRS是一種突變體，其中作為二次代謝產(chǎn)物的阿克拉希霉素的部分合成途徑改變了。
實(shí)施例2 在本實(shí)施例中，從淡紫灰葉鏈霉菌DKRS的培養(yǎng)基中分離出阿克拉希霉素。取實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)基700毫升用鹽酸調(diào)節(jié)至pH4.5，并經(jīng)過過濾得到菌絲體。將氯仿加入到該菌絲體中至濃度為2ml/克菌絲體，然后該混合物充分混合1小時(shí)并過濾。這一操作步驟重復(fù)兩次。
收集氯仿濾液(120毫升)并通過真空蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。向該濃縮物添加15毫升乙酸丁酯和丙酮的混合溶劑(4∶1)并完全溶解。用乙酸緩沖液(pH3.4)處理所得溶液以萃取產(chǎn)物，然后再用氯仿再萃取。在氯仿蒸發(fā)和萃提物濃縮之后，加入正己烷或石油醚，以沉淀出阿克拉希霉素A(27mg)，B(35mg)和Y(41mg)。
實(shí)施例3 取實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)基700ml用鹽酸調(diào)節(jié)到pH4.6，并在28℃下充分混合3小時(shí)。然后重復(fù)實(shí)施例2中的操作步驟得到阿克拉希霉素A(50mg)，B(20mg)和Y(13mg)。
實(shí)施例4 取實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)基(700ml)用乙酸緩沖液調(diào)節(jié)pH到4.4，并在28℃下充分混合2小時(shí)，然后重復(fù)實(shí)施例2的步驟，得到阿克拉希霉素A(3mg)，B(40mg)和Y(50mg)。
實(shí)施例5 將具有以下組成(Note 5)的發(fā)酵培養(yǎng)基(5升)置于10升發(fā)酵室中并被調(diào)節(jié)到pH7.5。將在實(shí)施例中得到的種子培養(yǎng)物接種到濃度為10%，然后在攪拌(350轉(zhuǎn)/分)和通氣(1.0vvm)條件下在28℃進(jìn)行發(fā)酵4天。
Note 5發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖3%，淀粉5.5%，大豆粉1.5%，CaCO30.9%，MgSO40.25%，ZnSO40.002%，F(xiàn)eSO40.002%。
這樣得到的培養(yǎng)基(3.5升)含有阿克拉希霉素A(245mg)，B(315mg)和Y(560mg)。將該培養(yǎng)基用鹽酸調(diào)至pH4.6，離心后得到菌絲體。向該菌絲體添加1.5升氯仿并充分混合1.5小時(shí)。重復(fù)該步驟兩次。
另一方面，將600毫升氯仿添加到濾液中萃取阿克拉希霉素。
這樣得到的氯仿萃取物合并到一起，并在真空下濃縮。將沉淀物溶于乙酸丁酯和丙酮(4∶1按體積)的混合溶劑中。得到的溶液與硫酸鈉混合，然后過濾該混合物并濃縮。最后，添加正己烷得到沉淀物，然后蒸發(fā)后得到1.5g混合阿克拉希霉素。
實(shí)施例6 將實(shí)施例5中得到的混合阿克拉希霉素(1.5g)溶于最低量的甲苯和氯仿(8∶2按體積)混合溶劑中，并在填充有硅酸的柱上進(jìn)行色譜分離。甲苯用來作為洗脫液。在含有糖苷配基的流分被洗脫之后，洗脫液轉(zhuǎn)換成甲苯和異丙醇(35∶1按體積)混合溶劑，得到含有阿克拉希霉素B的流分。然后采用甲苯和異丙醇(30∶1按體積)混合溶劑作為洗脫液，得到含有阿克拉希霉素Y的流分。
向含有每一種產(chǎn)物的流分中添加正己烷或石油醚以沉淀產(chǎn)物，然后將沉淀物干燥得到糖苷配基(10mg)，阿克拉希霉素B(154mg)，Y(182mg)和A(75mg)，它們?nèi)砍庶S色粉末狀。
權(quán)利要求
1、一種淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)，其具有產(chǎn)生阿克拉希霉素A，B，Y和其糖苷配基的能力。
2、權(quán)利要求1所述的淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)，其特征在于當(dāng)用乙酸緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為4.4時(shí)，它能夠?qū)⒖死Ｃ顾谹轉(zhuǎn)變?yōu)閅，當(dāng)用鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為4.6時(shí)，它能將阿克拉希霉毒Y轉(zhuǎn)變?yōu)锳。
3、一種由發(fā)酵制造阿克拉希霉素A，B，Y和其糖苷配基的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)以在細(xì)菌內(nèi)和培養(yǎng)基中聚集阿克拉希霉素A、B、Y和其糖苷配基后，從培養(yǎng)基中和細(xì)菌內(nèi)回收并提純。
4、權(quán)利要求3的方法，其特征在培養(yǎng)是在需氧培養(yǎng)條件下在28-30℃和pH6.8-7.5下進(jìn)行的。
5、權(quán)利要求3的方法，其特征在于使用甲苯和異丙醇的30∶1-35∶1體積比的混合溶劑，回收且提純阿克拉希霉素A、B、Y及糖苷配基。
6、阿克拉希霉素Y的制造方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)，將培養(yǎng)液用乙酸緩沖溶液調(diào)整至pH4.4，由細(xì)菌和培養(yǎng)液中分離阿克拉希霉素Y。
7、阿克拉希霉素A的制造方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC 8539P)，用鹽酸調(diào)整培養(yǎng)液至pH4.6后，由細(xì)菌和培養(yǎng)液中分離阿克拉希霉素A。
全文摘要
本文公開了鏈霉菌的一種新菌株和一種通過培養(yǎng)它制造阿克拉希霉素A，B，Y和其糖苷配基的方法。 本發(fā)明的淡紫灰葉鏈霉菌DKRS(KCTC8539P)與僅能生產(chǎn)阿克拉希霉素A，B的親菌株12/3A不同，能夠以高產(chǎn)率產(chǎn)生阿克拉希霉素A，B，Y和糖苷配基。 此外，通過分別用乙酸緩沖液或鹽酸將淡紫灰葉鏈霉素DKRS的已培養(yǎng)過的培養(yǎng)基之pH中調(diào)節(jié)到4.4或4.6而選擇性地制造阿克拉希霉素A或Y是可能的。
文檔編號(hào)A61K31/655GK1104682SQ9410552
公開日1995年7月5日 申請(qǐng)日期1994年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月3日
發(fā)明者趙源太, 金完燮, 金明國, 樸真圭, 金學(xué)烈, 李尚基, A·G·道拉謝娃, T·B·帕尼奇納, L·A·薩布勞巴, L·M·諾比考巴, Y·E·巴托謝維奇 申請(qǐng)人:東國制藥株式會(huì)社, 權(quán)起范