專(zhuān)利名稱(chēng)：抗胃癌生物導(dǎo)向藥-免疫球蛋白y-植物毒蛋白a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物化學(xué)藥物領(lǐng)域。
胃癌是一種發(fā)病較高的惡性腫瘤，為了診斷和治療這種疾病，我們應(yīng)用分子遺傳學(xué)和癌基因遺傳學(xué)(Molecular genetics and Oncogenetics)的知識(shí)和方法進(jìn)行了探索。IgY在1979年，L.F.Mc Bee和O.J.Cotterill已有報(bào)道(J.Food.Sci，1979，44656)，1981年J.C.Jensenius發(fā)表了文章(J.lmmunol.Methods，1981，4663)，日本的Hajime Hatta等人對(duì)IgY進(jìn)行過(guò)研究(Agric.Biol.Chem，1990，542531-2535)，但沒(méi)有人以癌白蛋為抗原免疫得到抗癌抗體IgY。國(guó)內(nèi)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院王和等人在雞蛋卵黃中制備抗流感病毒抗體IgG(上海免疫學(xué)雜志，1987，7364-365)。
蓖麻毒(Ricin)和RicinA在1982，R.J.Youle年已有報(bào)道(J.Biol.Chem，1982，2571598-1601)，國(guó)內(nèi)我們尚未見(jiàn)到報(bào)道。
免疫毒的毒性性質(zhì)在1985年Ellen.S.Vitetta和J.W，Uhr報(bào)道過(guò)(Cell，1985，41653-654)。在Mehod Enzymology Vol，112有所報(bào)道。
我們的研究采用了兩類(lèi)蛋白結(jié)合的途徑，即選擇一種能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞而與正常細(xì)胞不反應(yīng)的抗體，另一種蛋白為毒蛋白，它能殺傷細(xì)胞，兩種蛋白結(jié)合形成具有特異性導(dǎo)向的治療腫瘤藥物。
抗原與抗體的選擇根據(jù)對(duì)Oncogenes的研究。認(rèn)為腫瘤細(xì)胞是兩種以上基因突變的結(jié)果，其中癌基因產(chǎn)生大量癌蛋白，以這種癌蛋白為抗原免疫所得到的抗體能夠特異性識(shí)別癌細(xì)胞。為此，我們選用了人胃的惡性腫瘤細(xì)胞，低分化粘液腺癌細(xì)胞(Human stomach mucoid adenocarcinoma)從中分離純化癌蛋白。
癌蛋白的純化
將培養(yǎng)的人胃癌MGC-80-3細(xì)胞懸于緩沖液A中(10mM Nacl，1.5mM Mgcl2，10mM Tris-Hcl(pH8.0)0.1mM PMSF，(苯甲基磺酰氟)0.1mM EDTA，超聲破碎細(xì)胞，加固體硫酸銨使破碎細(xì)胞成50%飽和度，拌攪30分鐘，在2000rpm離心20分鐘，沉淀溶于緩沖液B中(20mM Tris-Hcl，pH8.0，2%SDS，(硫酸十二烷基鈉)10mM EDTA，0.1%2-巰基乙醇)用水飽和酚抽提三次，酚相收集并在緩沖液B中(加0.25M蔗糖透析，使酚全部移除。溶液經(jīng)過(guò)Sephorose-CL-4B抗體柱親合層析，(用Tris-Hel pH8.0，1%NP40洗脫)，收集峰區(qū)。凝膠電泳分析，結(jié)果癌蛋白110KD，作為抗原，用來(lái)免疫。
抗體獲得IgY抗體來(lái)自免疫過(guò)的母雞所產(chǎn)卵的卵黃，這種適于保守性抗原分析研究，癌蛋白正是生物進(jìn)化上的一種保守性蛋白。IgY從卵黃中易于獲得，產(chǎn)量大，一只雞蛋可純化出50-100mg抗體IgY。這種抗體用于治療腫瘤是我們的發(fā)現(xiàn)。由于它可大量獲得，就為臨床治療提供了可能。
收取免疫后所產(chǎn)蛋的卵黃，用緩沖液C(0.1M Nacl，0.01% NaN3，0.01M磷酸鈉)稀釋(1∶1體積/體積)。稀釋后加PEG(聚乙二醇Mr.6000)，按100ml卵黃稀釋液加7克PEG，攪拌使PEG全部溶解，以12000rpm離心10分鐘，取上清液，以四層紗布過(guò)濾，加PEG于濾液中，使之成為12%濃度，溶解后再如上離心，取沉淀，溶于緩沖液C中，體積與原體積相同，如此操作重復(fù)三次，最后，沉淀溶于生理鹽水中，如較長(zhǎng)時(shí)間保存，需在生理鹽水中加25%甘油，0.02%NaN3，放-4℃保存。
Ricin是植物組織中的一種毒物，它有抑制蛋白的合成作用，它是一種以二硫鍵結(jié)合的異質(zhì)性雙體，由A.B兩條肽鍵組成，B鏈?zhǔn)侵参锬仡?lèi)的物質(zhì)與半乳糖的性質(zhì)相似，促使毒物結(jié)合到細(xì)胞膜上，A鏈?zhǔn)且环N酶性質(zhì)的肽鏈它結(jié)在核糖體上，抑制細(xì)胞蛋白合成，從而殺死細(xì)胞。我們選擇了篦麻毒蛋白這種毒物，以抗體IgY取代其B鏈，保留A鏈的殺傷作用。
取剝掉種皮的篦麻籽(Ricinus Commnnis Costor)以350克種子浸泡于5%乙酸1000ml中，在室溫下攪拌過(guò)夜，將浸泡物打漿，勻漿后補(bǔ)加1000ml5%乙酸，液體在3000rpm上離心20分鐘，將橙黃色液體過(guò)四層紗布后再用新華1號(hào)濾紙過(guò)濾，濾液加固體硫酸銨成80%飽和度，攪拌40分鐘以3000rpm離心30分鐘，沉淀溶于150ml雙蒸水，并在雙蒸水中透析20小時(shí)，得350ml暗黃色溶液。
溶液經(jīng)DEAE-Sephadex A50層析，篦麻毒不與層析劑結(jié)合，收集過(guò)柱液，加硫酸銨成80%飽和度，在4℃攪拌，如上述離心，收集沉淀溶雙蒸水，并于雙蒸水中透析48小時(shí)，再經(jīng)Sephadex G100層析，用緩沖液D洗脫(0.01M磷酸鈉，0.1M半乳糖)分步收集，篦麻毒峰區(qū)收集，用硫酸銨50%飽和度沉淀篦麻毒蛋白，沉淀溶于雙蒸水，并于雙蒸雙中透析，然后冰凍干燥得純化的Ricin(篦麻毒蛋白)。
取Ricin溶于緩沖液E(0.1M Tris-Hcl pH8.5，0.5M乳糖，5%乙-巰基乙醇)，在室溫(20-25℃)攪拌12小時(shí)，靜置10小時(shí)。經(jīng)DEAE-cellulose DE52層析，峰區(qū)在緩沖液F(0.01M乳糖，0.1%乙-巰基乙醇.5mM磷酸鈉(pH6.5)中，4℃透析一夜。產(chǎn)物為RicinA。再經(jīng)CM-sephaoles CM50層析，以0-0.15M Nacl緩沖液F梯度洗脫，峰區(qū)收集，得純RicinA。
IgY-RicinA偶聯(lián)抗體IgY與篦麻毒蛋白偶聯(lián)形成一種人工組建的雜交蛋白。要將兩種不同來(lái)源的蛋白多肽聯(lián)結(jié)起來(lái)，需要有一種雙功能作用的試劑，這種試劑可以阻止分子內(nèi)部交聯(lián)。特別是毒蛋白容易形成內(nèi)聚體，我們選用SPDP[N-Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionate)作為聯(lián)結(jié)劑，它為蛋白提供pyridyl二硫鍵基團(tuán)和thiol基因，使兩種蛋白結(jié)合形成二硫鍵結(jié)合的偶聯(lián)物。
這種偶聯(lián)物是以抗體取代篦麻毒蛋白的B鍵，增加了偶聯(lián)物的特異識(shí)別作用，連結(jié)后的毒蛋白可能形成硫脂類(lèi)物質(zhì)，使毒性減小。如果是與篦麻毒全毒(A.B鏈)聯(lián)結(jié)，則毒性大，所以我們只用A鏈。根據(jù)我們的研究認(rèn)為IgY與RicinA有較好的親合性，所以它能使RicinA很好的發(fā)揮作用。對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力強(qiáng)。
(1)按20mM濃度將SPDP溶于無(wú)水乙醇中。
(2)用PBS(0.15M Nacl，0.01M磷酸鈉)將IgY稀釋成10mg/ml。
(3)750ml IgY加1ml SPDP(7.5g IgY6.25mg SPDP)在室溫(20-25℃)攪拌30分鐘。
(4)將RicinA調(diào)整成每毫升10mg，加2-巰基乙醇成0.1%。在室溫?cái)嚢?0分鐘。
(5)在冰浴中將處理的RicinA緩慢加入到處理的IgY中(按IgY∶RicinA＝2∶1)，混合物溫和攪拌，并在冰浴中靜置5分鐘，然后在20℃-25℃放置一夜(20小時(shí))。
(6)以Sephacryl S-200層析分離IgY-RicinA，峰區(qū)收集，濃縮。成為成品抗胃癌抗體毒蛋白導(dǎo)向藥物。
IgY抗體對(duì)細(xì)胞有選擇性識(shí)別作用，這一特征為該抗體能夠治療腫瘤提供了重要導(dǎo)向作用，在培養(yǎng)的細(xì)胞中IgY熒光免疫測(cè)定，只能與胃癌細(xì)胞反應(yīng)。與其他細(xì)胞無(wú)交叉免疫。從病人腫瘤組織免疫熒光測(cè)定證明IgY能夠識(shí)別胃癌細(xì)胞，與正常組織細(xì)胞不反應(yīng)。放射同位素169Yb標(biāo)記IgY抗體，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)追蹤測(cè)定，結(jié)果表明IgY主要向腫瘤組織集中，其他器官含量甚微。同時(shí)，我們比較了抗胃癌單克隆抗體與IgY抗體識(shí)別作用。用ABC染色法比較結(jié)果IgY對(duì)胃癌組織陽(yáng)性率為87.1%?？刮赴﹩慰寺】贵wMG9對(duì)胃癌組織陽(yáng)性率為80.6%。兩者無(wú)顯著差異，說(shuō)明IgY與單克隆抗體一釋具有特異性識(shí)別作用。
IgY-RicinA偶聯(lián)物對(duì)胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成具有強(qiáng)烈的抑制作用，在每毫升培養(yǎng)物中含10微克IgY-RicinA，蛋白質(zhì)完全不能合成，細(xì)胞死亡。在細(xì)胞培養(yǎng)中每毫升培養(yǎng)液含0.1微克IgY-RicinA，胃癌細(xì)胞生存率只有0.1%，其他細(xì)胞生存率則在75%以上。IgY-RicinA對(duì)胃癌細(xì)胞反應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)觀察表明胃癌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)融解破壞、核膜消失、細(xì)胞核被破壞，使細(xì)胞崩潰。
IgY-RicinA對(duì)小鼠試驗(yàn)?zāi)[瘤有良好的治療作用。腫瘤治愈率為83.3%以上。
IgY-RicinA治療胃癌等腫瘤病人的臨床研究。從1989年2月到1992年3月共治療28例。這些病人經(jīng)病理檢查破診為胃癌25人，食道癌1人，喉癌1人，肝癌1人，為晚期病人，有些人因轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)不能再作手術(shù)，有的為手術(shù)后繼續(xù)治療的。這些病人中2年生存期占52.3%在死亡病例中能存活半年的有6人，半年到一年者3名，近2年者1名。證明該生物導(dǎo)向性藥物對(duì)治療腫瘤有很大潛力。
權(quán)利要求
1.一種抗胃癌生物導(dǎo)向藥的合成其特征是合成步驟包括癌蛋白的純化，抗體獲得，RicinA的純化，IgY-RicinA的偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)方法，其特征是將培養(yǎng)的人胃癌MGC-80-3細(xì)胞懸于緩沖液A中(10mM NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl(pH8.0)0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，0.1mMEDTA)超聲破碎，加固體硫酸銨成50%飽和度，攪拌30分鐘在2000rpm離心20分鐘，沉淀溶于緩沖液B中(20mM Tris-HClpH8.0，2%SDS(硫酸十二烷基鈉)10mMEDTA，0.1%2-巰基乙醇)，用水飽和酚抽提三次，收集酚相在緩沖液B中(加0.25-M蔗糖)透析，溶液經(jīng)過(guò)Sephorase-cL-4B層析，(洗脫液Tris-HClpH8.0，1%NP40)，收集峰區(qū)，凝膠電泳分析癌蛋白110KD用于免疫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)方法，其特征是將免疫雞蛋黃用緩沖液C(0.1MNaCl，0.01%NaN3，0.01M磷酸鈉)稀釋?zhuān)♂尯蠹覲EG(聚乙二醇，Mr6000)，100ml卵黃稀釋液加7gPEG，12000rpm離心10分鐘，清液過(guò)濾加PEG成12%濃度，溶介后再如上離心取沉淀，溶于緩沖液C中。重復(fù)三次，最后沉淀溶于生理鹽水中，如較長(zhǎng)時(shí)間保存，在生理鹽水中加25%甘油，0.02%NaN3-4℃保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)方法，其特征是取剝掉種皮的蓖麻籽350克浸泡于5%乙酸1000ml中，室溫下攪拌過(guò)夜，打漿后補(bǔ)加1000ml5%乙酸在3000rpm上離心20分鐘，過(guò)濾，濾液加固體硫酸銨成80%飽和度攪拌40分鐘，3000rpm離心30分鐘，沉淀溶于150ml雙蒸水，透析20小時(shí)，溶液經(jīng)DEAE-Sephadex A50層析，收集層析液，加硫酸銨成80%飽和度，在4℃攪拌，離心將沉淀溶于雙蒸水并透析48小時(shí)，再經(jīng)Sephadex G100層析，用緩沖液D(0.01M磷酸鈉，0.1M半乳糖)洗脫，分步收集，用硫酸銨50%飽和度沉淀蓖麻毒蛋白(Ricin)，溶于雙蒸水透析，冰凍干燥，得純化的Ricin，取Ricin溶于緩沖液E(0.1MTris-HCl pH8.5，0.5M乳糖，5%2-巰基乙醇)，室溫(20-25℃)攪拌12小時(shí)，靜置10小時(shí)，經(jīng)DEAE-Cellulose DE52層析，峰區(qū)在緩沖液F中(0.01M乳糖，0.1%2-巰基乙醇，5mM磷酸鈉(pH6.5℃)4℃透析，0-0.15M NaCl，緩沖液F梯度洗脫，峰區(qū)收集得純RicinA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)方法其特征是IgY-Ricin A偶聯(lián)選用SPDP(N-Succinimidyl-3-(2 pyridyldithio)propionate)為聯(lián)結(jié)劑，按20mM濃度將SPDP溶于無(wú)水乙醇，用PBS(0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉)將IgY稀釋成10mg/ml，750ml IgY加1ml SPDP在室溫?cái)嚢?0分鐘，將Ricin A每10mg/ml加2-巰基乙醇成0.1%，室溫?cái)嚢?0分鐘，在冰浴中將處理的Ricin A緩慢加到處理的IgY中(IgY∶Ricin A＝2∶1)，溫和攪拌，靜置5分鐘在20-25℃放置20小時(shí)，以Sephaery S-200層析分離IgY-Ricin A，峰區(qū)收集，濃縮，得成品抗胃癌導(dǎo)向藥物。
全文摘要
本發(fā)明應(yīng)用分子遺傳學(xué)和癌基因遺傳學(xué)的知識(shí)和方法合成了抗胃癌生物導(dǎo)向藥-IgY-RicinA，并應(yīng)用到治療胃癌病人的臨床研究，已治療28例，證明該生物導(dǎo)向藥對(duì)治療腫瘤有很大潛力。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1085910SQ92111449
公開(kāi)日1994年4月27日 申請(qǐng)日期1992年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月22日
發(fā)明者劉連瑞, 王恢鵬, 楊濤蘭, 馮尚, 馮之凡 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所