本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料，尤其涉及一種抑制骨與軟組織感染的納米粒復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前骨不連、骨感染等骨科難治性疾病相關(guān)研究較為局限，缺乏細(xì)胞間、分子間相互作用的深入研究，導(dǎo)致臨床診療手段匱乏。應(yīng)用生物信息學(xué)多組學(xué)技術(shù)有助于闡明疾病狀態(tài)下骨微環(huán)境中細(xì)胞、信號(hào)及分子間互作網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)大數(shù)據(jù)分析技術(shù)篩選出具有早期診斷、靶向治療潛力的關(guān)鍵靶標(biāo)，為骨科難病的臨床診療提供潛在手段。

2、龍膽苦苷為龍膽科植物的環(huán)烯醚萜苷類成分。龍膽苦苷具有抗炎作用。龍膽苦苷來(lái)源于三花龍膽（gentiana?triflora?pa11）、紅花龍膽（gentiana?rho-dantha?franch）、龍膽科植物條葉龍膽（gentiana?manshurica?kitag）或是堅(jiān)龍膽（gentiana?rigescensfranch）等的干燥根和根莖。龍膽苦苷（scabrans?g5）別名龍膽苦甙，分子式為c16h20o9，分子量為356.32，化學(xué)名稱為5-ethenyl-6-(β-d-glucopyranosyloxy)-5,6-dihydro-1h,3h-pyrano[3,4-c]pyran-1-one,屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物,易溶解于甲醇、水及乙醇等溶劑?，F(xiàn)有研究表明龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。龍膽苦苷對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹和蛋清致大鼠足趾腫脹急性炎癥模型及大鼠肉芽腫慢性炎癥模型均有一定的抑制作用；對(duì)熱和化學(xué)刺激引起的疼痛，龍膽苦苷能提高痛閾值。

3、甘露糖，是一種有機(jī)化合物，分子式為c6h12o6，分子量為180.156，無(wú)色或白色結(jié)晶粉末。是一種糖類，在人體代謝過(guò)程中，尤其在特定蛋白的糖基化過(guò)程中起到重要作用。甘露糖，唯一用于在臨床上的糖質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，廣泛分布于體液和組織中，尤其是在神經(jīng)、皮膚、睪丸、視網(wǎng)膜、肝和腸。其直接被利用合成糖蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)。許多疾病正是由于缺乏甘露糖糖化作用中的酵素而導(dǎo)致的。調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。巨噬細(xì)胞表面有4種接受器可以捕捉抗原，都有甘露糖成分。增加傷口愈合?？拱l(fā)炎效果。抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，增加癌癥存活率。

4、透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺之間由β-1,3-配糖鍵相連，雙糖單位之間由β-1,4-配糖鍵相連。雙糖單位可達(dá)25000之多。在體內(nèi)透明質(zhì)酸的分子量從1千到2千萬(wàn)道爾頓。透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。

5、絲膠蛋白是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子蛋白。它主要是由蠶的絲腺分泌，是構(gòu)成蠶繭的主要蛋白之一。絲膠蛋白因其良好的水溶性、促細(xì)胞黏附和增殖活性、更低的免疫原性，以及獨(dú)特的原位熒光性、抗氧化活性和酪氨酸酶抑制作用等性能，而被廣泛應(yīng)用在織物后整理涂層、化妝品添加劑，以及食品、醫(yī)藥、功能性生物材料。絲膠蛋白有皮膚消炎的作用，水溶性絲膠及其水解物對(duì)皮膚病有明顯的療效。絲膠蛋白也是治療皮膚疾病的良好消炎劑。當(dāng)絲膠蛋白與酶或酸水解獲得的酵母抽提物混合后也可成為一種新的皮膚外用藥，也能促進(jìn)真皮纖維細(xì)胞的膠原生產(chǎn),有效防治或減緩各種皮膚病癥。

6、內(nèi)溶素(endolysin)是由噬菌體編碼的肽聚糖水解酶。其在噬菌體增殖裂解周期中的基因表達(dá)末期中被合成，并通過(guò)降解細(xì)菌肽聚糖來(lái)調(diào)節(jié)從被感染細(xì)胞中釋放后代病毒體。內(nèi)溶素蛋白通常由兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：氮末端催化結(jié)構(gòu)域和碳末端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)酶的作用位點(diǎn)專一性，可將內(nèi)溶素蛋白劃分為四類：(1)n-乙酰氨基葡萄糖苷酶，切割肽聚糖中的糖基；(2)n-乙酰胞壁質(zhì)酶(溶菌酶或胞壁質(zhì)酶)，作用于n-乙酰胞壁酸和n-乙酰-d-葡糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵；(3)n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶(nam-酰胺酶)，切割n-乙酰胞壁酸和l-丙氨酸之間的酰胺鍵；(4)內(nèi)肽酶，切割肽鏈之間的連接。內(nèi)溶素可作為生物抗菌劑，具有很低的細(xì)菌抗性發(fā)生率；內(nèi)溶素具有菌種特異性的裂解活性，不會(huì)影響宿主周圍其它菌種；同時(shí)，內(nèi)溶素還具有很高的酶活性，使得細(xì)菌可在數(shù)分鐘甚至在數(shù)秒內(nèi)被裂解。但目前尚未有將靶向s100a4位點(diǎn)的龍膽苦苷與甘露糖和透明質(zhì)酸、內(nèi)溶素的聯(lián)合使用，并通過(guò)建立脂質(zhì)體納米載藥體系，將其用于抑制骨與軟組織感染的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種抑制骨與軟組織感染的納米粒復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)ai分子對(duì)接技術(shù)，基于與骨感染密切相關(guān)的靶點(diǎn)s100a4，設(shè)計(jì)了靶向s100a4位點(diǎn)的藥物龍膽苦苷。通過(guò)藥物遞送技術(shù)自組裝法，將龍膽苦苷負(fù)載到絲膠蛋白+ha透明質(zhì)酸+脂質(zhì)體納米載藥體系中。龍膽苦苷可改善減輕炎癥反應(yīng)增加傷口愈合等。納米遞送系統(tǒng)的使用，使得負(fù)載龍膽苦苷的納米粒具有更好穩(wěn)定性和生物利用度，龍膽苦苷可改善減輕炎癥反應(yīng)和增加傷口愈合的效果。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種抑制骨與軟組織感染的納米粒復(fù)合物，所述納米粒復(fù)合物為龍膽苦苷+絲膠蛋白+透明質(zhì)酸+內(nèi)溶素脂質(zhì)體納米粒子。

4、第二方面，本發(fā)明提供了一種抑制骨與軟組織感染的納米粒復(fù)合物的制備方法包括以下步驟：

5、步驟1：將1?-1000mg/ml透明質(zhì)酸-乙醇溶液與1?-2000?mg/ml脂質(zhì)體-乙醇溶液以1：（1-60）的體積比制成混合液??；

6、步驟2：將1-10?mg/ml?絲膠蛋白-乙醇溶液加入混合液ⅰ中制成混合液ⅱ，所述絲膠蛋白-乙醇溶液與所述混合液ⅰ的體積比為1：（1-25）；

7、步驟3：在混合液ⅱ中加入1-5?mg/ml龍膽苦苷-乙醇溶液制成混合液ⅲ，所述混合液ⅱ與所述龍膽苦苷-乙醇溶液的體積比為5:（1-20）；

8、步驟4：在攪拌過(guò)程中將所述混合液ⅲ以微流控芯片滴加到純水體系中，制成混合液iv；

9、步驟5：將所述混合液iv在純水中連續(xù)透析；將透析完成后的溶液離心，除去沉淀物；接著過(guò)脂質(zhì)體推進(jìn)器，所得上清液即龍膽苦苷+絲膠蛋白+透明質(zhì)酸脂質(zhì)體納米粒子溶液；

10、步驟6：將內(nèi)溶素溶于步驟5所述龍膽苦苷+絲膠蛋白+透明質(zhì)酸脂質(zhì)體納米粒子溶液，得到龍膽苦苷+絲膠蛋白+透明質(zhì)酸+內(nèi)溶素脂質(zhì)體納米粒子溶液。

11、優(yōu)選的，所述步驟1中的脂質(zhì)體為大豆卵磷脂（l-α-磷脂酰膽堿，pc）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dppc）、二棕櫚?；字Ｒ掖及罚╠ppe）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（dspc）、白芨多糖、甘草酸、透明質(zhì)酸、絲膠蛋白中的任意一種或多種。

12、優(yōu)選的，透明質(zhì)酸-乙醇溶液與脂質(zhì)體-乙醇溶液的混合體積比為1：5。

13、優(yōu)選的，所述步驟2中絲膠蛋白-乙醇溶液與混合液ⅰ的體積比為1：1。

14、優(yōu)選的，所述步驟3中混合液ⅱ與龍膽苦苷-乙醇溶液的體積比為1：1。

15、優(yōu)選的，所述步驟4中，混合液ⅲ的過(guò)微流控芯片的速度為10?s/滴；混合液ⅳ制成后還包括磁力攪拌分散、繼續(xù)攪拌以及超聲處理的過(guò)程；所述磁力攪拌分散在室溫下進(jìn)行；所述繼續(xù)攪拌的時(shí)間為0.5-1.0小時(shí)；所述超聲處理為在36-38℃水浴下150w-300w探頭式超聲，所述超聲處理的時(shí)間為5-20min。

16、優(yōu)選的，步驟5中，將所述混合液iv在純水中連續(xù)透析8-12h，期間多次換液；透析完成后的溶液2500-3500r/min，離心5-10?min除去沉淀物；接著過(guò)100kda脂質(zhì)體推進(jìn)器，連續(xù)透析使用的是分子截留量為10-14kda的透析袋，所述連續(xù)透析的時(shí)間為8-12h。

17、優(yōu)選的，所述步驟6之后還包括將ph調(diào)至6.5-7.5以及加入1，2-己二醇的步驟。調(diào)節(jié)ph使用的是3%的鹽酸，1，2-己二醇加入后其終濃度為0.05-0.10mg/ml。

18、第三方面，本發(fā)明還提供了所述納米粒復(fù)合物在制備抑制骨與軟組織感染的藥物或其他醫(yī)用材料中的應(yīng)用。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：

20、本發(fā)明通過(guò)ai分子對(duì)接及納米藥物遞送技術(shù)，基于與骨感染密切相關(guān)的靶點(diǎn)s100a4，設(shè)計(jì)了靶向s100a4位點(diǎn)的龍膽苦苷+內(nèi)溶素共遞送納米載藥體系。龍膽苦苷對(duì)急性炎癥還是慢性炎癥具有抑制作用，減輕炎癥反應(yīng)。龍膽苦苷可促進(jìn)肌細(xì)胞增殖、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)創(chuàng)面的愈合并具有增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)、清除氧自由基的作用。內(nèi)溶素有較強(qiáng)的抑菌作用。而且本發(fā)明中靶向納米粒復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用時(shí)的操作步驟都較為簡(jiǎn)單，也非常適于減輕骨和軟組織感染及炎癥的納米藥物的開(kāi)發(fā)、推廣和應(yīng)用等。