本技術涉及抗腫瘤藥物領域，尤其涉及一種引發(fā)腫瘤細胞銅死亡的納米藥物及其制備方法。

背景技術：

1、現有的乳腺癌治療方法主要包括手術、放療和化療，但這些方法均存在治療不徹底和易復發(fā)等問題。據統計，約90％的與乳腺癌相關死亡由腫瘤轉移導致。免疫治療是以天然免疫反應為基礎來對抗腫瘤轉移的。雖然近年來免疫治療革新了傳統癌癥治療方式，但是免疫治療并非對所有患者都是有效的，這主要是受到免疫激活不足和腫瘤免疫抑制性微環(huán)境的限制。免疫原性細胞死亡(icd)指的是死亡的腫瘤細胞通過釋放鈣網蛋白(crt)、高遷移率族蛋白b1(hmgb1)以及腺嘌呤核苷三磷酸(atp)等損傷分子模式，來促進樹突狀細胞(dcs)的成熟，并且改善細胞毒性t淋巴細胞在腫瘤內的浸潤，從而有效地增強免疫治療的敏感性。然而，因免疫抑制性腫瘤微環(huán)境顯著限制了免疫治療的效果，因此免疫抑制性腫瘤微環(huán)境也是免疫治療的一個重大挑戰(zhàn)。腫瘤細胞通常通過有氧糖酵解進行能量代謝，而腫瘤細胞糖酵解所產生的乳酸會在腫瘤微環(huán)境中蓄積并形成酸性環(huán)境，而酸性環(huán)境會導致機體具備免疫耐受以及加快腫瘤生長；現階段可以通過碳酸鈣中和反應和乳酸氧化酶催化反應等方法來改善腫瘤的酸性微環(huán)境，但是這些方法的作用時間較短且所使用的藥物容易失去活性。因此，開發(fā)能夠精準誘導免疫原性細胞死亡(icd)并切實針對乳酸代謝進行調控的創(chuàng)新策略，對于增強腫瘤的免疫原性、扭轉免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，進而提升免疫治療的效果，具有至關重要的意義。

2、銅死亡作為一種新型的程序性細胞死亡模式，其顯著特征是銅依賴的線粒體功能障礙；銅死亡主要表現為細胞內銅過量、酯酰化線粒體蛋白聚集以及鐵硫簇蛋白的降解，最終導致蛋白毒性應激和細胞死亡。并且現有研究表明銅死亡能夠激活腫瘤細胞釋放損傷分子模式和腫瘤相關抗原，進而引發(fā)icd，從而將免疫抑制的“冷”腫瘤轉變?yōu)槊庖唔憫摹盁帷蹦[瘤。盡管銅死亡具有潛力，但是其治療效果顯著受限于腫瘤細胞內固有的呼吸代謝途徑和銅穩(wěn)態(tài)機制。銅死亡與線粒體呼吸密切相關，而腫瘤細胞主要通過有氧糖酵解產生atp以滿足其高能需求，這顯著降低了它們對銅死亡的敏感性。此外，腫瘤細胞內銅水平會受到嚴格調控，具體調控方式包括促使銅流入轉運蛋白處于缺乏狀態(tài)以及促使基于cu-atp酶的銅出口蛋白處于過表達狀態(tài)。此外過量內源性谷胱甘肽(gsh)迅速螯合自由銅離子從而調控腫瘤細胞內銅水平，這也是限制銅死亡的另一個重要因素。因此，開發(fā)一種能夠調節(jié)呼吸代謝并破壞銅穩(wěn)態(tài)的銅載體，以促進銅死亡的顯著誘導變得極為重要。

技術實現思路

1、本技術提供了一種引發(fā)腫瘤細胞銅死亡的納米藥物及其制備方法，以解決如下技術問題：如何在增加腫瘤細胞內cu2+濃度的同時改變腫瘤細胞的呼吸代謝方式。

2、第一方面，本技術提供了一種引發(fā)腫瘤細胞銅死亡的納米藥物，所述納米藥物為核殼結構，核心為cu2+摻雜的沸石咪唑骨架-8以及復合藥物，外殼為透明質酸；其中，所述復合藥物包括血紅蛋白和含有線粒體靶向基團的二氯乙酸。

3、可選的，所述血紅蛋白的重量m1和含有線粒體靶向基團的所述二氯乙酸的重量m2滿足關系式：m1:m2≥2:1。

4、可選的，所述復合藥物的總重量m3和所述納米藥物的總重量m4滿足關系式：m3:m4＝(3.6～4.4):(21.2～25.6)。

5、可選的，所述透明質酸的厚度為8.6nm～12.8nm。

6、可選的，所述cu2+摻雜的沸石咪唑骨架-8的重量m5和所述納米藥物的總重量m4滿足關系式：m5:m4＝(15.5～18.5):(21.2～25.6)；和/或

7、所述沸石咪唑骨架-8的cu2+摻雜量為0.33mg～0.41mg。

8、可選的，所述納米藥物的平均粒徑為150nm～200nm。

9、第二方面，本技術提供了一種制備第一方面所述的納米藥物的方法，所述方法包括：

10、將2-甲基咪唑溶解于去離子水中，得到2-甲基咪唑溶液；

11、將醋酸銅、醋酸鋅、血紅蛋白和帶有線粒體靶向基團的二氯乙酸進行混合，后向混合物中加入去離子水，得到原料混合液；

12、將所述原料混合液和所述2-甲基咪唑溶液進行混合，以使所述醋酸銅、所述醋酸鋅、所述血紅蛋白、所述二氯乙酸和所述2-甲基咪唑溶液進行封裝反應，得到納米藥物核心；

13、在透明質酸的水溶液中將所述納米藥物核心進行分散，以使所述透明質酸包覆在所述納米藥物核心的表面，得到納米藥物。

14、可選的，所述封裝反應的溫度為10℃～40℃，所述封裝反應的時間≥6h。

15、可選的，所述分散的方式包括超聲分散，所述超聲分散的頻率為15khz～25khz，所述超聲分散的時間≥15min。

16、第三方面，本技術提供了一種腫瘤殺傷和免疫激活的藥物，所述藥物包括第一方面所述的納米藥物。

17、本技術實施例提供的上述技術方案與現有技術相比具有如下優(yōu)點：

18、本技術實施例提供的一種引發(fā)腫瘤細胞銅死亡的納米藥物，該納米藥物以cu2+摻雜的沸石咪唑骨架-8為載體，再封裝包括血紅蛋白(oxy-hb)和含有線粒體靶向基團的二氯乙酸(mito-dca)的復合藥物，最后以透明質酸(ha)作為外殼，利用ha和細胞膜表面的cd44相互作用來介導腫瘤細胞對納米藥物的選擇性內吞，使得納米藥物可以經過腫瘤細胞內ph響應性解體，此時納米藥物的cu2+摻雜的沸石咪唑骨架-8會釋放出cu2+，而釋放出的cu2+在轉變?yōu)閏u+的同時耗盡腫瘤細胞內源性谷胱甘肽(gsh)，以有效地催化腫瘤細胞內過氧化氫的類芬頓反應進程而轉化為羥基自由基(·oh)，從而阻礙銅-atp酶介導的銅外流，以使腫瘤細胞內銅水平超載；另外納米藥物的oxy-hb還會輸送氧氣，配合mito-dca可以促使腫瘤細胞的代謝方式從有氧糖酵解轉變?yōu)榫€粒體氧化磷酸化(oxphos)，從而抑制腫瘤細胞的丙酮酸脫氫酶激酶(pdk)的功能；該納米藥物通過上述gsh耗竭、銅穩(wěn)態(tài)破壞以及呼吸代謝方式轉變這三種策略，可以導致腫瘤細胞內二氫硫辛酸s-乙酰轉移酶(dlat)的寡聚化及脂酰合成酶(lias)處于喪失的狀態(tài)，從而最終提高腫瘤細胞對銅死亡的敏感度，而提高了銅死亡敏感度的腫瘤細胞會激活免疫細胞死亡(icd)，引發(fā)基于釋放腫瘤相關抗原(taas)和損傷相關分子模式(damps)的級聯免疫反應，以促進樹突狀細胞(dcs)的成熟和cd8+t細胞的浸潤；另外腫瘤細胞內糖酵解向著oxphos的轉換會有效降低腫瘤細胞的乳酸水平，以重新編程富含乳酸的免疫抑制腫瘤微環(huán)境(tme)，通過促進腫瘤相關巨噬細胞(tams)從免疫抑制狀態(tài)的m2表型向免疫刺激的m1表型進行轉變；此外腫瘤細胞在銅死亡的同時還會干擾乳酸的代謝過程，以分別增強腫瘤細胞的免疫原性并逆轉其免疫抑制tme，從而有效地激活機體針對腫瘤發(fā)展和轉移的系統性免疫。因此該納米藥物通過增加腫瘤細胞內cu2+濃度以及改變腫瘤細胞的呼吸代謝方式來激活級聯增強反應，以提高腫瘤細胞對銅死亡的敏感度并增強免疫療法，極大地推動了銅死亡驅動的免疫療法的持續(xù)發(fā)展。