本發(fā)明屬于生物納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)的制備方法及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、普魯士藍(lán)屬于金屬有機(jī)框架物，由兩個八面體配位的鐵中心(三價鐵和二價鐵)組成，三價鐵離子連接在氰化物的氮原子末端，二價鐵離子由氰化物的碳原子串接。普魯士藍(lán)是在1706年由disbach在柏林首次合成，自合成以來，得到了廣泛的應(yīng)用，包括用作染料和在生物樣品中進(jìn)行鐵染色。普魯士藍(lán)具有良好的生物相容性和安全性，早在2003年普魯士藍(lán)就被美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)用于放射性元素銫和鉈的解毒劑，目前已被批準(zhǔn)為人類使用的安全性良好的材料，并被列入世界衛(wèi)生組織《基本藥物清單》。普魯士藍(lán)納米顆粒具有多酶活性，包括類過氧化氫酶(cat)、類過氧化物酶(pod)和類過氧化物歧化酶(sod)等，能有效清除生物體內(nèi)活性氧(ros)，在治療由ros引起的疾病方面表現(xiàn)出巨大潛力。隨著時間的推移，普魯士藍(lán)納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的特性，如成像功能、較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力、多酶活性、高比表面積、表面可修飾性、可控藥物釋放、生物相容性和生物降解性以及良好的穩(wěn)定性，因此常常被開發(fā)用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括生物成像、腫瘤治療、炎癥治療、心血管疾病治療等。

2、表面包覆物在維持普魯士藍(lán)納米顆粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及性能至關(guān)重要，包括降低普魯士藍(lán)納米顆粒表面能，抑制團(tuán)聚，改善溶解性，能夠進(jìn)一步提高其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。常用的包覆物有有機(jī)物聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和無機(jī)物檸檬酸，除此之外，還有殼聚糖(cs)、透明質(zhì)酸(ha)、聚乙烯亞胺(pei)、草酸和聚二烯基二甲基氯化銨(pdda)等。然而這些包覆物并不能有效維持普魯士藍(lán)的穩(wěn)定性和安全性，并賦予普魯士藍(lán)納米顆粒新的活性。

3、采用無毒性的多糖作為包覆物展現(xiàn)出更多優(yōu)勢，比如降低普魯士藍(lán)納米顆粒的潛在毒性，提高穩(wěn)定性、生物相容性，還能通過多糖與其他生物活性物質(zhì)結(jié)合，賦予普魯士藍(lán)納米顆粒新的功能。聚葡萄糖山梨醇羧甲基醚(psc)是一種葡聚糖，是臨床上用于缺鐵性貧血治療的靜脈注射補鐵劑ferumoxytol的表面包覆物。與其它靜脈補鐵劑相比，ferumoxytol補鐵最有效且發(fā)生的不良反應(yīng)最小，具有非常好的生物相容性與安全性。這得益于ferumoxytol結(jié)構(gòu)中的psc中富含羧基，能與超順磁性氧化鐵納米顆粒中的鐵離子發(fā)生配位作用，從而提高了無機(jī)納米顆粒的穩(wěn)定性和生物相容性。除此之外，psc結(jié)構(gòu)中的半縮醛羥基具有抗氧化應(yīng)激的作用，能夠清除ros。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種使用psc作為保護(hù)劑制備psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒的新方法，并將其應(yīng)用于與ros產(chǎn)生和炎癥浸潤相關(guān)的心肌缺血再灌注損傷的治療。本發(fā)明制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒有效解決目前普魯士藍(lán)納米顆粒存在的安全性和穩(wěn)定性問題，以及提高普魯士藍(lán)納米顆粒的生物活性。

2、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)的制備方法，該方法使用雙前驅(qū)體的制備方法，包括以下步驟：

3、(1)將psc與前驅(qū)體1溶于溶液中形成混合液a；

4、(2)將psc與前驅(qū)體2溶于溶液中形成混合液b；

5、(3)將所述的混合液b在機(jī)械攪拌條件下滴加到混合液a中，得到混合反應(yīng)液；

6、(4)將所述的混合反應(yīng)液在攪拌條件下水浴加熱進(jìn)行反應(yīng)生成產(chǎn)物；

7、(5)將所述產(chǎn)物進(jìn)行透析、超濾管離心超濾、濃縮、冷凍干燥，得到psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)；

8、其中，步驟(1)中所述前驅(qū)體1為氯化鐵，硫酸鐵或硝酸鐵中的一種；步驟(2)中所述前驅(qū)體2為亞鐵氰化鉀、亞鐵氰化銨或亞鐵氰化鈉中的一種

9、其中，所述psc與前驅(qū)體1的摩爾比為10:1-1:10，所述psc與前驅(qū)體2的摩爾比為10:1-1:10，所述前驅(qū)體1與前驅(qū)體2的摩爾比為10:1-1:10。

10、其中，所述步驟(1)和(2)中的溶液為去離子水，所述前驅(qū)體1的物質(zhì)的量為0.01-1mmol，所述前驅(qū)體2的物質(zhì)的量為0.01-1mmol。

11、作為優(yōu)選，所述形成混合溶液a的體積為5-50ml，形成的混合液b的體積為5-50ml。

12、其中，步驟(3)所述滴加速率為0.1-10ml/min，機(jī)械攪拌速率為100-600r/min。

13、作為優(yōu)選，所述混合反應(yīng)溶液的體積為10-100ml。

14、其中，步驟(4)中所述水浴加熱溫度為40-100℃、反應(yīng)時間為0.5-10h，機(jī)械攪拌速率為100-600r/min。

15、其中，步驟(5)所述透析所用的透析袋截留分子量為5-100kd，超濾所用超濾管的截留分子量為10-50kd，超濾時離心速率為1000-6000r/min，離心溫度為3-10℃。

16、作為優(yōu)選，本發(fā)明的制備方法包括如下步驟：

17、(1)psc與前驅(qū)體1溶于去離子水中，形成混合液a；

18、(2)psc與前驅(qū)體2溶于去離子水中，形成混合液b；

19、(3)混合液b使用注射泵滴加到混合液a中，一邊滴加一邊進(jìn)行機(jī)械攪拌，得到混合反應(yīng)液；

20、(4)混合反應(yīng)液在水浴加熱、機(jī)械攪拌的條件下進(jìn)行反應(yīng)生成產(chǎn)物；

21、(5)產(chǎn)物進(jìn)行透析、超濾管離心超濾、濃縮、冷凍干燥，即得。

22、其中，步驟1中所述的前驅(qū)體1為氯化鐵，硫酸鐵或硝酸鐵中的一種，其物質(zhì)的量為0.01-1mmol，優(yōu)選0.2-0.5mmol；psc與前驅(qū)體1的摩爾比為1:1-1:10，優(yōu)選1:2-1:6；形成混合溶液a的體積為5-50ml，優(yōu)選10-30ml。

23、其中，步驟2中所述的前驅(qū)體2為水溶性良好的亞鐵氰化物，包括亞鐵氰化鉀、亞鐵氫化銨或亞鐵氰化鈉中的一種；前驅(qū)體2的物質(zhì)的量為0.01-1mmol，優(yōu)選0.2-0.5mmol；psc與前驅(qū)體1的摩爾比為1:1-1:10，優(yōu)選1:2-1:6；形成混合溶液a的體積為5-50ml，優(yōu)選10-30ml。

24、其中，步驟3中所述的混合溶液a和混合溶液b需完全溶解，溶液澄清；注射泵滴加速率為0.1-10ml/min，優(yōu)選1-5ml/min；機(jī)械攪拌速率為100-600r/min，優(yōu)選200-500r/min；混合反應(yīng)溶液的體積為10-100ml，優(yōu)選20-60ml。

25、其中，步驟4中所述的水浴加熱的條件為40-100℃，優(yōu)選60-90℃；機(jī)械攪拌速率為100-600r/min，優(yōu)選200-500r/min；水浴加熱反應(yīng)時間為0.5-10h，優(yōu)選2-6小時。

26、其中，步驟5中所述的透析所用的透析袋截留分子量為10-100kd，優(yōu)選100kd，透析時間為72小時；超濾所用超濾管的截留分子量為10-50kd，優(yōu)選20-40kd；超濾時離心速率為1000-6000r/min，優(yōu)選3000-5000r/min，離心溫度為3-10℃，優(yōu)選4℃，冷凍干燥48小時即得。

27、本發(fā)明所述的制備方法成功制備了均一穩(wěn)定的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)。

28、本發(fā)明所述的制備方法所制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)在制備清除生物體內(nèi)ros以及的抗炎的試劑或者藥物中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明所述的制備方法所制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)在制備通過靜脈注射被動靶向于受損心肌以及通過靜脈注射用于心肌缺血再灌注損傷治療的藥物和試劑中。

30、本發(fā)明所述的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)具有更高的類過氧化物歧化酶(sod)的活性，

31、本發(fā)明所述的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)能有效清除生物體內(nèi)活性氧(ros)，并起到良好抗炎效果。

32、本發(fā)明所述的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)可以通過靜脈注射被動靶向于受損心肌。

33、本發(fā)明所述的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)可以通過靜脈注射用于心肌缺血再灌注損傷的治療。

34、本發(fā)明采用雙前驅(qū)體合成法得到psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)，該方法操作簡單，易于工業(yè)放大生產(chǎn)，能夠在較短時間內(nèi)獲得較高質(zhì)量，表面易于功能化修飾的普魯士藍(lán)納米顆粒。采用本發(fā)明制備得到的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒尺寸均一穩(wěn)定，多分散系數(shù)小，具有類過氧化氫酶、過氧化物酶和過氧化物歧化酶活性，其中類過氧化物歧化酶的酶活性比現(xiàn)有制備的pvp包覆的極小尺寸的高性能普魯士藍(lán)納米顆粒更高。采用本發(fā)明制備得到的普魯士藍(lán)納米顆粒具有良好的生物相容性與安全性，能有效清除生物體內(nèi)ros并起到抗炎效果，能夠通過靜脈注射被動靶向至心肌缺血再灌注損傷的受損心肌，能很好地應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷的治療。

35、本發(fā)明提供一種psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒的制備方法，其中psc表面暴露的大量羥基能與三價鐵離子配位結(jié)合，這為普魯士藍(lán)納米顆粒的形成提供了內(nèi)在動力，有益于普魯士藍(lán)納米顆粒的形成，并且為普魯士藍(lán)納米顆粒進(jìn)一步功能化修飾奠定了基礎(chǔ)。除此之外，psc作為多糖，其末端的半縮醛羥基具有很好的氧化還原功能，起到抗氧化應(yīng)激的作用。因此，本發(fā)明利用psc作為包覆物開發(fā)出一種操作簡單、重復(fù)性好，能夠得到穩(wěn)定、均一、表面易于功能化修飾并且具有良好生物相容性和安全性的普魯士藍(lán)納米顆粒的技術(shù)是可行的，制備所得的普魯士藍(lán)納米顆粒也易于用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明的方法是一種利用psc表面羧基與三價鐵離子配位結(jié)合后再與氰化亞鐵離子配位聚合形成普魯士藍(lán)納米顆粒的新技術(shù)，該方法稱為雙前驅(qū)體法(如圖1所示)。本發(fā)明采用雙前驅(qū)體合成法得到psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒(pbnps@psc)，該方法操作簡單，易于工業(yè)放大生產(chǎn)，能夠在較短時間內(nèi)獲得較高質(zhì)量，表面易于功能化修飾的普魯士藍(lán)納米顆粒，通過此法可成功制備均一、穩(wěn)定、具有非常高的類sod酶活的普魯士藍(lán)納米顆粒，所制備的普魯士藍(lán)納米顆粒在生物體內(nèi)具有優(yōu)異的ros清除和抗炎效果，并具有良好生物相容性和安全性的，通過靜脈給藥可通過心肌缺血再灌注損傷受損心肌的epr效應(yīng)被動靶向至病灶部位，能很好地用于心肌缺血再灌注損傷的治療，為普魯士藍(lán)納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供巨大潛力。

36、現(xiàn)有的技術(shù)制備普魯士藍(lán)納米顆粒主要使用pvp作為保護(hù)劑，合成的普魯士藍(lán)納米顆粒類酶活性活性有待提高。本發(fā)明首次提出使用psc作為保護(hù)劑用于普魯士藍(lán)納米顆粒的制備，提高了類sod酶活，并且具有良好生物安全性，可用于與ros產(chǎn)生相關(guān)的疾病治療，例如心肌缺血再灌注損傷等。

37、本發(fā)明提供一種合成普魯士藍(lán)納米顆粒的新方法，即利用psc作為保護(hù)劑合成一種psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒，用于提高普魯士藍(lán)納米顆粒的穩(wěn)定性、安全性和活性。本發(fā)明通過與使用pvp包覆的極小尺寸(3.4nm)的高性能普魯士藍(lán)納米顆粒進(jìn)行比較，pvp包覆的極小尺寸(3.4nm)的高性能普魯士藍(lán)納米顆粒雖然也具有類酶活性，但尺寸越小，毒性越大，而本發(fā)明的這種方法，即使用psc作為保護(hù)劑用于普魯士藍(lán)納米顆粒的制備，制備所得的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒具有44nm的較大尺寸，但其sod酶活，即清除超氧根離子的能力和清除羥基自由基的能力與pvp包覆的極小尺寸(3.4nm)的高性能普魯士藍(lán)納米顆粒相比分別提高了1.6倍和0.6倍，并且表現(xiàn)出非常好的生物安全性，可以用于靜脈給藥。本發(fā)明不僅活性高并且生物安全性高，對于與ros產(chǎn)生相關(guān)的疾病具有很好的治療潛力。

38、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

39、本發(fā)明采用psc作為保護(hù)劑，通過雙前驅(qū)體法制備了psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒。采用本發(fā)明制備的普魯士藍(lán)納米顆粒尺寸分布均一穩(wěn)定、尺寸為44nm,批間穩(wěn)定性好，類sod酶活性與pvp包覆的極小尺寸(3.4nm)的高性能普魯士藍(lán)納米顆粒(uspbnps)有明顯提高，其中清除超氧根離子的能力提高1.6倍，清除羥基自由基的能力提高0.6倍。本發(fā)明制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒，具有良好的生物安全性，不易發(fā)生溶血，具有良好的ros清除和抗炎效果。本發(fā)明制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒能夠通過epr效應(yīng)被動靶向于受損心肌，通過靜脈注射到心肌缺血再灌注損傷模型小鼠后，在受損心肌的儲留與假手術(shù)組小鼠相比高5倍以上。本發(fā)明制備的psc包覆的普魯士藍(lán)納米顆粒能夠有效治療心肌缺血再灌注損傷。