本發(fā)明屬于魚類遺傳育種領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種長吻鮠的分子生物學(xué)的物種基因檢測技術(shù)。

背景技術(shù)：

1、長吻鮠(leiocassis?longirostris)屬鲇形目(siluriformes)，鲿科(bagridae)，鮠屬，因為它的吻比較長，所以被人們稱之為長吻鮠，俗稱鮰魚、江團、肥沱、淮王魚等。長吻鮠是水底層魚類，常在水流比較緩、水深且石塊多的區(qū)域里生存，廣泛分布在中國東部的遼河、淮河、長江、閩江到珠江等水系及朝鮮西部。長吻鮠沒有魚鱗和肌間刺，并且它的肉質(zhì)非常的鮮美，營養(yǎng)也是相當(dāng)豐富，這些特征使長吻鮠深受人們的喜愛。民間流傳有“不食江團，不知魚味”的說法。長吻鮠為大型的經(jīng)濟魚類，生長速度較快，長吻鮠體長可達1米左右。達到性成熟的最小年齡為3齡,一般為4-5齡。

2、黃顙魚(tachysurusfulvidraco)，隸屬于鲿科黃顙魚屬，黃顙魚體長180～250mm。其主要分布在中國、朝鮮、老撾、越南以及俄羅斯西伯利亞東南部。黃顙魚的性成熟年齡一般為2齡。華南為1～2齡,華中為2齡,北方地區(qū)為2～3齡或3齡以上。瓦氏黃顙魚(tachysurus?vachelli)是鲿科黃顙魚屬魚類，體延長，雄魚一般比雌魚大。瓦氏黃顙魚主要分布于中國長江流域的干支流以及與長江相通的湖泊水體中。體型比黃顙魚為大，最大長達300毫米。烏蘇里擬鲿(pseudobagrus?ussuriensis)和屬于鲿科，擬鲿屬(pseudobagrus)，廣泛分布于黑龍江、烏蘇里江、嫩江、松花江、珠江等水域，洪澤湖、太湖也有分布。烏蘇里擬鲿的體長范圍是60～450mm，一般個體重0.5-2公斤，最大個體重5公斤以上，3年達到性成熟。

3、雜交育種是水產(chǎn)遺傳育種中最傳統(tǒng)的方法之一，審定的水產(chǎn)新品種中約1/3采用了雜交方法。關(guān)于鲿科魚類雜交已經(jīng)開展了不少研究：基于長吻鮠隸生長速度快，雄性個體大等特征，黃顙魚因飼養(yǎng)成活率高、適應(yīng)性強等特點，已成為重要的淡水魚類養(yǎng)殖對象。如長吻鮠相比于黃顙魚有著生長速度快和營養(yǎng)價值高等特點。為整合兩種魚的優(yōu)勢，通過黃顙魚(♀)和長吻鮠(♂)所獲得的雜交f1代具有生長快速、抗逆性強等優(yōu)點，已成黃顙魚新品系。再如瓦氏黃顙魚與黃顙魚親緣關(guān)系較近，個體遠大于黃顙魚，因此研究人員選取瓦氏黃顙魚作為父本與黃顙魚雜交，產(chǎn)生新品種“黃優(yōu)1號”，其形態(tài)特征與黃顙魚接近，生長速度與成活率優(yōu)于黃顙魚，受到養(yǎng)殖戶的一致青睞。還如與烏蘇里擬鲿和瓦氏黃顙魚相比，長吻鮠個體大，是對烏蘇里擬鲿進行品種改良的優(yōu)良父本材料。以烏蘇里擬鲿為母本與長吻鮠父本雜交，獲得雜交種后代表現(xiàn)出良好是生長優(yōu)勢，可以在半年時間達到一齡的烏蘇里擬鲿上市規(guī)格。

4、此外，雜交方法也涉及各親本選擇哪個物種為父本情況，這樣就導(dǎo)致雜交后代的形態(tài)特征或與親本不同，或與親本相似，如何去鑒別這些形形色色的雜交物種、同源和近源物種，僅僅通過形態(tài)學(xué)方法鑒定將導(dǎo)致準確性較低，影響?zhàn)B殖生產(chǎn)管理。分子鑒定以高準確率一直備受青睞，長吻鮠相關(guān)的雜交品種分子鑒定專利已有一些報道，代表性的專利如下：

5、[1]羅輝,葉華,周劍,等.一種鑒別長吻鮠遺傳性別的分子標記及應(yīng)用[p].重慶市:cn202210030085.2,2023-08-01.

6、[2]葉歡,阮瑞,李創(chuàng)舉,等.一種長吻鮠雄性性別特異性分子標記及其擴增引物和遺傳性別鑒定方法[p].湖北省:cn202111232187.4,2022-06-17.

7、[3]梅潔,廖倩,鞏高瑞,等.鑒定瓦氏黃顙魚、長吻鮠和雜交種的引物、方法和試劑盒[p].湖北省:cn202211438645.4,2023-04-11.

8、[4]王濤,王玲玲,彭冶,等.一種針對黃顙魚、長吻鮠及其雜交f1代的鑒別方法及其特異性引物[p].江蘇省:cn202211448943.1,2023-03-28.

9、但上述專利往往只針對兩種魚類親本及其雜交f1代物種分子鑒定，對于更多其他同源或近源物種則無法使用，特別是針對不同地理種群，以及不同雌雄親本的雜交種的差異更無法區(qū)別開來。鑒于此，我們專門聚焦于長吻鮠這種較為復(fù)雜的情況，開發(fā)出一種基于現(xiàn)有長吻鮠相關(guān)物種核酸數(shù)據(jù)資源比對的方法，該方法分類鑒定更細致，更準確。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、1.發(fā)明要解決的技術(shù)問題

2、通過本方法應(yīng)用，可以鑒別與長吻鮠緊密相關(guān)的多種類型物種，包括同源物種、近源物種和各類可能的雜交種。

3、2.技術(shù)方案

4、為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案步驟如下：

5、(1)對于待測長吻鮠相關(guān)物種，如果是活體，可以通過損傷小的尾部采血提總dna，對于非活體可直接進行魚體的肌肉或肝臟組織的總dna提取，直接利用鳥槍法一代測序或二代測序，獲得待測物種的線粒體基因組，并進一步定位并分離出15個線粒體基因全序列包括12s?rrna、16s?rrna、nd1、nd2、nd3、nd4、nd4l、nd5、nd6、coi、coii、coiii、atp6、atp8和cytb基因。

6、(2)選擇genbank中現(xiàn)有的長吻鮠相關(guān)物種，包括長江或淮河流域的長吻鮠、黃顙魚、黃顙魚(雌)x長吻鮠(雄)雜交種、長吻鮠(雌)x黃顙魚(雄)雜交種、瓦氏黃顙魚(雌)x長吻鮠(雄)、黃顙魚(雌)x瓦氏黃顙魚(雄)和烏蘇里擬鲿x黃顙魚等，選擇的物種總數(shù)不少于10個物種。獲得它們的線粒體基因組組全序列，隨后直接提取其上述提及的15個基因全序列。

7、(3)構(gòu)建待測物種和可以鑒定物種每個基因核酸全序列的fasta文件，利用clustal?x1.8軟件進行本地的序列比對，獲得待測物種與已知物種每個基因比對結(jié)果，提取其相似性百分比指標和排序指標。

8、該步驟的另一方案為：可以利用線上blast直接比對實現(xiàn)，將待測物種15個基因核酸序列放入genbank的blastn界面的enter?query?sequence序列區(qū)域，在choose?searchset的organism選項中選擇長吻鮠相關(guān)的10個以上物種，從隨后運行的blast結(jié)果中獲得在線比對的其相似性百分比指標和排序指標。

9、(4)聯(lián)合分析兩個指標結(jié)果，相似性百分比指標應(yīng)該有90％的基因序列其相似度最大值大于99％，且有一個已知物種排序位置在第一位排序出現(xiàn)頻率高于90％。我們認為這個已知物種可能與我們待鑒定的物種為同一種群、同一物種或同一雜交種。

10、需要重點說明以下兩點：

11、(1)本方法多數(shù)情況下鑒定的結(jié)果應(yīng)為待測物種同一種群或物種。待測物種實際鑒定結(jié)果為長吻鮠的同源、近源及雜交物種，只受其被比對出來的已知物種本身屬于長吻鮠的同源、近源及雜交物種而定。

12、(2)如果鑒定結(jié)果顯示已知物種與待測物種不能滿足同一物種的條件(相似性百分比指標應(yīng)有90％的基因序列其相似度最大值大于99％，且有一個已知物種排序位置在第一位排序出現(xiàn)頻率高于90％)，那被鑒定出來的最大可能性為排序第一的已知物種的同源、近源及雜交物種。說明待測物種與提供的10多個物種中任何一個物種的關(guān)系都不會是同一物種。

13、3.有益效果

14、采用本發(fā)明提供的技術(shù)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著效果：

15、(1)鑒定物種數(shù)量上的提升，本發(fā)明基于10多個物種的線粒體15個基因進行待測物種比對分析，能夠?qū)F(xiàn)有長吻鮠相關(guān)物種的分子鑒定技術(shù)從2-3個物種提升至10多個物種。

16、(2)鑒定精度和廣度的提升，本發(fā)明基于genbank數(shù)據(jù)庫中已知的可鑒定的10多個物種，這些物種可能涉及同一物種的不同地理種群或居群(同源物種)，也可能涉及近源物種或是近源物種間的雜交種。其中，現(xiàn)有長吻鮠近源物種就包括黃顙魚、瓦氏黃顙魚和烏蘇里擬鲿等至少三個物種以上。因此，相比于現(xiàn)有技術(shù)只能鑒定一對明確的近源物種及其雜交物種，本發(fā)明鑒定物種精度更大：可以涉及同源物種的不同種群，可以鑒定兩個近緣物種的父母本物種的互換及其雜交種；廣度更廣：鑒定物種不一定為已知明確的不同近源物種，還可以是長吻鮠相關(guān)或相近的其他物種。