本發(fā)明涉及動(dòng)物模型構(gòu)建，尤其涉及重度牙周炎小鼠模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、牙周炎是威脅我國(guó)成人口腔健康的最常見的疾病之一，與全身多種疾病均有密切關(guān)系，是我國(guó)成人失牙的主要原因。牙周炎是一種牙周組織的慢性局部炎癥性疾病，由牙菌斑生物膜引起，可與宿主口腔免疫反應(yīng)相互作用加重炎癥的發(fā)生發(fā)展，嚴(yán)重的牙周炎不僅會(huì)導(dǎo)致牙齒脫落，還會(huì)對(duì)其他系統(tǒng)性疾病有負(fù)面影響。如何建立簡(jiǎn)單、快速和有效的理想動(dòng)物模型是研究牙周炎疾病發(fā)生發(fā)展與治療的一個(gè)重要前提和巨大挑戰(zhàn)。

2、目前已有研究的牙周炎動(dòng)物模型分為以下幾類，包括：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如恒河猴、小型豬、比格犬，嚙齒類動(dòng)物主要包括大鼠和小鼠，還有一些其他的動(dòng)物如馬、兔等。其中，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和小型豬具有與人相近的口腔結(jié)構(gòu)和疾病進(jìn)程，但其過于昂貴的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用與高要求的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)令其難以用于大規(guī)模研究。比格犬雖然費(fèi)用相對(duì)減少，但需要的護(hù)理與照料條件同樣嚴(yán)苛，且犬類牙周病變具有自限性；更重要的是，以上幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都存在一定的倫理問題。嚙齒類動(dòng)物費(fèi)用較低，易于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)牙周炎，且具有與人類較為接近的磨牙結(jié)構(gòu)，因此，在綜合考慮實(shí)驗(yàn)費(fèi)用、動(dòng)物倫理和模擬人類疾病的可行性等方面，嚙齒類動(dòng)物被認(rèn)為是目前研究最常用的牙周炎動(dòng)物模型，主要包括大鼠和小鼠。然而，嚙齒類動(dòng)物具有天然抵抗牙周炎的能力，擁有與人類不同的口腔菌群，當(dāng)前關(guān)于嚙齒類動(dòng)物牙周炎模型的構(gòu)建方法與評(píng)估效果尚無定論。

3、嚙齒類動(dòng)物（大鼠、小鼠等）牙周炎造模常見的方法主要有絲線結(jié)扎、局部涂抹細(xì)菌、細(xì)菌灌胃和注射細(xì)菌抗原等，其中最常見的是絲線結(jié)扎法。絲線結(jié)扎法造模時(shí)間短、費(fèi)用要求低及黏膜損傷小，促進(jìn)急性牙周炎癥和快速的牙槽骨吸收，但它很難模擬慢性牙周炎，造模不當(dāng)容易造成機(jī)械損傷，造模過程中需多次檢查絲線是否脫落，且造模時(shí)間短的小鼠牙槽骨去除絲線后易于恢復(fù)。注射細(xì)菌法可以促進(jìn)進(jìn)行性牙槽骨吸收，與慢性牙周炎相一致，還能用于研究與感染相關(guān)的特定牙周宿主-細(xì)菌相互作用；相較于注射細(xì)菌法，細(xì)菌灌胃可以在不麻醉小鼠的情況下進(jìn)行，操作更為簡(jiǎn)便，但可能造成小鼠壓力增加和食道創(chuàng)傷；但注射細(xì)菌或細(xì)菌灌胃的方法所需時(shí)間長(zhǎng)、注射次數(shù)多，造成的牙槽骨損失量相對(duì)不足，它的造模有效性取決于所用菌株，并且因?yàn)樯婕暗郊?xì)菌實(shí)驗(yàn)，必須在微生物實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行。注射細(xì)菌抗原最常用的是來自牙齦卟啉單胞菌的脂多糖（p.g.?lps），該方法不需要細(xì)菌培養(yǎng)或接種，當(dāng)應(yīng)用脂多糖至少2周時(shí)，可誘導(dǎo)低級(jí)別全身性炎癥；但該方法造模效果不佳，仍需要重復(fù)注射，且不能模擬細(xì)菌和宿主間的相互作用。

4、因此，為了更好地建立適合用于研究重度牙周炎治療的嚙齒類動(dòng)物模型，本研究選取絲線結(jié)扎和注射p.g.?lps這兩種構(gòu)建方法相聯(lián)合，優(yōu)化構(gòu)建一種兼具牙槽骨吸收、細(xì)菌聚集和炎癥浸潤(rùn)等典型特征的重度牙周炎模型并對(duì)其效果進(jìn)行評(píng)估分析，旨在探究更為安全、高效及簡(jiǎn)便的重度牙周炎小鼠模型，以期為牙周炎研究提供一種可選用的新模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供重度牙周炎小鼠模型的構(gòu)建方法。

2、本發(fā)明提供的重度牙周炎小鼠模型的構(gòu)建方法，包括：

3、絲線結(jié)扎磨牙后，在磨牙的牙腭側(cè)牙齦位置注射（p.g.?lps）溶液，14天后構(gòu)建獲得重度牙周炎小鼠模型。

4、本發(fā)明中，所述磨牙為第二磨牙。具體實(shí)施例中，所述第二磨牙為上頜左側(cè)第二磨牙。

5、實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同位置的磨牙進(jìn)行了嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第二磨牙更便于操作，且更容易實(shí)現(xiàn)良好的造模效果。此外，還對(duì)不同的線型進(jìn)行了嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-0號(hào)絲線的結(jié)扎更穩(wěn)固，更容易造模。本發(fā)明中，所述結(jié)扎的絲線為5-0絲線。

6、具體的，所述結(jié)扎的步驟包括：在上頜第一、第二磨牙牙間隙處穿過5-0不可吸收絲線，將絲線另一端穿過上頜第二、第三磨牙牙間隙處，線頭在第二磨牙頰側(cè)打結(jié)。

7、作為優(yōu)選，結(jié)扎后每3天檢查一次絲線脫落情況，如有脫落則用相同方法重新結(jié)扎。

8、注射藥物為牙齦卟啉單胞菌來源的脂多糖（porphyromonas?gingivalislipopolysaccharide，p.g.?lps），用不同的溶劑溶解p.g.?lps都能夠獲得良好的造模效果，為了提高造模的簡(jiǎn)便性，以無內(nèi)毒素水為溶劑進(jìn)行注射。本發(fā)明中，所述p.g.?lps溶液的溶劑為水。本發(fā)明中，p.g.?lps的濃度為8~12μg/μl，作為可行性案例，所述p.g.?lps溶液的濃度為8μg/μl、8.5μg/μl、9.0μg/μl、9.5μg/μl、10μg/μl、10.5μg/μl、11μg/μl、11.5μg/μl或12μg/μl。在具體實(shí)施例中，p.g.?lps溶液的濃度為10?μg/μl。

9、本發(fā)明對(duì)p.g.?lps注射的劑量和頻率進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，作為優(yōu)選，所述注射的劑量為2μl/牙，每3天注射1次，共注射4次。

10、所述注射采用的注射器型號(hào)為10?μl微量進(jìn)樣針；作為優(yōu)選，注射針針頭型號(hào)：hamilton?ga33（外徑/內(nèi)徑：0.21×0.11?mm；針長(zhǎng)51?mm）。

11、作為優(yōu)選，所述注射在體式顯微鏡下緩慢注射，盡量保證p.g.?lps溶液不溢出。

12、具體實(shí)施例中，所述結(jié)扎后，立即進(jìn)行第一次注射。

13、本發(fā)明中，所述結(jié)扎前還包括麻醉的步驟，麻醉劑為1%三溴乙醇。

14、本發(fā)明中，具體實(shí)施例中，所述小鼠為10周齡的c57bl/6小鼠。更優(yōu)選的，為10周齡的c57bl/6雄性小鼠。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了如前所述方法構(gòu)建獲得的小鼠模型。

16、經(jīng)檢測(cè)，與單純結(jié)扎的小鼠的牙齒松動(dòng)度動(dòng)態(tài)變化（1.40?±?0.55）和探診深度（近中（0.86?±?0.14mm），中（0.33?±?0.47?mm），遠(yuǎn)中（0.55?±?0.33?mm））相比，結(jié)扎并連續(xù)注射p.g.?lps的小鼠上頜左側(cè)第二磨牙的牙齒松動(dòng)度動(dòng)態(tài)變化（2.20?±?0.45）和探診深度（近中（1.08?±?0.11?mm），中（1.04?±?0.26?mm），遠(yuǎn)中（1.04?±?0.26?mm））更為嚴(yán)重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?＜?0.05）。與單純結(jié)扎的小鼠上頜左側(cè)第二磨牙的骨體積分?jǐn)?shù)（28.97?±?7.90?%）、骨密度（0.55?±?0.08?g/cc）?、釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x（cemento-enamel?junction?to?the?alveolar?bone?crest,?cej-abc）（0.74?±?0.12?mm?）和附著喪失面積（0.30?±?0.02?mm2?）相比，和結(jié)扎并連續(xù)注射p.g.?lps的小鼠上頜左側(cè)第二磨牙的骨體積分?jǐn)?shù)（16.44?±?3.35?%）和骨密度（0.42?±?0.04?g/cc?）顯著降低，cej-abc?（0.88?±?0.03?mm?）和附著喪失面積（0.34?±?0.01?mm2?）顯著加重，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?＜?0.05）。

17、本發(fā)明將結(jié)扎與p.g.?lps注射聯(lián)用，構(gòu)建獲得了重度牙周炎小鼠模型，在構(gòu)建過程中，對(duì)構(gòu)建參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提高了構(gòu)建模型的效率，從而使重度牙周炎有了可靠的小鼠模型，所得模型更適合作為研究重度牙周炎疾病發(fā)生發(fā)展與治療的小鼠模型。并且構(gòu)建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷。