本發(fā)明涉及包含腫瘤特異性溶瘤腺病毒和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗癌組合物。

背景技術(shù)：

1、盡管癌癥治療劑的研發(fā)速度很快，癌癥仍然是全球范圍內(nèi)高死亡率的疾病之一。臨床常規(guī)使用的主要癌癥治療方法是手術(shù)，放射治療，和抗癌劑治療方法，或者，作為與其并行的治療，最大程度地從患者中除去癌細(xì)胞的方法。然而，這些治療僅在相對(duì)早期癌癥未轉(zhuǎn)移的狀態(tài)下完全去除癌癥細(xì)胞時(shí)才表現(xiàn)出治療效果，它們也殺死正在快速分裂的其他正常細(xì)胞，因此具有可能引起各種副作用的缺點(diǎn)。相應(yīng)地，最近已有人利用身體的腫瘤特異性免疫活性作為免疫治療方法對(duì)癌癥的治療進(jìn)行了研究。

2、然而，很難進(jìn)行免疫治療，因?yàn)榘┌Y不僅具有巧妙地逃避和破壞各種宿主免疫反應(yīng)的能力，結(jié)果通過(guò)誘導(dǎo)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境而不斷地維持腫瘤的存活，而且即使免疫系統(tǒng)被激活，也能夠逃避激活的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，為了通過(guò)改善免疫抑制性腫瘤微環(huán)境來(lái)增強(qiáng)針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，已經(jīng)在各個(gè)方向上用下列物質(zhì)進(jìn)行了研究：細(xì)胞因子基因如il-12，il-18，干擾素-γ(ifn-γ)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和腫瘤壞死因子-α(tnf-α)，共刺激因子如b7分子，直接作為抗原呈遞細(xì)胞(apc)的樹(shù)突細(xì)胞(dc)，由腫瘤抗原激活的t細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞(nkcs)等。具體地，il-12通常由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和dc等apc分泌，已知它直接作用于細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)和那些能夠有效去除癌細(xì)胞的nk細(xì)胞，以激活那些細(xì)胞，誘導(dǎo)ifn-γ的分泌，增強(qiáng)殺死癌細(xì)胞的能力。此外，il-12通過(guò)作用于幼稚型cd4+淋巴細(xì)胞，在促進(jìn)分化為t輔助1(th1)細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，并因此通過(guò)誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而激活抗癌免疫應(yīng)答，這種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是抗癌免疫應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵因素。vegf是由促進(jìn)血管新生和血管形成的細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)蛋白，它影響骨髓中的t細(xì)胞前體，從而不僅抑制t細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的增殖和成熟，還在血管形成中起重要作用，由此表現(xiàn)出被稱為癌癥轉(zhuǎn)移的副作用。因此，vegf不僅是腫瘤生長(zhǎng)的啟動(dòng)子，還充當(dāng)抗癌免疫力中的抑制劑，預(yù)計(jì)通過(guò)vegf?shrna下調(diào)vegf可恢復(fù)免疫應(yīng)答并增加抗癌作用。gm-csf通過(guò)刺激dc以促進(jìn)dc分化成apc來(lái)增強(qiáng)cd4+和cd8+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，它還參與初始單核細(xì)胞中構(gòu)成ii類主要組織相容性復(fù)合體(mhc)的分子的表達(dá)調(diào)控。據(jù)報(bào)道，由于gm-csf在腫瘤中表達(dá)，誘導(dǎo)了許多apc聚集在腫瘤周圍以有效加工腫瘤抗原，由此誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗癌免疫應(yīng)答。

3、基于此，我們的實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了il-12的抗腫瘤作用，是用ykl-1(ad-e1b-55)作為e1b-55kda基因缺失的腫瘤選擇性溶瘤腺病毒，還報(bào)道了gm-csf的抗腫瘤作用，是用rdb腺病毒，它比ykl-1具有更強(qiáng)的腫瘤選擇性殺傷能力，這歸因于e1b基因的缺失和e1a的rb結(jié)合位點(diǎn)的修飾。盡管免疫抑制性腫瘤微環(huán)境得到改善，但因使用免疫治療方法時(shí)腫瘤的低免疫原性，在完全治療癌癥方面仍存在許多限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、在開(kāi)發(fā)以克服腫瘤免疫監(jiān)視逃避為目的的免疫療法的深入研究中，本發(fā)明人不僅通過(guò)制備能同時(shí)表達(dá)它們的重組腺病毒，證實(shí)了il-12加靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)的短發(fā)卡核糖核酸(shvegf)、或者il-12加gm-csf-松弛素的體內(nèi)優(yōu)秀抗癌效應(yīng)，還證實(shí)通過(guò)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同給藥改進(jìn)了所述重組腺病毒的抗癌作用，由此完成了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能同時(shí)表達(dá)il-12和shvegf，或il-12和gm-csf-松弛素的重組腺病毒。

4、本發(fā)明另一目的是提供所述重組腺病毒在預(yù)防或治療癌癥中的用途。

5、本發(fā)明另一目的是提供所述重組腺病毒在預(yù)防或治療癌癥中作為與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的組合制劑的藥用用途。

6、然而，本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的技術(shù)問(wèn)題不限于上述問(wèn)題，本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下描述中可以清楚地理解未提及的其他問(wèn)題。

7、技術(shù)方案

8、為了實(shí)現(xiàn)上述的本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種重組腺病毒，其包括：編碼白細(xì)胞介素12(il-12)的基因；編碼粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)的基因；和編碼松弛素的基因，或者，所述重組腺病毒包括：編碼白細(xì)胞介素12(il-12)的基因；和編碼能抑制vegf表達(dá)的shrna的基因。

9、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，重組腺病毒可以缺失一個(gè)或多個(gè)選自e1和e3區(qū)的區(qū)域。

10、作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，編碼il-12的基因可以包括il-12a(p35)基因序列，ires序列，和il-12b(p40)基因序列，并且可以插入到重組腺病毒的e1或e3區(qū)域。

11、作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，編碼gm-csf和松弛素的基因可以包括gm-csf基因序列，ires序列，和松弛素基因序列，并且可以插入到所述重組腺病毒的e1或e3區(qū)域。

12、作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，編碼抑制vegf表達(dá)的shrna的基因可以與vegf的mrna互補(bǔ)結(jié)合，并且可以插入重組腺病毒的e1或e3區(qū)。

13、此外，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，該組合物包括：所述重組腺病毒；和藥學(xué)上可接受的載體。

14、作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述組合物可與選自以下的任一種免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同施用：pd-1拮抗劑，pd-l1拮抗劑，pd-l2拮抗劑，cd27拮抗劑，a?cd28拮抗劑，cd70拮抗劑，cd80拮抗劑，cd86拮抗劑，cd137拮抗劑，cd276拮抗劑，kirs拮抗劑，lag3拮抗劑，tnfrsf4拮抗劑，gitr拮抗劑，gitrl拮抗劑，4-1bbl拮抗劑，ctla-4拮抗劑，a2ar拮抗劑，vtcn1拮抗劑，btla拮抗劑，ido拮抗劑，tim-3拮抗劑，vista拮抗劑，klra拮抗劑，及其組合。

15、作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該組合物可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。

16、作為本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，癌癥可以選自胃癌，肺癌，非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，肝癌，支氣管癌，鼻咽癌，喉癌，胰腺癌，膀胱癌，結(jié)腸癌，宮頸癌，骨癌，非小細(xì)胞骨癌，血液系統(tǒng)惡性腫瘤，皮膚癌，頭頸癌，子宮癌，結(jié)直腸癌，肛門(mén)癌，結(jié)腸癌，輸卵管癌，子宮內(nèi)膜癌，陰道癌，外陰癌，霍奇金病，食道癌，小腸癌，內(nèi)分泌癌，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，陰莖癌，前列腺癌，慢性或急性白血病，淋巴細(xì)胞性淋巴瘤，腎臟或輸尿管癌，腎細(xì)胞癌，腎盂癌，唾液腺癌，肉瘤癌，腹膜假性粘液瘤(pseudomyxomaperitonei)，肝母細(xì)胞瘤，睪丸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，唇癌(cheilocarcinoma)，卵巢生殖細(xì)胞腫瘤，基底細(xì)胞癌，多發(fā)性骨髓瘤，膽囊癌，脈絡(luò)膜黑色素瘤，vater壺腹癌，腹膜癌，舌癌，小細(xì)胞癌，小兒淋巴瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，十二指腸癌，輸尿管癌，星形細(xì)胞瘤，腦膜瘤，腎盂癌，陰部癌(pudendum?cancer)，胸腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，脊髓腫瘤，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，和垂體腺瘤，癌癥也可以是復(fù)發(fā)性癌癥。

17、有益效果

18、插入了il-12和shvegf，或插入了il-12和gm-csf-松弛素的本發(fā)明重組腺病毒通過(guò)改善免疫功能而表現(xiàn)出優(yōu)異的抗癌作用，已證實(shí)這種抗癌作用通過(guò)與免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同施用而被顯著增強(qiáng)，因此，本發(fā)明可以用作癌癥治療領(lǐng)域中的關(guān)鍵技術(shù)。

19、附圖描述

20、圖1示例了能同時(shí)表達(dá)il-12和vegf?shrna的溶瘤腺病毒的特征，還圖示了rdb/il12/shvegf?ad的遺傳結(jié)構(gòu)。rdb包括修飾的e1a(星形-rb蛋白結(jié)合位點(diǎn)的突變)，且e1b-19kda和e1b-55kda(e1b)、以及e3區(qū)(e3)都缺失；小鼠il-12和小鼠shvegf分別插入腺病毒基因組的e1或e3區(qū)。

21、圖2示例了能同時(shí)表達(dá)il-12以及gm-csf和松弛素(gmcsf-松弛素)的溶瘤腺病毒的特征，還圖示了rdb/il12/gmcsf-rlx?ad的遺傳結(jié)構(gòu)。il-12和gmcsf-松弛素分別插入腺病毒基因組的e1或e3區(qū)。gmcsf和松弛素也可以通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)連接的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)，在本發(fā)明中，ires是可見(jiàn)于數(shù)種病毒和細(xì)胞rna的調(diào)節(jié)序列。

22、圖3確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/shvegf?ad，以及將rdb/il12/shvegfad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗癌作用，圖3a顯示腫瘤體積變化，圖3b顯示黑素瘤小鼠存活率變化。對(duì)于c57bl/6小鼠腫瘤，在第1、3和5天給藥腺病毒的ad?5x109個(gè)病毒顆粒(vp)(圖3a；初始腫瘤體積：80～100mm3)，并經(jīng)腹膜內(nèi)給藥200μg抗pd-l1抗體。每天監(jiān)測(cè)并記錄腫瘤體積直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。紅色箭頭表示注射腺病毒的時(shí)間，黑色箭頭表示注射抗體的時(shí)間。

23、圖4確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad，以及將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗癌作用，圖4a顯示腫瘤體積變化，圖4b顯示黑素瘤小鼠存活率變化。

24、圖5確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/shvegf?ad，以及將rdb/il12/shvegfad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗癌作用，還確認(rèn)當(dāng)rdb/il12/shvegfad以1x?109vp的相對(duì)低劑量給藥時(shí)的腫瘤體積變化。

25、圖6確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad，以及將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗癌作用，還確認(rèn)當(dāng)rdb/il12/gmcsf-rlx?ad以1x?109vp的相對(duì)低劑量給藥時(shí)的腫瘤體積變化。

26、圖7確認(rèn)了將hmt-rd19-k35/il21?ad,rdb/gmcsf/shvegf?ad,和ykl-1/gmcsf/b7.1?ad，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥黑素瘤小鼠的抗癌作用。

27、圖8確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad，以及將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗癌作用，圖8a顯示腫瘤體積變化，圖8b顯示黑素瘤小鼠存活率變化。

28、圖9確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad，以及將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗ctla-4抗體)共同給藥，有抗癌作用，圖9a顯示腫瘤體積變化，圖9b顯示黑素瘤小鼠存活率變化。

29、圖10確認(rèn)，在黑素瘤小鼠中，給藥rdb/il12/shvegf，以及將rdb/il12/shvegf?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥，有抗腫瘤的免疫記憶效果，圖10a顯示給藥rdb/il12/shvegf?ad時(shí)繼發(fā)腫瘤的體積變化，圖10b顯示將rdb/il12/shvegf?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-l1抗體)共同給藥時(shí)的繼發(fā)腫瘤的體積變化。

30、圖11的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)結(jié)果顯示，敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌細(xì)胞系(hap-t1)被rdb/il12/gmcsf-rlx?ad感染后，以感染復(fù)數(shù)(moi)表示的il-12和gmcsf表達(dá)的變化。

31、圖12的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)結(jié)果顯示，敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌細(xì)胞系(hap-t1)被rdb/il12/gmcsf-rlx?ad感染后，以moi表示的松弛素表達(dá)的變化。

32、圖13確認(rèn)，在敘利亞倉(cāng)鼠腫瘤動(dòng)物模型中，將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)共同給藥，腫瘤體積有變化。

33、圖14的免疫組化結(jié)果顯示，在敘利亞倉(cāng)鼠腫瘤動(dòng)物模型中，將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)共同給藥，腫瘤組織有變化。

34、圖15顯示，將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)共同給藥，在引流淋巴結(jié)(draining?lymph?node,dln)中，表達(dá)干擾素(ifn)-γ的cd4+或cd8+t細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生變化。

35、圖16顯示，將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)共同給藥，在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中,表達(dá)干擾素(ifn)-γ的cd4+或cd8+t細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生變化。

36、圖17顯示，將rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)共同給藥，腫瘤組織中的ifn-γ表達(dá)有變化。

37、圖18顯示，在耐受免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)的情形中，rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和該免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同給藥也使得腫瘤體積有變化。

38、圖19顯示，在耐受免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)的情形中，rdb/il12/gmcsf-rlx?ad和該免疫檢查點(diǎn)抑制劑共同給藥后第23天，腫瘤體積的變化。

39、圖20確認(rèn)給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad后腫瘤組織中免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)浸潤(rùn)的變化，還通過(guò)免疫熒光分析定量了腫瘤組織中alexa?488-αpd-1的積累。

40、圖21確認(rèn)給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad后腫瘤組織中免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)浸潤(rùn)的變化，還通過(guò)免疫熒光確認(rèn)了alexa?488-αpd-1是否定位于cd4+或cd8+t細(xì)胞的表達(dá)位點(diǎn)。

41、圖22確認(rèn)系統(tǒng)性給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad后免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)浸潤(rùn)的變化，還顯示了免疫正電子發(fā)射斷層掃描(pet)圖像隨時(shí)間變化的分析結(jié)果。

42、圖23確認(rèn)系統(tǒng)性給藥rdb/il12/gmcsf-rlx?ad后免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗pd-1抗體)浸潤(rùn)的變化，還顯示了包括腫瘤組織在內(nèi)的各種組織中，64cu-αpd-1分布或吸收的評(píng)估和比較結(jié)果，以％id/g表示。