本技術(shù)涉及微生物發(fā)酵，尤其涉及珊瑚猴頭在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、珊瑚猴頭(hericium?coralloides)別稱玉髯，屬于擔(dān)子菌亞門(basidiomycetes)，傘菌綱(agaricomycetes)，紅菇目(russulales)，猴頭菌科(hericiaceae)，猴頭菌屬(hericium)，為我國著名的珍稀名貴食藥用菌。珊瑚猴頭利五臟，滋補(bǔ)，助消化，主治用于神經(jīng)衰弱，胃潰瘍等疾病，是一種優(yōu)良的藥用真菌，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值。

2、肝細(xì)胞癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率迅速上升。當(dāng)前肝細(xì)胞癌的治療效果有限，遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度。同時(shí)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，肝細(xì)胞癌切除術(shù)后5年有60-70％的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。

3、神經(jīng)瘤又名許旺細(xì)胞瘤，是由周圍神經(jīng)的schwann鞘(即神經(jīng)鞘)所形成的腫瘤，為良性腫瘤。發(fā)生于前庭神經(jīng)或蝸神經(jīng)時(shí)亦被稱為聽神經(jīng)瘤?；颊叨酁?0-40歲的中年人，無明顯性別差異。常生長于脊神經(jīng)后根，如腫瘤較大，可有2-3個(gè)神經(jīng)根粘附或被埋入腫瘤中。神經(jīng)根粗大，亦可多發(fā)于幾個(gè)脊神經(jīng)根。少數(shù)患者可伴發(fā)多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤病，可見患者皮膚上有咖啡色素斑沉著及多發(fā)性小結(jié)節(jié)狀腫瘤。脊髓神經(jīng)鞘瘤的大小通常為2-3厘米。

4、但目前未有利用珊瑚猴頭治療肝細(xì)胞癌或神經(jīng)瘤的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種珊瑚猴頭在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，具體為珊瑚猴頭(hericium?coralloides)rt25，本技術(shù)中發(fā)現(xiàn)該珊瑚猴頭在五味子作為誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)所得到的發(fā)酵液能夠用于治療癌癥，尤其是肝癌和神經(jīng)瘤相關(guān)疾病，為抗癌藥物提供了一種新的有效成分。

2、一方面，本技術(shù)提供了珊瑚猴頭在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述珊瑚猴頭為珊瑚猴頭(hericium?coralloides)rt25，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.：41304。

3、進(jìn)一步地，所述珊瑚猴頭的培養(yǎng)方法為：將珊瑚猴頭接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括五味子。

4、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)包括如下步驟：

5、步驟一、將珊瑚猴頭rt25菌株活化獲得種子液；

6、步驟二、將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基包括：乳糖1.6％-2.4％、蛋白胨0.1％-0.9％、馬鈴薯10％-50％、硫酸鎂0.1％-0.5％、磷酸氫二鉀0.1％-0.5％、vb10.001％-0.01％、五味子0.1％-0.3％，發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：接種量為0.1％-3％，發(fā)酵溫度為18℃-32℃，裝液量為24％-60％，轉(zhuǎn)速為100-180rpm，ph為4.0-7.0，發(fā)酵時(shí)間為1-10天。

7、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：馬鈴薯200g(煮汁)，乳糖19g，蛋白胨3g，五味子2.4g，磷酸氫二鉀3g，硫酸鎂1.5g，vb1?0.01g，水1000ml。

8、優(yōu)選的，馬鈴薯為馬鈴薯汁，所述馬鈴薯汁的制備方法包括：馬鈴薯去皮，切成塊加水，煮沸30min，用紗布過濾補(bǔ)足水至100ml，滅菌。

9、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：接種量為1％，發(fā)酵溫度為25℃，裝液量為32％，轉(zhuǎn)速為140rpm，ph為6.0，發(fā)酵時(shí)間為7天。

10、其中，可采用本領(lǐng)域通用的方法活化珊瑚猴頭菌株獲得種子液。

11、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述珊瑚猴頭菌株的活化方式包括：將珊瑚猴頭菌塊接種于種子液培養(yǎng)基，25℃、140r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)7d。

12、種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯20％、葡萄糖2％，蛋白胨0.3％，磷酸氫二鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，vb1?0.001％，余量為水。

13、進(jìn)一步地，所述癌癥包括肝癌和/或神經(jīng)瘤。

14、本技術(shù)中首次發(fā)現(xiàn)珊瑚猴頭(hericium?coralloides)rt25中含有多種抗氧化活性物質(zhì)，如黃酮和γ-氨基丁酸，能夠針對(duì)性的治療肝癌和神經(jīng)瘤，有效抑制癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而本技術(shù)中給出了富含黃酮或γ-氨基丁酸的提取液的制備方法。

15、另一方面，本技術(shù)還提供了一種治療癌癥的珊瑚猴頭提取液的制備方法，所述方法包括如下步驟：

16、步驟一、將珊瑚猴頭接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括五味子；所述珊瑚猴頭為珊瑚猴頭rt25，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.：41304；

17、步驟二、將珊瑚猴頭超聲提取，獲得珊瑚猴頭提取液。

18、進(jìn)一步地，所述珊瑚猴頭包括菌絲體、原基和/或子實(shí)體。

19、進(jìn)一步地，所述超聲提取條件包括：料液比為1:(10-120)，超聲時(shí)間為0.5-5h，超聲溫度為30℃-80℃；和/或，所述超聲提取的提取劑為濃度為0％-100％的乙醇。

20、其中，料液比的單位為g:v，g·ml-1。

21、優(yōu)選的，所述珊瑚猴頭發(fā)酵液中包含抗氧化活性物質(zhì)；優(yōu)選的，所述抗氧化活性物質(zhì)包括多糖、黃酮、多酚、三萜、可溶性蛋白和/或γ-氨基丁酸；更優(yōu)選的，γ-氨基丁酸和/或黃酮。

22、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗氧化活性物質(zhì)為γ-氨基丁酸，所述超聲提取條件包括：超聲時(shí)間1.4h，料液比1：98(g:v，g·ml-1)，超聲溫度38℃，提取劑為水(即乙醇濃度為0％)。

23、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗氧化活性物質(zhì)為黃酮，所述超聲提取條件包括：超聲時(shí)間3.5h，料液比1：83(g:v，g·ml-1)，超聲溫度60℃，乙醇濃度為80％。

24、進(jìn)一步地，所述癌癥包括肝癌和/或神經(jīng)瘤。

25、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種治療癌癥的珊瑚猴頭提取液的制備方法，所述方法包括如下步驟：

26、步驟一、將珊瑚猴頭接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括五味子；所述珊瑚猴頭為珊瑚猴頭rt25，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.：41304；優(yōu)選的，所述步驟一還包括粉碎干燥的步驟；

27、步驟二、將發(fā)酵后的珊瑚猴頭以濃度為0％-100％的乙醇為提取劑進(jìn)行超聲提取，所述超聲提取條件包括：料液比為1:(10-120)，超聲時(shí)間為0.5-5h，超聲溫度為30℃-80℃，獲得珊瑚猴頭提取液。

28、優(yōu)選的，所述粉碎目數(shù)為80目。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，粉碎目數(shù)對(duì)本技術(shù)技術(shù)效果并無直接影響，在實(shí)際應(yīng)用過程中可根據(jù)實(shí)際情況選擇粉碎目數(shù)。

29、優(yōu)選的，所述步驟二中還包括離心的步驟。

30、優(yōu)選的，所述步驟二中還包括減壓濃縮、醇沉去多糖的步驟。

31、本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用通用的方法對(duì)本技術(shù)提取液進(jìn)行進(jìn)一步地純化加工，本技術(shù)中對(duì)此不做具體限定。

32、其中，所述珊瑚猴頭包括菌絲體、原基和/或子實(shí)體，菌絲體、原基和/或子實(shí)體可通過通用培養(yǎng)方法獲得。

33、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，珊瑚猴頭菌絲、原基、子實(shí)體的培養(yǎng)方法包括如下步驟：

34、步驟一、將珊瑚猴頭活化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到液體菌種(或菌絲體)；

35、步驟二、發(fā)酵得到的菌絲體，經(jīng)無菌水沖洗，紗布過濾，55℃恒溫烘干至恒重，粉碎過80目篩得到菌絲體粉末樣品，備用；

36、將液體菌種接種于袋料栽培培養(yǎng)基，四溫區(qū)恒溫加濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集原基、子實(shí)體，55℃恒溫烘干至恒重，粉碎過80目篩得到原基樣品、子實(shí)體樣品，備用。

37、另一方面，本技術(shù)還提供了所述的方法制備的珊瑚猴頭提取液。

38、進(jìn)一步地，所述珊瑚猴頭提取液中包含抗氧化活性物質(zhì)；優(yōu)選的，所述抗氧化活性物質(zhì)包括多糖、黃酮、多酚、三萜、可溶性蛋白和/或γ-氨基丁酸；更優(yōu)選的，γ-氨基丁酸和/或黃酮。

39、另一方面，本技術(shù)還提供了所述的方法或如所述的珊瑚猴頭提取液在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選的，所述癌癥為肝癌和/或神經(jīng)瘤。

40、本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況選擇調(diào)整珊瑚猴頭發(fā)酵液的具體使用濃度。

41、本發(fā)明具有如下有益效果：

42、本技術(shù)中首次發(fā)現(xiàn)珊瑚猴頭(hericium?coralloides)rt25中含有多種抗氧化活性物質(zhì)，如多糖、黃酮、多酚、三萜、可溶性蛋白和γ-氨基丁酸，尤其是富含黃酮和γ-氨基丁酸，并且能夠針對(duì)性的治療肝癌和神經(jīng)瘤，有效抑制癌細(xì)胞增殖。

43、本技術(shù)中還以珊瑚猴頭rt25發(fā)酵液、菌絲體、原基、子實(shí)體為樣品進(jìn)行黃酮和γ-氨基丁酸的富集，進(jìn)而獲得了具有抗氧化和抗癌功效的提取液，為肝癌和神經(jīng)瘤治療藥物提供了一種新的有效成分。