本發(fā)明涉及藥物領域，特別是涉及一種牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒的制備方法和應用。

背景技術：

1、喜樹堿(camptothecin，cpt)是從喜樹中分離出來的喹啉類生物堿，通過抑制dna拓撲異構酶ι(topι)的作用抑制癌細胞的復制。作為天然的topι抑制劑，cpt對肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌等多種癌癥具有良好的抗腫瘤效果，在癌癥的治療上具有廣泛的應用前景。但是，cpt存在水溶性差、不穩(wěn)定、半衰期短、嚴重的毒副作用等問題，導致其在臨床中的應用受到極大限制。

2、針對cpt在癌癥治療中存在的各種問題，目前已經開發(fā)出脂質體、聚合物膠束、納米粒及微球等多種藥物劑型，在不同程度上提高了cpt的溶解度、降低了毒性、提高了生物利用度。但由于載體材料的影響，藥物在體內的遞送受到限制，如脂質體中的磷脂易氧化使結構解體而可能引發(fā)毒副作用，聚合物膠束的穩(wěn)定性較差易引發(fā)藥物泄露造成血管堵塞等問題。因此，選取合適的藥物載體提高cpt的溶解性、延長體內循環(huán)時間和增強腫瘤靶向性仍是提高其治療效果的關鍵。

3、近年來，納米藥物遞送系統(tǒng)的發(fā)展為解決這些問題提供了新的思路。其中，血清白蛋白(sa)作為一種天然、可生物降解的載體材料，因其良好的生物相容性和靶向性而受到廣泛關注。目前分離出的sa主要有牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)和大鼠血清白蛋白(rsa)。其中，bsa和hsa因具有安全無毒性、無免疫原性、生物相容性、生物降解性等優(yōu)點，廣泛應用于藥物輸送研究。與hsa相比，bsa來源更加廣泛、成本低，常作為hsa的替代物用于臨床前模型研究。將喜樹堿類藥物與牛血清白蛋白(bsa)結合制備成納米粒，可以提高藥物的水溶性和穩(wěn)定性、提高治療效、降低藥物毒性等。

4、聚乙二醇(peg)是極少數(shù)被fda批準的能用作體內注射藥用合成聚合物之一。peg水溶液的ph呈中性、易溶于水和極性溶劑，無毒、無免疫原性，生物相容性，還可以通過共價鍵或非共價鍵偶聯(lián)修飾蛋白質、脂質體等，從而改變藥物的藥動學性質。經peg修飾后，大多數(shù)蛋白質的性質變化如下：(1)降低免疫原性與抗原性；(2)延長循環(huán)半衰期最高至50倍；(3)溶解性增加；(4)耐蛋白酶水解；(5)毒性減少；(6)穩(wěn)定性增加。采用peg對bsa進行修飾，制備peg-bsa-cpt納米粒，修飾后的納米粒子由于其可以避免網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的清除，延長藥物在體內的循環(huán)時間，進一步提高cpt溶解性和穩(wěn)定性。

5、目前，血清白蛋白納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法主要有去溶劑化法、基于二硫鍵形成的白蛋白納米技術(nabtm－技術)技術、自組裝技術等。自組裝技術制備血清白蛋白納米粒需要使用還原劑，但還原劑存在潛在毒性；去溶劑化法需要使用交聯(lián)劑戊二醛對納米粒進行固定處理，殘留的戊二醛易對人體造成損害；nabtm技術是水相與有機相在高壓均質條件下實現(xiàn)乳化的過程，但高壓均質可能改變蛋白的二級和三級結構，導致蛋白質展開或變性。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明克服了上述血清白蛋白納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法的弊端，在nabtm技術的基礎上進行改變，采用冷凍干燥-超聲法代替高壓均質實現(xiàn)乳化過程。采用冷凍干燥-超聲法制備血清白蛋白載藥納米粒，避免血清白蛋白的展開或變性，工藝簡單、重復性好、綠色環(huán)保。

2、鑒以此，本發(fā)明目的是提供一種聚乙二醇修飾牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒的制備方法，采用冷凍干燥-超聲法，制備方法如下：

3、步驟一，將mpeg-nhs溶于水中，在攪拌條件下緩慢加入到bsa水溶液中，反應在室溫下進行12h，將得到的共軛物(peg-bsa)采用去離子水透析去除未反應的mpeg-nhs，凍干并在-20℃保存至使用。

4、步驟二，稱取cpt溶于氯仿與無水乙醇的混合溶液中作為有機相，步驟一得到的peg-bsa溶于水作為水相，二者混合，攪拌均勻，得到初步包封喜樹堿的peg-bsa納米粒溶液。

5、步驟三，將步驟二得到的包封喜樹堿的peg-bsa納米粒溶液迅速冷凍至-80℃以下，形成凍液，冷凍干燥得到peg-bsa-cpt納米粒。

6、步驟四，將步驟三得到的凍干peg-bsa-cpt納米粒重新溶解于適量去離子水或pbs緩沖液中，超聲處理，干燥機凍干，即得聚乙二醇修飾牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒(peg-bsa-cpt-nps)。

7、優(yōu)選的，步驟一中，bsa濃度為2～10mg/ml，mpeg-nhs與bsa摩爾比為20:1。

8、優(yōu)選的，步驟二中，氯仿與無水乙醇體積比為(1～9):1。

9、優(yōu)選的，步驟二中，cpt濃度為0.53～4.8mg/ml。

10、優(yōu)選的，步驟二中，水相與有機相體積比為(5～30):1。

11、優(yōu)選的，步驟二中，水相溶液ph5～8。

12、優(yōu)選的，步驟四中，超聲時間為4～12min，超聲功率為45％～75％。

13、本發(fā)明提供一種由上述制備方法制備所得的牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒。

14、本發(fā)明另一個目的是，提供了一種牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒在制備抗癌藥物中的應用。

15、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

16、1.本發(fā)明通過聚乙二醇(peg)修飾bsa，增強了納米粒的生物相容性和穩(wěn)定性，制備得到peg-bsa-cpt-nps，提高cpt水溶解度近10倍的同時延長藥物的循環(huán)時間，提高了cpt的抗腫瘤活性。

17、2.本發(fā)明在nabtm技術的基礎上進行改變，為避免高壓均質造成的改變蛋白的二級和三級結構，導致蛋白質展開或變性的缺點，采用冷凍干燥-超聲法代替高壓均質實現(xiàn)乳化過程。采用凍干法避免了高溫或有機溶劑對藥物活性的破壞，同時通過調整超聲工藝參數(shù)，能夠有效控制納米粒的粒徑。所得peg-bsa-cpt-nps的納米粒粒徑符合納米藥物理想尺寸的標準，能夠穿透腫瘤微環(huán)境并避免被快速清除。

18、3.本發(fā)明在傳統(tǒng)的超聲乳化法基礎上引入了冷凍干燥步驟，先將載藥納米粒冷凍干燥成粉末，再進行超聲處理。第一步凍干的過程在避免有機溶劑殘留、提高納米粒穩(wěn)定性、方便后續(xù)處理、減少污染風險以及改善相分散方面起到了關鍵作用；同時還能保持藥物結構的完整性，提高了藥物的包封效率和穩(wěn)定性，尤其對于難溶性藥物喜樹堿而言，這種方法能夠有效減少藥物在制備過程中的流失，并確保其在靶向部位的有效釋放。

技術特征：

1.一種牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟一中，bsa濃度為2～10mg/ml，mpeg-nhs與bsa摩爾比為20:1。

3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟二中，氯仿與無水乙醇體積比為(1～9):1。

4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟二中，cpt濃度為0.53～4.8mg/ml。

5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟二中，水相與有機相體積比為(5～30):1。

6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟二中，水相溶液ph5～8。

7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟四中，超聲時間為4～12min，超聲功率為45％～75％。

8.一種如權利要求1～7任一項所述的制備方法制備得到的牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒。

9.一種如權利要求8所述的牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒在制備抗癌藥物中的應用。

技術總結
本發(fā)明涉及一種牛血清白蛋白負載喜樹堿納米粒的制備方法，通過PEG修飾BSA，增強了納米粒的生物相容性和穩(wěn)定性，制備得到PEG?BSA?CPT?NPs，提高CPT水溶解度近10倍。采用冷凍干燥?超聲法代替高壓均質實現(xiàn)乳化過程，從而避免高壓均質造成的改變蛋白的二級和三級結構，導致蛋白質展開或變性的缺點。另外，在傳統(tǒng)的超聲乳化法基礎上引入了冷凍干燥步驟，先將載藥納米粒冷凍干燥成粉末，再進行超聲處理。本發(fā)明所制備的PEG?BSA?CPT?NPs的納米粒粒徑符合納米藥物理想尺寸的標準，能夠穿透腫瘤微環(huán)境并避免被快速清除，提高了CPT的抗腫瘤活性。

技術研發(fā)人員：宋蕓,蘇文琴,黎俊峰
受保護的技術使用者：海南醫(yī)科大學（海南省醫(yī)學科學院）
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23