本發(fā)明涉及一種于mrna療法，尤其涉及一種通過(guò)內(nèi)體逃逸來(lái)提高mrna遞送效率的npc1抑制劑和mrna藥物聯(lián)用的mrna藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、基于mrna療法的先進(jìn)性、創(chuàng)新性、安全性、個(gè)性化潛力和多功能性，mrna療法已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新興巨星。mrna療法已經(jīng)在包括新冠、癌癥治療、遺傳病、免疫治療等一些領(lǐng)域取得了顯著的進(jìn)展，并在臨床應(yīng)用中顯示出潛力(1-4)。mrna療法的細(xì)胞內(nèi)遞送對(duì)于疫苗和治療的開(kāi)發(fā)具有巨大潛力。mrna療法的遞送載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒、基于蛋白質(zhì)的類病毒納米顆粒、電穿孔等。然而，成功mrna療法的應(yīng)用很大部分取決于mrna遞送系統(tǒng)的工程化設(shè)計(jì)和mrna的胞內(nèi)遞送和胞內(nèi)加工，以避免他們被循環(huán)系統(tǒng)中的酶降解和促進(jìn)其內(nèi)體逃逸。

2、mrna遞送載體發(fā)揮效力的一個(gè)關(guān)鍵決定因素是mrna在到達(dá)靶組織后，利用內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞，并通過(guò)內(nèi)體-溶酶體系統(tǒng)逃逸到達(dá)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)表達(dá)。研究表明，只有小于2％的遞送載體介導(dǎo)的mrna會(huì)通過(guò)內(nèi)體-溶酶體逃逸的方式保留在細(xì)胞質(zhì)中(5-11)。mrna遞送進(jìn)入細(xì)胞后的內(nèi)體-溶酶體逃逸在時(shí)間和空間上是有限的。mrna通過(guò)遞送載體進(jìn)入細(xì)胞并達(dá)到內(nèi)體或溶酶體的時(shí)間一般在數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)之間，具體時(shí)間因細(xì)胞類型和載體特性而異。如脂質(zhì)納米顆粒利用內(nèi)吞作用將mrna遞送入細(xì)胞的過(guò)程通常發(fā)生在幾分鐘內(nèi)，內(nèi)吞后的mrna在囊泡的包裹下可以在數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體。隨著內(nèi)體的成熟，早期內(nèi)體會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥趦?nèi)體，并伴隨著內(nèi)體環(huán)境中ph值下降和酶活性的增強(qiáng)，這一過(guò)通常需要30分鐘到幾個(gè)小時(shí)。若mrna未能在內(nèi)體階段成功逃逸，它將進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體被降解或逃逸?？偟膩?lái)說(shuō)，mrna從內(nèi)吞到達(dá)溶酶體可能在幾小時(shí)內(nèi)完成。因此，內(nèi)體-溶酶體逃逸通常必須在這段時(shí)間內(nèi)完成，以避免mrna被降解(5,8,12,13)。此外，mrna的內(nèi)體-溶酶體逃逸不僅受時(shí)間約束，還受限于內(nèi)體膜的結(jié)構(gòu)和特性(膜組成、流動(dòng)性、穩(wěn)定性、ph值變化、酶活性)、內(nèi)體-溶酶體轉(zhuǎn)化(內(nèi)體的成熟過(guò)程和內(nèi)體-溶酶體融合過(guò)程)、膜融合機(jī)制(膜破裂與融合和ph依賴性)以及內(nèi)體內(nèi)部的空間障礙(內(nèi)體內(nèi)部物理結(jié)構(gòu)和局部環(huán)境差異)(9,14-18)。內(nèi)體-溶酶體途徑中的mrna逃逸事件通常發(fā)生在內(nèi)體膜的某些特定區(qū)域或階段，并非在整個(gè)內(nèi)體內(nèi)均勻發(fā)生。因此，突破mrna的內(nèi)體-溶酶體逃逸并延長(zhǎng)mrna在細(xì)胞質(zhì)中的貯留時(shí)間是打破mrna遞送局限的關(guān)鍵步驟。

3、c1型尼曼-匹克蛋白(niemann-pick?type?c-1，npc1)，一種位于晚期內(nèi)體/溶酶體上的跨膜蛋白，由1278個(gè)氨基酸殘基組成，包含13次跨膜螺旋，具有三個(gè)大的腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)脂蛋白衍生膽固醇在細(xì)胞中的分布，npc1在體內(nèi)主要負(fù)責(zé)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，其氨基酸突變可能會(huì)導(dǎo)致“尼曼-匹克病”，表現(xiàn)為兒童神經(jīng)發(fā)育遲緩，認(rèn)知障礙或失聰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致兒童夭折(19-21)。npc1已被確定為傳遞sirna的主要循環(huán)途徑的重要調(diào)節(jié)劑。npc1蛋白在調(diào)控膽固醇的運(yùn)輸和代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵的角色，而其缺陷可能導(dǎo)致膽固醇在溶酶體內(nèi)的異常積累，從而引發(fā)溶酶體形態(tài)學(xué)、運(yùn)輸和功能缺陷。npc1可以將含有l(wèi)np遞送載體介導(dǎo)的sirna外排到細(xì)胞外；npc1缺陷細(xì)胞顯示lnp介導(dǎo)的sirna在晚期內(nèi)體和溶酶體中的細(xì)胞保留增強(qiáng)，并且增加了靶基因的基因沉默效率(5,11,22,23)。在預(yù)防埃博拉病毒感染中篩選出npc1抑制劑可以通過(guò)抑制npc1靶點(diǎn)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積累，抑制病毒的細(xì)胞質(zhì)傳遞(24)。這些研究都表明，小分子npc1抑制劑與sirna遞送系統(tǒng)聯(lián)用，通過(guò)提高sirna的細(xì)胞質(zhì)保留來(lái)提高sirna系統(tǒng)效力是有吸引力策略。然而，npc1抑制劑對(duì)于提高mrna遞送系統(tǒng)效率的研究仍然空白。開(kāi)發(fā)可以通過(guò)內(nèi)體-溶酶體逃逸來(lái)延長(zhǎng)mrna在細(xì)胞質(zhì)中的貯留以促進(jìn)mrna遞送系統(tǒng)的遞送效率的應(yīng)用迫在眉睫。

4、參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提高mrna藥物在體內(nèi)外傳遞效率，由此達(dá)到mrna療法預(yù)防和治療開(kāi)發(fā)的目標(biāo)。本發(fā)明提供了一種用于提高mrna遞送效率的小分子抑制劑藥物的應(yīng)用。該藥物為npc1抑制劑。本發(fā)明提出將npc1抑制劑與mrna遞送系統(tǒng)聯(lián)用的方法，進(jìn)一步提高了mrna療法的應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及了用于提高mrna遞送系統(tǒng)體內(nèi)外表達(dá)效率的應(yīng)用。本發(fā)明涉及通過(guò)使用npc1抑制劑提高mrna遞送系統(tǒng)在體外的轉(zhuǎn)染，尤其通過(guò)增加mrna遞送系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)的積累。本發(fā)明還涉及到npc1抑制劑增加了mrna遞送系統(tǒng)向晚期內(nèi)體和溶酶體的遞送。本發(fā)明還涉及npc1抑制劑促進(jìn)了mrna遞送系統(tǒng)在晚期內(nèi)體和溶酶體的逃逸，增加了mrna在細(xì)胞質(zhì)中遞送的可能。本發(fā)明還包括通過(guò)npc1抑制劑和mrna遞送系統(tǒng)聯(lián)用提高了mrna在體內(nèi)的遞送應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、一種mrna藥物組合物，其包含c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑(npc1)和mrna藥物。將所述的npc1抑制劑和mrna藥物聯(lián)用，以提高mrna藥物遞送效率。所述的npc1抑制劑通過(guò)促進(jìn)mrna藥物遞送系統(tǒng)的內(nèi)體-溶酶體逃逸來(lái)提高遞送效率。

4、其中，所述的npc1抑制劑為泊沙康唑、u18666a和伊曲康唑中的任意一種或多種的組合；優(yōu)選為泊沙康唑，其具有與晚期內(nèi)體/溶酶體上的跨膜蛋白npc1結(jié)合后抑制和減少mrna遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的作用，提高mrna的內(nèi)體-溶酶體逃逸和遞送表達(dá)。

5、所述的mrna藥物為含mrna藥物的遞送系統(tǒng)，所述的遞送系統(tǒng)為脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒、基于蛋白質(zhì)的類病毒納米顆粒、lipofectamine?3000、或電穿孔遞送系統(tǒng)；優(yōu)選為含mrna藥物的脂質(zhì)納米顆?；蚝琺rna藥物的lipofectamine?3000。

6、其中，所述的含mrna藥物的脂質(zhì)納米顆粒，由載體和包封在載體中的mrna藥物組成；所述的載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)的組合；所述的mrna藥物為mrna疫苗或mrna蛋白替代療法藥物，所述的mrna藥物為依賴于mrna翻譯的mrna藥物。

7、優(yōu)選地，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于4(n,n二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯(dlin-mc3-dma)或((4-羥基丁基)氮雜二烷基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(alc0315)；所述的輔助磷脂包括但不限于1,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dspc)；所述的聚乙二醇脂質(zhì)包括但不限于1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇2000(peg-dmg-2000)。

8、其中，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂質(zhì)和c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑的摩爾比為50:9.6～10:38.1～38.5:1.1～1.5:0.01～0.4。優(yōu)選地，所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂質(zhì)和c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑的摩爾比為50:9.6～10:38.5:1.5:0.01～0.4，進(jìn)一步優(yōu)選地，摩爾比為50:9.6～10:38.5:1.5:0.1～0.4。

9、第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的mrna藥物組合物的制備方法，將c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑和mrna藥物經(jīng)如下任意一種方式進(jìn)行組合得到：直接混合、或包封、或修飾。優(yōu)選地，將c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑和mrna藥物經(jīng)包封的方式進(jìn)行組合得到。包括如下步驟：

10、(1)制備混合物有機(jī)相：將c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑、陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)在有機(jī)溶劑中混合得混合物有機(jī)相；

11、(2)制備mrna藥物水相：將mrna藥物溶于緩沖溶液得mrna藥物水相；

12、(3)將所述的混合物有機(jī)相和所述的mrna藥物水相通過(guò)微流控法混合，得到混合溶液；將混合溶液經(jīng)超濾管超濾，即得。

13、其中，步驟(1)中，所述的有機(jī)溶劑包括乙醇、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正己烷和乙酸乙酯中的任意一種或多種的組合，優(yōu)選為乙醇；所述的混合物有機(jī)相中，陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂質(zhì)和c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑的總濃度為2.85mg/ml。所述的陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇、聚乙二醇脂質(zhì)和c1型尼曼-匹克蛋白抑制劑的混合摩爾比為50:9.6～10:38.1～38.5:1.1～1.5:0.01～0.4；

14、其中，步驟(2)中，所述的緩沖溶液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，離子濃度為10mm，ph為4；所述的mrna藥物水相中，mrna藥物的濃度為0.05mg/ml。

15、其中，步驟(3)中，所述的微流控法混合，混合物有機(jī)相和mrna藥物水相的流速比1:2～10，總流速為8～16ml/min；所述的超濾管的截留分子量為10kda。優(yōu)選地，混合物有機(jī)相和mrna藥物水相的流速比1:3，總流速為12ml/min。

16、第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的mrna藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療疾病的mrna藥物中的應(yīng)用。

17、有益效果：

18、本發(fā)明將npc1抑制劑與mrna遞送系統(tǒng)聯(lián)用制備得到mrna藥物組合物，利用本發(fā)明得到的mrna藥物組合物顯著提高了mrna的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，增加了mrna遞送系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的積累，延長(zhǎng)mrna遞送系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間，使mrna遞送系統(tǒng)從內(nèi)體和溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)而表達(dá)更多效應(yīng)蛋白。本發(fā)明得到的mrna藥物組合物在增強(qiáng)mrna藥物的預(yù)防和治療作用中具有重要的應(yīng)用前景。