本發(fā)明屬于醫(yī)藥，具體涉及一種以靈芝孢子為載體的紫杉醇靈芝孢子油自納米乳復(fù)合微粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、結(jié)直腸癌(colorectal?cancer，crc)是一種常見的源于大腸上皮組織的消化道癌癥，主要發(fā)生在40歲以上中老年人群中，死亡率高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的最重要原因之一，然而，常規(guī)化療或其他口服藥物難以到達淋巴結(jié)，無法有效抑制其中微小轉(zhuǎn)移灶發(fā)生發(fā)展。

2、癌癥的發(fā)生是基因突變和正常細胞調(diào)節(jié)過程改變的結(jié)果，機體自身免疫會產(chǎn)生響應(yīng)并發(fā)生一系列反應(yīng)，包括：腫瘤細胞釋放腫瘤抗原，被樹枝狀細胞捕獲，并將腫瘤抗原呈遞給t細胞，啟動和激活效應(yīng)t細胞對癌癥特異性抗原的反應(yīng)，被激活的效應(yīng)t細胞輸送并浸潤腫瘤病灶，特異性地識別并結(jié)合癌細胞，最終殺死腫瘤細胞；而被殺死癌細胞會釋放更多的腫瘤相關(guān)抗原；上述過程循環(huán)往復(fù)，稱為癌癥免疫循環(huán)。但是，在不進行藥物干預(yù)的情況下，腫瘤部位可能因缺乏抗原及呈遞導(dǎo)致上述過程無法有效啟動并進行運轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致腫瘤不斷發(fā)展并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。

3、紫杉醇(paclitaxel，ptx)是一種從天然短葉紅豆杉樹皮中提取分離得到的四環(huán)二萜類有機化合物，通過破壞微管蛋白與微管之間連續(xù)聚合和解聚的動態(tài)平衡而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用，具有良好的抗腫瘤作用，臨床多以注射劑形式用于多種癌癥的治療。但是，注射給藥給患者帶來了極大的不便并在許多患者中引起超敏反應(yīng)并導(dǎo)致嚴重的副作用，然而紫杉醇水溶性差、滲透性差的特性使其口服制劑的開發(fā)面臨諸多問題；此外，紫杉醇耐藥也是影響其發(fā)揮有效抗腫瘤作用的重要因素之一；因此，通過配伍其他活性組分提高藥物療效并通過制劑改善其溶解和滲透性，將其有效遞送至體內(nèi)是至關(guān)重要的。

4、靈芝孢子油(ganoderma?lucidum?spore?oil，glso)是從中藥靈芝的生殖細胞，即靈芝孢子中提取而得的一種淡黃色至黃色的澄明油狀液體，主要成分包括靈芝三萜及脂肪酸類，具有抑制腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫的作用，其免疫調(diào)節(jié)作用機制與增強巨噬細胞的吞噬能力、增加淋巴細胞數(shù)量、提高cd4+/cd8+t細胞比值、促進樹枝狀細胞成熟和提高體內(nèi)ifn-γ、tnf-α、il-1等細胞因子水平有關(guān)，但靈芝孢子油不易保存、易氧化，其作用效果受其低水溶性影響而受到限制，對于一些特殊人群，還會由于膽汁分泌不足而難以吸收，從而影響其充分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；因此，通過制劑改善其溶解性并促進其有效吸收是充分發(fā)揮其療效的前提。

5、靈芝孢子(ganoderma?lucidum?spore，gls)是中藥靈芝的生殖細胞，具有雙層壁結(jié)構(gòu)的卵形囊狀結(jié)構(gòu)，直徑約5μm。靈芝孢子細胞壁中存在豐富的靈芝β-葡聚糖，其在胃和小腸中不能被消化，到達結(jié)腸部位經(jīng)細菌發(fā)酵而被降解；據(jù)報道，β-葡聚糖以病原相關(guān)分子模式通過被免疫細胞表面所表達的dectin-1、補體受體3(cr3)或toll樣受體(tlrs)等受體選擇性識別，與免疫細胞特異性結(jié)合，從而刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

6、設(shè)計包載多個有效成分的復(fù)合微粒給藥系統(tǒng)，同時遞送化療藥物與免疫調(diào)節(jié)活性組分，是促進癌癥免疫循環(huán)、提高藥物對腫瘤治療效果的有效策略之一。自納米乳化藥物遞送系統(tǒng)(self-nanoemulsifying?drug?delivery?system，snedds)是一種由油相、藥物、表面活性劑構(gòu)成的均一液體，遇水可迅速自發(fā)乳化成納米乳，然后經(jīng)脂解、跨上皮轉(zhuǎn)運，最終以乳糜微粒的形式外排出細胞，進入乳糜管和淋巴系統(tǒng)，從而增加藥物的淋巴轉(zhuǎn)運，提高難溶性藥物的口服生物利用度。利用snedds同時遞送難溶性化療藥物紫杉醇與免疫調(diào)節(jié)活性組分靈芝孢子油，其關(guān)鍵特征為利用發(fā)揮藥效的組分作為制劑所需油相，藥輔合一的同時改善上述兩種藥物組分的溶解性，提高遞送效率。再以改造后的靈芝孢子為天然藥物儲庫，通過真空吸附的方式包載藥物，提高藥物穩(wěn)定性的同時有效避免了紫杉醇和靈芝孢子油在胃中的提前乳化，增加了藥物經(jīng)腸道進入淋巴系統(tǒng)，從而提高對結(jié)直腸癌的治療效果。

7、現(xiàn)有技術(shù)中對于紫杉醇制劑的遞送及其對腫瘤的治療效果也有待進一步研究和提升。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于，提供一種治療結(jié)直腸癌的載紫杉醇靈芝孢子復(fù)合微粒及其制備方法。本發(fā)明制備的載紫杉醇靈芝孢子復(fù)合微?？赏瑫r遞送化療藥物與免疫調(diào)節(jié)活性組分，改善藥物溶解性能，促進藥物經(jīng)口服淋巴轉(zhuǎn)運途徑吸收。

2、所涉及藥物和輔料包括紫杉醇、靈芝孢子油、乳化劑和助乳化劑。

3、其中紫杉醇是臨床公認的化療藥物，具有引起腫瘤細胞免疫原性細胞死亡的作用；靈芝孢子油和靈芝孢子具有刺激免疫的調(diào)節(jié)作用；乳化劑具有膠凝和乳化的特性，可以促使自納米乳在乳化前經(jīng)歷凝膠態(tài)，結(jié)合靈芝孢子多孔負載，可以避免藥物在胃中提前乳化釋放，從而更多的經(jīng)腸道淋巴途徑吸收進入體內(nèi)。

4、申請人利用自乳化給藥系統(tǒng)制備紫杉醇-靈芝孢子油自納米乳，通過篩選合適的乳化劑與助乳化劑，有效改善了兩種藥物的溶解性能。再通過酸、堿多步處理獲得中空多孔但仍保有完整形態(tài)的空白靈芝孢子微粒，通過負壓吸附的方式將載藥自納米乳載入靈芝孢子微粒，從而獲得載紫杉醇的靈芝孢子復(fù)合微粒。

5、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

6、一種載紫杉醇的靈芝孢子復(fù)合微粒，其特征在于，由兩大部分組成：紫杉醇靈芝孢子油自納米乳(pgs)、靈芝孢子(gls)；

7、所述靈芝孢子和紫杉醇靈芝孢子油自納米乳的質(zhì)量比為1:5-10；

8、所述的紫杉醇靈芝孢子油自納米乳包括如下組分：

9、(a)、紫杉醇(ptx)；

10、(b)、靈芝孢子油(glso)；

11、(c)、乳化劑，所述乳化劑選自聚氧乙烯40氫化蓖麻油(rh40)、吐溫80、月桂酰聚氧乙烯-32甘油酯或辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中的一種；

12、(d)、助乳化劑，所述助乳化劑選自單月桂酸丙二醇酯、聚乙二醇400、1,2-丙二醇、二乙二醇單乙醚或丙二醇單月桂酸酯中的一種。

13、所述紫杉醇靈芝孢子油自納米乳中，以質(zhì)量計，ptx含量為0.08-0.64％，glso含量為10-40％，乳化劑含量為27-72％，助乳化劑含量為14-60％，攪拌速度為200-600rpm，得到紫杉醇-靈芝孢子油自納米乳(ptx-glso?smedds，pgs)。

14、pgs平均乳化粒徑為26nm，多分散系數(shù)(pdi)為0.08左右，載藥量(以紫杉醇計)范圍0.15％-1.41％，包封率可高達90.53％。

15、上述載紫杉醇的靈芝孢子復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：

16、(a)、紫杉醇靈芝孢子油自納米乳(pgs)預(yù)濃縮液的制備：

17、稱取處方比例的glso、乳化劑與助乳化劑，室溫下攪拌使其完全混合均勻，得到含glso質(zhì)量含量為10-40％的靈芝孢子油自納米乳預(yù)濃縮液；

18、將處方比例的ptx加入上述預(yù)濃縮液，避光攪拌使其完全溶解并混合均勻，得到pgs。

19、(b)、脫脂靈芝孢子的制備：

20、脫脂處理方法選自溶劑提取法、超聲輔助提取法、超臨界co2提取法、梯度離心法中的一種，下面以溶劑提取法為例作詳細步驟說明：

21、將一定質(zhì)量的靈芝孢子分散于一定體積的丙酮中(控制丙酮與孢子的比例為10-20:1(v/w))，單位為ml/g，攪拌回流8-24h，控制攪拌速度為200-600rpm，控制回流溫度為58-65℃；

22、抽濾除去上述回流混合物中的有機溶劑，并自然晾干。

23、(c)、堿處理靈芝孢子微粒：

24、將脫脂后并自然晾干的靈芝孢子分散于一定濃度的氫氧化鉀溶液中(控制干燥孢子與堿溶液比例為1:20-25(w/v))，氫氧化鉀濃度范圍6-18％；

25、水浴回流攪拌2-6h，水浴溫度70-80℃，攪拌速度200-600rpm；

26、采用3500-4500rpm離心15-20min，棄去上清，用熱蒸餾水洗滌3-6次以除去堿溶性雜質(zhì)。

27、(d)、酸處理靈芝孢子微粒：

28、將堿處理后的靈芝孢子分散于磷酸中(控制孢子與磷酸比例為1:15-1:25(w/v))，磷酸質(zhì)量濃度為80-85％，水浴加熱攪拌2-6h，水浴溫度40-50℃，攪拌速度200-600rpm。

29、(e)、水洗靈芝孢子微粒：

30、將上述孢子磷酸混懸液分散于熱蒸餾水中，控制水溫60-65℃，控制原始孢子質(zhì)量與蒸餾水體積比在1:100～1:120，攪拌至完全混合均勻；

31、采用3500-4500rpm離心15-20min，棄去上清，重復(fù)上述操作3～6次以除去酸溶性雜質(zhì)及殘留磷酸，至上清ph近中性(控制ph?6.0～7.0)。

32、(f)、醇洗靈芝孢子微粒：

33、將上述水洗后的靈芝孢子分散于無水乙醇中(控制孢子與無水乙醇比例為1:10-1:20(w/v))，攪拌至分散均勻；

34、采用3500-4500rpm離心15-20min，棄去上清，重復(fù)上述操作2-4次。

35、(g)、干燥靈芝孢子微粒：

36、將醇洗后的孢子至減壓干燥箱內(nèi)減壓干燥至恒重(控制溫度60-65℃)，即得靈芝孢子空白載體。

37、(h)、藥物負載：真空負壓載藥：

38、藥物負載方法選自真空減壓法、攪拌法和離心法中的一種；

39、優(yōu)選的，所述藥物負載方法選擇真空減壓法，真空減壓法在操作上簡便易行，便于大批量制備，下面以真空減壓法為例作詳細步驟說明；

40、將所述的紫杉醇靈芝孢子油自納米乳預(yù)濃縮液與所述空白靈芝孢子微粒渦旋混合，控制兩者質(zhì)量比為5-10:1；

41、將上述混合物置真空干燥箱中，控制溫度28-32℃，控制壓力-0.01-0.08mpa，保持2-4h；

42、將上述真空負載后的自納米乳、孢子混合物取出，3500-4500rpm離心15-20min，收集下層載藥孢子，用乙醇漂洗孢子表面，置室溫自然晾干，得到載紫杉醇靈芝孢子油自納米乳的靈芝孢子復(fù)合微粒(pgs@gls)。

43、所述得到的pgs@gls需在≤25℃環(huán)境下密封儲存。

44、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

45、(1)將液體自納米乳載入多孔中空的靈芝孢子囊中，面臨的技術(shù)障礙是自納米乳的泄露問題，本發(fā)明所制備的自納米乳采用特定的乳化系統(tǒng)，隨靈芝孢子進入體內(nèi)遇到水環(huán)境之后會呈凝膠態(tài)，有效防止藥物過早從孢子中釋放。

46、(2)藥效方面：本發(fā)明紫杉醇與靈芝孢子油、靈芝孢子的配伍可顯著提高腫瘤組織中：鈣網(wǎng)蛋白的表達，成熟樹突狀細胞的浸潤，并提高腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)cd8+t淋巴細胞和成熟樹突狀細胞的比例。上述鈣網(wǎng)蛋白是引發(fā)免疫原性細胞死亡的標(biāo)志性蛋白(癌癥免疫循環(huán)的起始步驟)，成熟樹突狀細胞起抗原呈遞作用(癌癥免疫循環(huán)的第二步)，cd8+t淋巴細胞是清除腫瘤細胞的重要免疫細胞(癌癥免疫循環(huán)的第三、四步)，共同作用從而促進免疫，增強抗腫瘤效果。

47、(3)基于自納米乳口服吸收特性，通過將紫杉醇靈芝孢子油自納米乳包載于靈芝孢子微囊內(nèi)，藥物可以更緩慢持久地釋放出來，針對性提高了藥物在腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)的濃度，從而提高藥物對腸道腫瘤的治療效果。