本發(fā)明涉及crispr?cas9基因編輯，具體涉及鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯化合物在制備抑制spcas9對(duì)底物結(jié)合或切割產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、1987年ishino等在nucleotide?sequence?of?the?iap?gene，responsible?foralkaline?phosphatase?isozyme?conversion?in?escherichia?coli，andidentification?of?the?gene?product.journal?of?bacteriology?169，5429-5433中研究大腸桿菌(escherichia?coli)的堿性磷酸酶基因時(shí)，首先發(fā)現(xiàn)大量包含規(guī)律間隔的重復(fù)序列，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)和知識(shí)條件的限制，并沒有進(jìn)行進(jìn)一步的研究。直到本世紀(jì)初期，經(jīng)過研究人員的大量后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)這種序列廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中，并將間隔排列的串聯(lián)重復(fù)序列命名為成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered?regularlyinterspaced?short?palindromic?repeats，即crispr)。

2、crispr/cas系統(tǒng)是由crispr陣列和一系列相關(guān)的cas蛋白共同組成的復(fù)雜噬菌體防御機(jī)制。crispr陣列本身由三個(gè)主要部分組成：一個(gè)位于陣列前端的前導(dǎo)序列(leader)、一系列高度保守的重復(fù)序列(repeats)，以及多個(gè)間隔序列(spacers)。前導(dǎo)序列作為crispr陣列的啟動(dòng)子，調(diào)控著crispr基因的表達(dá)，一般位于crispr陣列的起始位置；重復(fù)序列長(zhǎng)度在21～48bp，含有回文序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)(r-loop)；間隔序列則是由外源dna片段整合而來，它們是crispr系統(tǒng)識(shí)別外來遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)。研究人員為了更好的區(qū)分不同的crispr系統(tǒng)，根據(jù)crispr關(guān)聯(lián)蛋白(crispr?associate(cas)proteins)的種類、序列和其在細(xì)菌免疫防御過程中參與的角色，將crispr/cas分為兩類六型(ⅰ-ⅵ)：第一類(class?1)包含ⅰ型、ⅲ型和ⅳ型，需要多個(gè)cas效應(yīng)蛋白組成復(fù)合體才能發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用；第二類(class?2)包含ⅱ型、ⅴ型和ⅵ型，僅需單個(gè)cas效應(yīng)蛋白即能執(zhí)行功能，如ⅱ型crispr/cas系統(tǒng)僅需cas9一個(gè)蛋白，便可有效切割雙鏈dna。正是這種簡(jiǎn)單高效的優(yōu)點(diǎn)賦予了ⅱ型crispr/cas9系統(tǒng)廣闊的發(fā)展空間，其相關(guān)的研究也最為廣泛和深入。根據(jù)權(quán)威臨床試驗(yàn)網(wǎng)站(clinicaltrials)的資料，目前正在進(jìn)行的有關(guān)于crispr/cas9的臨床試驗(yàn)有70項(xiàng)(截止到2024年5月)，治療病種涵蓋了單基因遺傳病、眼科疾病、艾滋病等多個(gè)方面。尤為值得一提的是，就在2023年的12月，由美國(guó)生物技術(shù)公司福泰制藥(vertex?pharmaceuticals，vrtx.us)和瑞士藥企crispr?therapeutics(crspr.us)共同研發(fā)的治療鐮狀細(xì)胞病的基因編輯療法casgevy(基于crispr/cas9系統(tǒng))已經(jīng)先后通過歐洲藥品管理局(ema)和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food?and?drugadministration，fda)的批準(zhǔn)正式上市。

3、crispr/cas9介導(dǎo)的基因組編輯過程大致分為三個(gè)關(guān)鍵階段：首先，cas9蛋白單鏈向?qū)na(single?guide?rna，sgrna)結(jié)合，形成復(fù)合體；其次，該復(fù)合體在sgrna的指引下識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)dna上的特定pam(protospaceradjacent?motif)序列；最后，cas9蛋白切割靶dna，產(chǎn)生雙鏈斷裂(double?strand?breaks，dsb)。crispr系統(tǒng)的不同類型的cas蛋白使用各自特異性的pam序列來確認(rèn)目標(biāo)位點(diǎn)。以crispr/cas9系統(tǒng)為例，其pam序列通常為ngg，其中n可以是任意堿基。在cas9蛋白介導(dǎo)的dna切割后，細(xì)胞會(huì)通過兩種主要的dna修復(fù)機(jī)制來應(yīng)對(duì)dsb：一是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制(non-homologous?end?joining，nhej)，該過程可能導(dǎo)致小的插入或刪除(indels)；二是同源定向修復(fù)(homology?directed?repair，hdr)，后者可以在添加外源性修復(fù)模板的情況下精確修復(fù)dsb。

4、與以往的基因編輯技術(shù)相比，crispr/cas9系統(tǒng)具有多項(xiàng)顯著優(yōu)勢(shì)：首先，它能夠精確且高效地編輯基因組；其次，crispr/cas系統(tǒng)不受物種限制，適用于植物、細(xì)菌、動(dòng)物等多種生物體的基因組編輯；最后，crispr/cas系統(tǒng)有能力同時(shí)編輯基因組上的多個(gè)靶位點(diǎn)。然而，crispr/cas9系統(tǒng)也存在諸多不足，其中之一是dsb后的dna修復(fù)主要依賴nhej，這種修復(fù)機(jī)制在修復(fù)過程中可能產(chǎn)生錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致基因功能的喪失或獲得新的未知功能；另一個(gè)主要問題是脫靶效應(yīng)，即基因編輯工具可能切割錯(cuò)誤的目標(biāo)dna位點(diǎn)，這是基于核酸互補(bǔ)原理的基因編輯技術(shù)難以避免的副作用。隨著crispr/cas系統(tǒng)的應(yīng)用，脫靶效應(yīng)的累積可能導(dǎo)致染色體易位，甚至引發(fā)具有遺傳毒性的突變。

5、為了給臨床應(yīng)用提供一個(gè)良好的、有效的、更具安全性的用藥窗口，同時(shí)為基礎(chǔ)研究提供一個(gè)高效的crispr系統(tǒng)開關(guān)，需要準(zhǔn)確地對(duì)crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行控制，因此crispr/cas9系統(tǒng)抑制劑的開發(fā)就變得尤為重要。目前科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種拮抗crispr/cas9系統(tǒng)的蛋白分子(anti-crispr,acr)，但這些分子對(duì)最常用的cas9蛋白——spcas9(來源于化膿性鏈球菌的cas9)的親和力較低，此外由于acr本質(zhì)是蛋白分子，存在免疫原性強(qiáng)和成藥性差的問題，難以在臨床上推廣。小分子化合物很大程度上能夠克服這兩個(gè)方面的不足，被公認(rèn)為解決這一問題最具潛力的手段。美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的amit?choudhary課題組分別于2019年和2022年在cell和nature?cell?biology上刊發(fā)了兩篇有關(guān)于crispr/cas9的小分子抑制劑的文章：a?high-throughput?platform?to?identify?small-molecule?inhibitors?of?crispr-cas9.cell.2019may.和ageneral?approach?toidentify?cell-permeable?and?synthetic?anti-crispr?small?molecules.nat?cellbiol.2022dec.相繼研發(fā)出了兩個(gè)小分子藥物brd0539和brd7586，但是這兩個(gè)藥物的在體安全性都未經(jīng)過驗(yàn)證，并且合成的工序復(fù)雜，成本較高，這無疑都限制了其下一步的推廣。我們希望從fda批準(zhǔn)的小分子藥物庫中篩選出可以有效控制crispr/(sp)cas9系統(tǒng)的小分子抑制劑，從而規(guī)避之前候選藥物的弊端。鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯未報(bào)道過與底物進(jìn)行結(jié)合或切割的作用，也未報(bào)道過鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯聯(lián)合使用與底物進(jìn)行結(jié)合或切割的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯在制備抑制spcas9對(duì)底物結(jié)合或切割產(chǎn)品中的應(yīng)用。

2、鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯在制備抑制spcas9對(duì)底物結(jié)合或切割產(chǎn)品中的應(yīng)用，鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯中的一種或幾種組合使用；

3、富馬酸二甲酯的濃度為1.56-500μm；

4、鹽酸帕吉林的濃度為1.56-500μm；

5、美他多辛的濃度為12.5-500μm。

6、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品包括任一所述化合物。

7、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品還包括spcas9蛋白。

8、優(yōu)選的，富馬酸二甲酯與spcas9的用量比為0.25-1mmol:5u。

9、優(yōu)選的，美他多辛與spcas9的用量比為0.25-1mmol:5u。

10、優(yōu)選的，富馬酸二甲酯與spcas9的用量比為0.25-1mmol:5u。

11、優(yōu)選的，鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯等質(zhì)量混合。

12、優(yōu)選的，所述產(chǎn)品還包括spcas9蛋白。

13、優(yōu)選的，鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯的總濃度與spcas9蛋白的用量比為0.25-1mmol:5u。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

15、1、本發(fā)明提供了鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯在抑制spcas9對(duì)底物結(jié)合或切割中的應(yīng)用，使得對(duì)“抗crispr-cas9”基因編輯系統(tǒng)有了更加行之有效的控制，通過破壞spcas9與dna的結(jié)合，從而達(dá)到干擾spcas9對(duì)dna進(jìn)行切割的作用。

16、2、鹽酸帕吉林具有明顯的降壓作用，屬單胺氧化酶抑制劑。其降壓機(jī)理尚未完全闡明，可能由于對(duì)單胺氧化酶的抑制，使腎上腺素能神經(jīng)末梢的酪胺的正常代謝發(fā)生變化，產(chǎn)生卜羥酪胺，后者是一種“假介質(zhì)”，與去甲腎上腺素一樣能被貯存、釋放并與受體結(jié)合，但因引起的反應(yīng)較弱，不能起到節(jié)后交感神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)作用，以致血管舒張，血壓下降。其他單胺氧化酶抑制劑如苯乙肼等，亦有降壓作用，但作為降壓藥則因副作用多而無實(shí)際價(jià)值。未報(bào)道過加拉碘銨對(duì)spcas9與底物進(jìn)行結(jié)合或切割時(shí)具有抑制作用。

17、美他多辛是一種水溶性維生素，能加速乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛和酮體經(jīng)腎臟排泄。主要用于急性酒精中毒?？诜笠孜眨渖锢枚葹?0％—80％，口服后1小時(shí)左右血中出現(xiàn)峰濃度。在體內(nèi)分布廣泛，以肝和-腎組織為較高。血液和組織中吡多醇與l-2-吡咯烷酮-5-羧酸依舊保持著相等的比例。血液濃度半衰期40-60分鐘。美他多辛參與γ-谷氨酰循環(huán)而代謝，代謝產(chǎn)物最后從尿(40％-45％)和糞(35％-50％)中排出。

18、富馬酸二甲酯dimethyl?fumarate(dmf)是一種具有口服活性且可透過血腦屏障的nrf2激活劑，可誘導(dǎo)抗氧化劑基因表達(dá)上調(diào)。dimethyl?fumarate通過gsh耗竭/ros升高/mapks激活途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞壞死，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬(autophagy)。dimethyl?fumarate可用于多發(fā)性硬化癥的研究。

19、現(xiàn)有的藥物對(duì)于spcas9的親和力較低，這也就意味著調(diào)控效力并不高，可能無法在體內(nèi)進(jìn)行高水平的調(diào)控，但本技術(shù)提供的藥物已證明可以在安全的條件下進(jìn)入并調(diào)控人體，并且對(duì)spcas9有較高的親和力。

20、3、前期查閱文獻(xiàn)，并未發(fā)現(xiàn)鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯與spcas9結(jié)合對(duì)其結(jié)合或切割底物的能力有顯著的影響，本技術(shù)提供的鹽酸帕吉林、美他多辛和富馬酸二甲酯和幾者聯(lián)合使用在抑制spcas9對(duì)底物結(jié)合或切割中的應(yīng)用，可以延長(zhǎng)spcas9在臨床上的應(yīng)用，增加臨床上用藥的用藥窗口，以提高醫(yī)生對(duì)于spcas9藥物的應(yīng)用方法，來不斷調(diào)整臨床用藥方案。