本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及口服益生菌芽孢制劑領(lǐng)域，特別涉及一種能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、炎癥性腸病(ibd)是一種慢性胃腸道免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，可進一步導(dǎo)致更嚴重和致命的疾病，如殘疾，結(jié)直腸癌等。在全球范圍內(nèi)，ibd的發(fā)病率呈上升趨勢，且疾病難以徹底治愈，需要及時且長期的治療來阻止疾病癥狀及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展，這給世界衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，ibd與腸黏膜屏障功能障礙、免疫功能失調(diào)和細菌微生物群生態(tài)失調(diào)有關(guān)，在腸炎狀態(tài)下，免疫反應(yīng)過度活躍，腸道上皮氧合增加，大量炎癥因子與活性氧(ros)產(chǎn)生。一方面，ros可被兼性厭氧菌利用致使其大量增殖，另一方面，幾乎所有有益的腸道微生物都是專性厭氧的，在氧氣充足和高度炎癥的條件下難以生存，這導(dǎo)致腸道菌群生物多樣性下降，腸道菌群穩(wěn)態(tài)被打破，共生菌如厚壁菌門的比例降低，有害菌如腸桿菌科等兼性厭氧細菌等大量增殖。現(xiàn)有的ibd臨床療法主要側(cè)重于通過緩解腸道炎癥或抑制免疫反應(yīng)來改善疾病相關(guān)癥狀，包括抗炎藥、免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體。然而，由于脫靶副作用、組織毒性和其他意想不到的副作用，這些治療可能會引起嚴重的并發(fā)癥，更重要的是這些手段往往不能解決ibd的根本原因，包括胃腸道粘膜層損傷、腸道屏障功能喪失和腸道共生微生物群失調(diào)。因此，迫切需要一種策略既能清除ros，抑制過度炎癥反應(yīng)，同時又能高效抑制腸桿菌科的好氧過度生長，恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，從根源上治療結(jié)腸炎。

2、益生菌枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)形成的休眠孢子因其能夠抵抗嚴酷的胃腸道(gi)環(huán)境攻擊而受到越來越多的關(guān)注。此外，其可以萌發(fā)生長為益生菌枯草芽孢桿菌，伴隨著氧氣的消耗，可以特異性地限制需氧腸桿菌科的生態(tài)失調(diào)擴張，增加有益菌群的豐度，從而改善腸道微環(huán)境。

3、然而，益生菌芽孢在結(jié)腸炎中的功效具有一些局限性，并不令人滿意。首先，芽孢的體內(nèi)萌發(fā)率極低，僅為1％左右，在結(jié)腸炎的病理環(huán)境中萌發(fā)和存活能力較弱，其ros清除能力可以忽略不計；此外，由于芽孢主要在小腸營養(yǎng)豐富的區(qū)域萌發(fā)，因此缺乏對芽孢在腸道中萌發(fā)位置的控制，這嚴重限制了芽孢在結(jié)腸炎中的治療效果。因此，亟需一種能夠通過提高益生菌芽孢在結(jié)腸炎病理部位的靶向萌發(fā)能力和ros清除活性來優(yōu)化其治療效果的策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有技術(shù)中缺少能夠通過提高益生菌芽孢在結(jié)腸炎病理部位的靶向萌發(fā)能力和ros清除活性來優(yōu)化其治療效果的策略，進而本發(fā)明提供一種能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述益生菌芽孢定點萌發(fā)微球可以被疾病病理微環(huán)境激活，在結(jié)腸部位促進芽孢的定點高效萌發(fā)，為益生菌芽孢治療結(jié)腸炎提供新思路。

2、本發(fā)明構(gòu)建的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球(spzyme+x@d)可制備成口服藥物制劑，用于結(jié)腸炎的精準靶向調(diào)控及治療。本發(fā)明的一些具體實施方式中，通過聚多巴胺-鈀(pda-pd)納米酶在芽孢表面的原位生長構(gòu)建了芽孢納米酶復(fù)合物spzyme；納米酶具有優(yōu)異的ros清除能力，因此納米酶武裝的芽孢有望增強芽孢的ros清除能力及其在病理位點的生長活性。本發(fā)明的一些具體實施方式中，l-丙氨酸(l-ala)作為一種常見的芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑，在靶向結(jié)腸后可以促進芽孢快速有效地萌發(fā)，進一步促進芽孢對結(jié)腸炎的治療效果。另外，得益于微流控共遞送技術(shù)，本發(fā)明將芽孢納米酶和芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑封裝在葡聚糖微球中，用于結(jié)腸靶向遞送。

3、靶向結(jié)腸后，在結(jié)腸中存在的結(jié)腸葡聚糖酶對微球進行緩慢降解的過程中，納米酶可以有效清除結(jié)腸炎部位的ros，從而緩解炎癥。同時，納米酶涂層降解后，暴露出益生菌芽孢，隨后益生菌芽孢在釋放的l-ala的作用下在結(jié)腸部位定點萌發(fā)生長，并迅速耗竭結(jié)腸炎部位的氧氣，從而顯著抑制腸桿菌科有害菌的擴張，并為結(jié)腸其他益生菌的生長提供厭氧環(huán)境，正向調(diào)節(jié)腸道菌群，高效治療結(jié)腸炎。

4、為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

5、本發(fā)明的技術(shù)方案之一，提供了一種能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球，所述益生菌芽孢定點萌發(fā)微球由葡聚糖水凝膠微球(dextran，d)包裹益生菌芽孢納米酶復(fù)合物(spzyme)和芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑(x)所得，命名為spzyme+x@d；所述益生菌芽孢納米酶復(fù)合物spzyme由益生菌芽孢和納米酶構(gòu)成。

6、進一步地，所述益生菌芽孢來自益生菌，所述益生菌選自枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、多發(fā)酵芽孢桿菌和短小芽孢桿菌菌類的一種或多種。

7、進一步地，所述納米酶為抗氧化納米材料，選自聚多巴胺、二氧化鈰、四氧化三錳、鈀金屬、鉑金屬中的一種或多種；

8、在本技術(shù)的一些具體實施方式中，所述納米酶選取聚多巴胺和鈀金屬。

9、進一步地，所述芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑為小分子芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑，選自l-丙氨酸、l-纈氨酸、葡萄糖中的一種或多種。

10、本發(fā)明的技術(shù)方案之二，提供一種上述能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球的制備方法，包括如下步驟：

11、(1)制備益生菌芽孢：將處于對數(shù)生長期的益生菌菌液接種至平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)并純化得到益生菌芽孢；

12、(2)制備益生菌芽孢納米酶復(fù)合物(spzyme)：將(1)得到的益生菌芽孢分散于納米酶溶液中，攪拌后，用無菌水洗去多余的納米酶溶液，得到的sp@y即為益生菌芽孢納米酶復(fù)合物(spzyme)；

13、(3)制備能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球(spzyme+x@d)：將步驟(2)制備的spzyme及甲基丙烯酸化葡聚糖、芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑x、光引發(fā)劑溶于無菌pbs溶液得到內(nèi)相，將油相溶液作為外相，通過微流控裝置制備尺寸均一的單分散液滴；并通過光交聯(lián)反應(yīng)使其固化成微球，得到益生菌芽孢定點益生菌芽孢定點萌發(fā)微球spzyme+x@d。

14、進一步地，步驟(1)中，所述平板培養(yǎng)基為產(chǎn)芽孢瓊脂平板培養(yǎng)基；培養(yǎng)操作具體為36～38℃培養(yǎng)48～96h得到芽孢，并使用histodenz溶液或其他本領(lǐng)域人員認可的方法進行純化，得到益生菌芽孢。

15、進一步地，步驟(2)中，所述納米酶溶液的濃度為0.2～10mg/ml；納米酶溶液的溶劑為tris-hcl或無菌pbs中的任一種；所述益生菌芽孢分散于納米酶溶液中的濃度為106～109cfu/ml；所述攪拌可通過磁力攪拌器進行，攪拌時間為1～2h。

16、在本發(fā)明的一些具體實施方式中，所述納米酶溶液為多巴胺溶液和na2pdcl4溶液；所述多巴胺溶液的濃度為0.2～2mg/ml，溶劑為ph＝8.4～8.6的tris-hcl；所述tris-hcl的濃度為10～20mm；所述na2pdcl4溶液的濃度為1～10mg/ml，溶劑為無菌pbs，所述無菌pbs的濃度為10mm，ph為7.1～7.3；

17、在本發(fā)明的一些具體實施方式中，先將益生菌芽孢分散在多巴胺溶液中，磁力攪拌后用無菌水洗滌，得到sp@pda；再將sp@pda重懸于na2pdcl4溶液中，磁力攪拌后，加入抗壞血酸溶液(抗壞血酸的作用是將pd離子還原成pd納米粒)繼續(xù)攪拌，最終用無菌水洗滌，得到益生菌芽孢納米酶復(fù)合物spzyme；所述抗壞血酸溶液的濃度1～10mg/ml，溶劑為無菌pbs；所述無菌pbs的濃度為10mm，ph為7.1～7.3。

18、步驟(3)最終得到的內(nèi)相溶液中，所述spzyme分散后的濃度為106～109cfu/ml；所述芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑x的濃度為10～100mm；所述甲基丙烯酸化葡聚糖的濃度為80～120mg/ml；所述光引發(fā)劑為苯基-2,4,6-三甲基苯甲?；戊⑺徜?lap)，濃度為1～5mg/ml；所述無菌pbs溶液作為溶劑，濃度為10mm，ph為7.1～7.3。

19、步驟(3)中，所述油相溶液選自石蠟油、二甲基硅油、蓖麻油中的任一種。

20、本發(fā)明的技術(shù)方案之三，提供一種上述能夠在病理微環(huán)境下激活的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球在制備口服微生態(tài)藥物制劑中的應(yīng)用。

21、進一步地，所述口服微生態(tài)藥物制劑的作用部位為腸道；

22、具體地，所述口服微生態(tài)藥物制劑中的益生菌芽孢定點萌發(fā)微球能夠被病理部位的微環(huán)境激活，釋放芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑，激活益生菌芽孢，使之生長為活性益生菌，快速消耗病理部位的氧氣，抑制腸桿菌科有害細菌的生長，同時為結(jié)腸其他益生菌的生長提供厭氧環(huán)境，促進腸道菌群穩(wěn)態(tài)；所述益生菌芽孢定點萌發(fā)微球中的納米酶能高效清除疾病部位高濃度的活性氧，緩解腸道炎癥。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

24、1)本發(fā)明所用的納米酶具有類超氧化物歧化酶(sod)及過氧化氫酶(cat)酶活性，可以高效清除腸炎等炎癥性疾病部位高濃度的活性氧，有效緩解腸道炎癥。

25、2)本發(fā)明所用的益生菌芽孢納米酶復(fù)合物在結(jié)腸部位可以響應(yīng)病理微環(huán)境的過氧化氫，進而葡聚糖水凝膠涂層降解并在芽孢營養(yǎng)萌發(fā)劑的作用下高效萌發(fā)生長為活性益生菌，從而實現(xiàn)益生菌芽孢在結(jié)腸疾病部位的精準定點靶向萌發(fā)。

26、3)萌發(fā)的需氧芽孢桿菌可以快速消耗結(jié)腸部位的氧氣，顯著抑制腸桿菌科有害細菌的生長，同時為結(jié)腸其他益生菌的生長提供厭氧環(huán)境，促進腸道菌群穩(wěn)態(tài)。

27、4)本發(fā)明所用的益生菌芽孢納米酶復(fù)合物通過層層包被工藝制備，制備方法通用簡單，可以快速實現(xiàn)益生菌芽孢的納米酶修飾，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性強。本發(fā)明所制備的微球依托微流控技術(shù)，制備工藝簡單，不需要復(fù)雜的機械加工過程，且單分散性良好。