本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種基于呼吸道霧化的仿生t細(xì)胞分泌型工程菌肺部靶向遞送系統(tǒng)及構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)研究的深入發(fā)展，細(xì)胞因子在腫瘤治療中的應(yīng)用日益廣泛。然而細(xì)胞因子全身性給藥往往伴隨著副作用大、易被免疫系統(tǒng)清除等問題，進而引發(fā)全身性免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)以及影響治療效果，最終影響患者預(yù)后。因此針對肺部疾病局部遞送藥物，依托納米技術(shù)、生物材料技術(shù)和合成生物學(xué)技術(shù)，呼吸道霧化給藥這一方式應(yīng)運而生。據(jù)目前研究報道，利用呼吸道霧化給藥，將負(fù)載萘替芬的納米顆粒遞送至肺部感染區(qū)域，抑制金黃色葡萄球菌抗氧化劑葡萄黃質(zhì)(stx)的生物合成，進而增強中性粒細(xì)胞趨化性作用來有效清除金黃色葡萄球菌。結(jié)果表明有效增加對于金黃色葡萄球菌的殺菌作用，提高小鼠生存率，降低藥物對其他器官和組織的毒副作用。而兼性厭氧工程菌作為一種具備粒徑在0.5?μm-3?μm的活性載體，制備霧化吸入制劑粒徑適宜，吸入后可到達中間氣道及各級支氣管，達到長效滯留的效果。

2、隨著微生物腫瘤防治研究和臨床應(yīng)用的不斷突破，利用合成生物學(xué)技術(shù)改造的可預(yù)測宿主免疫反應(yīng)的工程化微生物制劑取得重要進展。已有研究報道，noxa的線粒體靶向域（mtd）被認(rèn)為是具有抗腫瘤活性的貨物蛋白，研究團隊將編碼mtd的基因合成至具有三型分泌系統(tǒng)的大腸桿菌中，利用其自身的分泌系統(tǒng)，將具有抗腫瘤活性的mtd蛋白分泌到腫瘤部位，進一步提高藥物的抗腫瘤治療療效。

3、利用基因工程技術(shù)，可以實現(xiàn)從分子水平到整體功能層面的定制化工程菌構(gòu)建，其中涉及目的基因的精確分解、創(chuàng)新設(shè)計、精細(xì)組裝及最終構(gòu)建。這些工程菌不僅保留了細(xì)菌本身所攜帶的天然免疫原性分子，如脂多糖（lps）和肽聚糖（pgn），這些分子在健康與疾病狀態(tài)下均對宿主的固有免疫應(yīng)答起著重要作用。例如，通過與nod1/2等固有免疫受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應(yīng)。同時可以通過基因工程技術(shù)，使這些工程菌能夠表達多種具有抗腫瘤潛力的生物活性分子。其中包括細(xì)胞因子，如白介素-12（il-12），它能顯著增強t細(xì)胞的活化與增殖，促進抗腫瘤免疫反應(yīng)；細(xì)胞毒性因子，如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（trail），它能夠特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞；或者表達特定的sirna，如針對pd-1（程序性死亡受體1）的sipd-1?rna，通過rna干擾機制下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的pd-1表達，從而解除免疫抑制，促進t細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷。通過精準(zhǔn)調(diào)控這些生物活性分子的表達，工程菌能夠靶向抗腫瘤免疫反應(yīng)的多個關(guān)鍵步驟，與宿主的固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，共同重塑腫瘤免疫微環(huán)境。不僅增強了工程菌自身的抗腫瘤能力，還促進了機體整體抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活與放大，顯著提高了抗腫瘤療效。

4、盡管工程菌協(xié)同遞送免疫檢查點抑制劑與抑炎細(xì)胞因子能夠增加抗腫瘤效果，但是工程菌給藥后，容易引起體內(nèi)免疫細(xì)胞對其的殺傷與消除，減少工程菌滯留時間，降低工程菌在腫瘤局部的藥物濃度，從而影響其對腫瘤的治療效果。而包覆仿生生物膜，如t細(xì)胞膜、中性粒細(xì)胞膜、紅細(xì)胞膜等，可以使工程菌具有更好的生物相容性和增強免疫逃逸的能力，保護工程菌免受免疫系統(tǒng)的攻擊，延長工程菌在腫瘤組織的滯留時間，降低工程菌的清除率。

5、本技術(shù)人設(shè)想開發(fā)肺臟靶向遞送包覆t細(xì)胞膜分泌細(xì)胞因子的工程菌霧化吸入制劑，以增加抗腫瘤細(xì)胞因子在肺癌組織部分靶向、濃度積累及降低工程菌藥物的全身性免疫治療相關(guān)不良反應(yīng)為目標(biāo)。自體t細(xì)胞膜包被著利用合成生物學(xué)技術(shù)改造后的分泌抗腫瘤細(xì)胞因子白介素-12（il-12）的工程菌活性生物藥，通過乏氧趨向性定植于腫瘤病灶，構(gòu)建具有免疫調(diào)控作用的工程菌霧化制劑。

6、（1）工程菌基于呼吸道霧化制劑使工程菌藥物局部遞送到肺臟，避免藥物的全身性副作用；呼吸道霧化給藥和氣管內(nèi)長滯留促進工程菌肺臟定植，實現(xiàn)局部遞送;（2）工程菌定植于氣管后，通過自身乏氧特性趨向于肺臟腫瘤并定植于腫瘤核心低氧區(qū)，通過改造后的工程菌分泌系統(tǒng)如一型、三型分泌系統(tǒng)，分泌抗腫瘤細(xì)胞因子如白介素-12（il-12），實現(xiàn)工程菌藥物腫瘤靶向和藥物精準(zhǔn)控釋;（3）工程菌利用細(xì)胞膜，如t細(xì)胞膜進行包被，自我偽裝，逃過免疫系統(tǒng)的識別與殺傷，進一步提升工程菌的定植率和延長滯留時間，提高與維持藥物血藥濃度。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于呼吸道霧化工程菌的肺臟局部遞送系統(tǒng)及構(gòu)建方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明首先提供一種基于呼吸道霧化的仿生t細(xì)胞分泌型工程菌肺部靶向遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)包括：工程菌和包覆仿生生物膜。

3、在某些實施例中，所述包覆仿生生物膜選自t細(xì)胞膜、中性粒細(xì)胞膜、紅細(xì)胞膜中的一種或多種。

4、在某些實施例中，所述包覆仿生生物膜為t細(xì)胞膜。

5、在某些實施例中，所述工程菌能夠分泌抗腫瘤細(xì)胞因子白介素-12（il-12）。

6、在某些實施例中，所述工程菌含prsf-j23119-t1ss?hlya-il-12或p15a-j23119-hlyb-hlyd質(zhì)粒。

7、在某些實施例中，所述工程菌含prsf-j23119-t1ss?hlya-il-12和p15a-j23119-hlyb-hlyd質(zhì)粒。

8、在某些實施例中，所述prsf-j23119-t1ss?hlya-il-12和p15a-j23119-hlyb-hlyd質(zhì)粒序列分別如seq?id?no:1、seq?id?no:2所示。

9、在某些實施例中，所述系統(tǒng)經(jīng)冷凍干燥后具有復(fù)溶功能且能實現(xiàn)呼吸道霧化吸入給藥。

10、在某些實施例中，所述含分泌系統(tǒng)工程菌@t細(xì)胞膜包被后工程菌生長情況良好。

11、在某些實施例中，所述含分泌系統(tǒng)工程菌@t細(xì)胞膜粒徑為3-6?μm。

12、本發(fā)明還提供上述的基于呼吸道霧化的仿生t細(xì)胞分泌型工程菌肺部靶向遞送系統(tǒng)的應(yīng)用，所述應(yīng)用為a）或b）中的一種；

13、a）篩選用于治療或預(yù)防肺臟疾病的藥物；

14、b）制備治療或預(yù)防肺臟疾病藥物。

15、本發(fā)明還提供一種基于呼吸道霧化的仿生t細(xì)胞分泌型工程菌肺部靶向遞送系統(tǒng)的制備方法，所述方法包括以下步驟：

16、（1）制備工程菌；

17、（2）制備包覆仿生生物膜；

18、（3）將工程菌和包覆仿生生物膜按比例混合，采用細(xì)胞膜擠膜器微米級大小的生物膜包覆的工程菌顆粒。

19、在某些實施例中，具體方法如下：

20、（1）?構(gòu)建包括一型分泌系統(tǒng)信號肽及分泌結(jié)構(gòu)的?hlya、hlyb、hlyd?和?il-12工程菌株：通過基因合成技術(shù)，分別合成?hlya、hlyb、hlyd?和?il-12?的基因序列，以大腸桿菌dh5α菌株為宿主，利用同源重組技術(shù)進行質(zhì)粒構(gòu)建和擴增。將?hlya?和?il-12?pcr?擴增后序列引入到?prsf?載體上，將?hlyb?和?hlyd?擴增后序列引入到?p15a?載體上，最終將合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到敲除隱蔽質(zhì)粒的大腸桿菌nissle?1917δδ中，分別構(gòu)成工程菌株ecnδδ-a12-bd（含prsf-j23119-t1ss?hlya-il-12及p15a-j23119-hlyb-hlyd質(zhì)粒）。所用引物及基因序列由genewiz,?inc.（中國蘇州）合成。

21、（2）?制備分泌型工程菌@t細(xì)胞膜系統(tǒng)：使用t75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)ctll-2小鼠t細(xì)胞，利用0.25%?pbs溶液四度低滲過夜、反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，1000?rmp/min轉(zhuǎn)速離心10?min后取上清，用高速離心機45000?g/min轉(zhuǎn)速離心40?min后棄上清獲得t淋巴細(xì)胞膜，用100?μl?pbs溶液重懸-80℃保存。利用擠膜器分別使用10?μm、8?μm、5?μm、1?μm的濾膜反復(fù)擠壓批量制備工程菌生物膜包被顆粒。其中以包含分泌系統(tǒng)及il-12?的工程菌混合液菌體數(shù)量為1.0·108?cfu；t淋巴細(xì)胞膜pbs混合液中t細(xì)胞數(shù)量為1.0·107個，兩者數(shù)量比值大約為10?:1。采用細(xì)胞膜擠膜器，該裝置由兩個注射管控制。一般情況下，在t細(xì)胞膜混合液流體剪切工程菌混合液流體的剪切力作用下，工程菌聚液形成均勻的微液滴外層均勻包覆著t細(xì)胞膜。每個大小孔徑的濾膜擠膜次數(shù)在15-20次左右，制備得到微米級大小的生物膜包覆的工程菌顆粒。

22、（3）?構(gòu)建基于呼吸道吸入的工程菌的肺臟局部遞送系統(tǒng)：在構(gòu)建針對肺臟局部遞送的呼吸道吸入工程菌系統(tǒng)時，首先設(shè)定壓蓋型冷凍干燥機（型號scientz-50f/b）的梯度凍干程序，以確保工程菌在保持活性的同時，達到理想的脫水狀態(tài)。此程序逐步降低溫度，具體設(shè)定為初始0℃維持一段時間，隨后降至-20℃并延長凍干時間，最后冷卻至-40℃并繼續(xù)凍干，每個溫度階段的持續(xù)時間分別優(yōu)化為30-60?min、30-240?min、以及30-360?min，以精確控制水分去除速率，最終獲得含水量精確控制在4%-10%范圍內(nèi)的凍干工程菌顆粒。為了將這些凍干后的工程菌顆粒有效遞送至肺臟，采用呼吸道霧化吸入的方式。將凍干粉均勻分散于生理鹽水中，以恢復(fù)其一定的分散性和懸浮性。隨后，對商品化的霧化機（型號家瑞康jln-2311hdd）進行了適應(yīng)性改造，通過調(diào)整霧化參數(shù)，如氣流速度、霧化室壓力等，確保生成的工程菌顆粒氣溶膠粒徑分布適合小動物模型的呼吸系統(tǒng)特征，從而實現(xiàn)高效且安全的肺臟局部遞送。

23、而且，所述步驟（3）中使用梯度凍干和霧化吸入平臺將制備的粒徑均一的含分泌型工程菌@t細(xì)胞膜微粒經(jīng)呼吸道吸入實現(xiàn)工程菌的肺臟局部遞送。

24、本發(fā)明最后提供上述的基于呼吸道霧化的仿生t細(xì)胞分泌型工程菌肺部靶向遞送系統(tǒng)的制備方法的應(yīng)用，所述應(yīng)用為制備治療或預(yù)防肺臟疾病藥物。

25、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，至少具有如下有益效果：

26、1、本發(fā)明創(chuàng)新性地提出了一種基于呼吸道吸入的工程菌肺臟局部遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)核心在于整合了具備一型分泌系統(tǒng)的工程菌@t細(xì)胞仿生顆粒。這些仿生顆粒展現(xiàn)出高度均一的形貌與優(yōu)異的分散性能，確保了其在呼吸道及肺臟內(nèi)的有效分布與沉積。更為關(guān)鍵的是，本系統(tǒng)中的工程菌被巧妙地嵌入了特定的分泌系統(tǒng)基因，這一設(shè)計使得工程菌能夠在肺臟局部精準(zhǔn)地釋放外源性抗腫瘤細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子能夠直接作用于肺臟病變區(qū)域，如肺癌病灶或肺部炎癥部位，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制腫瘤生長或促進組織修復(fù)等多種機制，實現(xiàn)對肺臟疾病的顯著緩解與有效治療。

27、2、本發(fā)明系統(tǒng)核心在于利用攜帶一型分泌系統(tǒng)工程菌@t細(xì)胞膜的仿生顆粒，通過呼吸道吸入實現(xiàn)局部遞送。這一創(chuàng)新策略確保了工程菌仿生顆粒能夠精準(zhǔn)地定植于肺臟病灶部位，與肺臟黏膜免疫系統(tǒng)形成緊密的相互作用，觸發(fā)協(xié)同應(yīng)答機制。工程菌仿生顆粒上的t細(xì)胞膜不僅保證了其優(yōu)異的靶向性和穿透性。還促進了與肺臟局部免疫細(xì)胞的識別和融合，從而實現(xiàn)了外源工程菌藥物在宿主肺臟部位的靶向有效定植。在提高藥物的生物利用度的同時，還減少了非靶向組織的暴露，降低了潛在的副作用，實現(xiàn)治療作用的時空精準(zhǔn)性，有助于增強免疫系統(tǒng)的抗腫瘤或抗炎能力，在特定時間和空間內(nèi)抑制疾病的進展，最大程度地預(yù)防肺臟疾病的復(fù)發(fā)、促進原位治療的效果，并有效抑制病程的發(fā)展。

28、3、本發(fā)明基于呼吸道吸入工程菌肺臟局部遞送系統(tǒng)通過局部定位、精準(zhǔn)分泌、肺臟黏膜免疫系統(tǒng)協(xié)同應(yīng)答實現(xiàn)外源工程菌藥物對肺臟疾病的復(fù)發(fā)預(yù)防、原位治療和病程抑制。本發(fā)明創(chuàng)新性地將“合成生物學(xué)-細(xì)胞膜包覆技術(shù)”有機融合，開發(fā)了一套可實現(xiàn)外源工程菌藥物在宿主肺臟內(nèi)靶向有效定植的新策略?；蚋脑旌蟮墓こ叹鷶y帶了優(yōu)化后的分泌系統(tǒng)，能夠精確控制治療因子的釋放，還利用先進的細(xì)胞膜包覆技術(shù)，使工程菌表面覆蓋有與目標(biāo)肺臟細(xì)胞具有高度親和力的細(xì)胞膜（如t細(xì)胞膜），從而顯著提升其在肺臟病灶區(qū)域的定位準(zhǔn)確性和定植效率。工程菌成功定植于肺臟后，其攜帶的精準(zhǔn)分泌系統(tǒng)將根據(jù)預(yù)設(shè)程序，在適當(dāng)?shù)臅r間和空間內(nèi)釋放協(xié)同治療因子。這些治療因子與肺臟黏膜免疫系統(tǒng)緊密互動，激活并增強局部免疫反應(yīng)，進而實現(xiàn)對肺臟疾病的針對性治療。此過程不僅提高了治療效果，還最大限度地減少了藥物對非靶組織的潛在影響。

29、4、本發(fā)明含分泌型工程菌@t細(xì)胞膜遞送系統(tǒng)可實現(xiàn)智能化、精準(zhǔn)化、可視化和無創(chuàng)化的外源工程菌藥物高效遞送；利用梯度凍干技術(shù)和先進的霧化吸入技術(shù)，遞送外源工程菌，實現(xiàn)外源工程菌藥物在宿主肺臟的局部遞送，實現(xiàn)工程菌藥物的病灶靶向定植；利用精準(zhǔn)的細(xì)胞膜包覆技術(shù)，減少免疫細(xì)胞的監(jiān)視與殺傷，提高工程菌的定植效率；合成生物學(xué)改造優(yōu)化后的工程菌分泌系統(tǒng)，可以進一步協(xié)同實現(xiàn)外源工程菌藥物發(fā)揮免疫調(diào)控的時空精準(zhǔn)性。