本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥。更具體地，涉及乳酸桿菌來源的胞外囊泡在預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甲型流感病毒(influenza?a?virus，iav)可引起人畜共患呼吸道感染性疾病，對人類健康造成巨大威脅。感染的主要癥狀包括咳嗽、發(fā)熱和頭痛。此外，成人和兒童患者都會出現(xiàn)胃腸道癥狀，包括嘔吐和腹瀉。研究報道流感病毒感染小鼠后，免疫損傷不僅表現(xiàn)在肺，而且特別表現(xiàn)在小腸。目前防控流感最有效的手段是接種疫苗，但是流感病毒通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)移持續(xù)變異，需要持續(xù)研制疫苗并且每年進行免疫。另外流感疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)在許多受試者中效果并不是最佳，特別是在處于嚴重流感風(fēng)險中的年幼兒童和老年人中，進一步降低了流感疫苗的保護作用。藥物是防控流感的第二道防線。目前臨床抗流感病毒藥物均以病毒的重要蛋白為作用靶點，流感病毒的高度變異性導(dǎo)致極易產(chǎn)生耐藥毒株，使藥物無效。并且服用奧司他韋/瑪巴洛沙韋等抗病毒藥物后可能會引起惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等胃腸道不良反應(yīng)。研究表明，過度的天然免疫反應(yīng)與流感病毒感染的發(fā)病嚴重程度和死亡率增加密切相關(guān)。機體的過度免疫應(yīng)答，包括免疫細胞浸潤和細胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生，可導(dǎo)致肺腸免疫病理損傷，引起急性呼吸窘迫綜合癥甚至多器官衰竭與死亡?？共《舅幬镏委煙o法控制流感感染導(dǎo)致的劇烈炎癥反應(yīng)。因此，靶向過激炎癥反應(yīng)以減輕肺腸病理損傷的治療策略是救治流感重癥的關(guān)鍵。開發(fā)同步治療流感肺腸損傷對新型藥物是當(dāng)前臨床上亟待解決的問題。

2、細胞外囊泡(又稱胞外囊泡，extracellular?vesicles，evs)由生命所有領(lǐng)域的物種產(chǎn)生，并在調(diào)節(jié)生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。益生菌evs是益生菌分泌的一類微小膜泡結(jié)構(gòu)，可介導(dǎo)益生菌的有益作用，同時將消耗活微生物的潛在風(fēng)險降至最低。越來越多的證據(jù)表明，益生菌evs可調(diào)節(jié)宿主的固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。lactobacillus?reuteri是一種重要的益生菌，其evs具有多種生物活性，能夠在宿主健康中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同來源的lactobacillus?reuteri外囊泡在功能上存在顯著差異，這主要體現(xiàn)在對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、抗菌活性、抗炎作用等方面。如lactobacillus?reuteri?atcc?pta?5289的外囊泡(uspatent?no.10,568,935b2?probiotic?compositions?for?oral?health)具有顯著的抗菌活性，能夠抑制口腔中病原菌的生長。lactobacillus?reuteri?sd2112的外囊泡在促進皮膚健康和減少皮膚炎癥方面具有獨特的優(yōu)勢。然而，目前能夠同步治療流感病毒介導(dǎo)的肺、腸損傷的evs治療藥物仍十分有限且大多處于研究階段。

3、因此，開發(fā)同步治療流感肺、腸損傷的新型藥物是當(dāng)前臨床上亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有抗流感病毒藥物會引起惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等胃腸道不良反應(yīng)，對腸道癥狀無治療作用，不同來源的外囊泡基藥物在功能上存在顯著差異，并且主要體現(xiàn)在對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、抗菌活性、抗炎作用等方面的缺陷和不足，提供乳酸桿菌來源的胞外囊泡在預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的是提供一種胞外囊泡。

3、本發(fā)明另一目的是提供一種預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷的藥物。

4、本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

5、本發(fā)明保護乳酸桿菌來源的胞外囊泡在預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷中的應(yīng)用，所述乳酸桿菌為lactobacillus?reuteri(羅伊氏乳桿菌)eha2菌株，已于于2019年9月2日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc?no：60758。

6、優(yōu)選地，所述療肺損傷為流感病毒感染介導(dǎo)的肺損傷。

7、優(yōu)選地，所述腸損傷為流感病毒感染介導(dǎo)的腸損傷。

8、上述乳酸桿菌來源的胞外囊泡(lrevs)為從羅伊氏乳酸桿菌eha2的培養(yǎng)液中提取得到，具備納米尺寸的雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu)。所述lrevs同步減小感染流感病毒的機體的肺部與小腸組織中促炎因子的過度分泌，減輕病理損傷；并且同步調(diào)節(jié)機體肺部與小腸中固有淋巴細胞亞群失衡與活化，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，延緩機體體重下降，提高機體存活率。即該lrevs具有一藥雙靶特性，表現(xiàn)為同步對流感病毒介導(dǎo)的肺損傷與腸損傷有顯著的治療效果，能夠用于開發(fā)藥物或健康功能食品，以減輕、預(yù)防和/或治療由流感病毒感染介導(dǎo)的肺損傷和/或腸損傷。

9、進一步地，所述流感病毒為甲型流感病毒。

10、更進一步地，所述甲型流感病毒包括h1n1流感病毒。

11、具體地，所述h1n1流感病毒為a/puerto?rico/8/34h1n1流感病毒，即pr8流感病毒。

12、本發(fā)明保護一種胞外囊泡，所述胞外囊泡使用乳酸桿菌制備得到，所述乳酸桿菌為羅伊氏乳桿菌eha2菌株，已于于2019年9月2日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc?no：60758。

13、進一步地，所述種胞外囊泡的制備方法包括如下步驟：制備乳酸桿菌的擴大培養(yǎng)液，收集所得培養(yǎng)液進行第一次離心，收集上清液進行第一次微濾，取微濾液進行超濾，取超濾液進行第二次離心，取上清液進行第二次微濾，收集微濾液進行超速離心，取沉淀物進行洗滌，即得胞外囊泡。

14、進一步地，所述乳酸桿菌的擴大培養(yǎng)液的制備包括如下步驟：采用mrs固體培養(yǎng)基活化菌種于厭氧條件下中37℃無菌靜置培養(yǎng)36～48h，然后采用mrs液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)36～48h，即得。

15、進一步地，所述超速離心的速度為100000g或以上。

16、進一步地，所述第一次離心的條件為(0～8)℃，(10,000～16000)g、(15～30)

17、min。在離心條件中，g在此處是被用作一個相對離心力的度量單位，表示離心力的大小。在離心過程中，樣品所受到的離心力是由離心機的轉(zhuǎn)速和離心半徑共同決定的。為了方便比較不同離心條件下的離心力大小，人們引入了相對離心力(rcf，relativecentrifugal?force)的概念，并將其單位定義為g。這里的g實際上是一個無量綱的單位，它表示的是樣品在離心過程中所受到的離心力與地球表面重力加速度的比值。

18、進一步地，所述第二次離心為進行兩次離心，先低速進行離心，取上清夜再進行高速離心，所述低速離心的條件為(0～8)℃、(3，000～5000)g、(15～30)min，所述高速離心的條件為(0～8)℃、(10，000～15000)g、(15～30)min。

19、進一步地，所述超濾的濾膜的截留分子量為80～120kd，更優(yōu)選為100kd

20、進一步地，所述第一次微濾和第二次微濾的濾膜的孔徑大小為0.22μm。

21、進一步地，所述洗滌為使用pbs(phosphate?buffered?saline)溶液洗滌。

22、具體地，作為一種可選的方式，所述種胞外囊泡的制備方法包括如下步驟：

23、s1.采用mrs固體培養(yǎng)基活化菌種于厭氧工作站中37℃無菌靜置培養(yǎng)48h，然后采用mrs液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)36h，得培養(yǎng)液；

24、s2.收集步驟s1所得培養(yǎng)液，于4℃下15,000g離心25min，收集上清液然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾；過濾液經(jīng)amicon超濾系統(tǒng)在100kd濾膜進行濃縮，濃縮液漩渦混勻分別于4℃、4，000g和12,000g離心20min，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾，收集濾液，于超速離心機經(jīng)4℃、160,000g離心100min，去除上清液，保留沉淀物，沉淀用無菌pbs清洗三次后，即得胞外囊泡。

25、進一步地，所述胞外囊泡呈現(xiàn)橢圓形，具備雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu)。

26、進一步地，所述胞外囊泡的粒徑分布主要在50～200nm之間，粒徑峰值為99nm。

27、本發(fā)明保護一種預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷的藥物，所述藥物包括所述胞外囊泡和藥學(xué)上可接受的輔料。

28、優(yōu)選地，所述肺損傷和/或腸損傷為流感病毒感染介導(dǎo)的肺損傷和/或腸損傷。

29、優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型流感病毒。

30、更進一步地，所述甲型流感病毒包括h1n1流感病毒。

31、具體地，所述h1n1流感病毒為a/puerto?rico/8/34h1n1流感病毒，即pr8流感病毒。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

33、本發(fā)明所述乳酸桿菌來源的胞外囊泡(lrevs)為從羅伊氏乳酸桿菌的培養(yǎng)液中提取得到，具備納米尺寸的雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu)。所述lrevs通過口服吸收后擴散至肺組織和腸道組織，同步減少機體的肺部與小腸組織中促炎因子的過度分泌，減輕病理損傷；并且同步調(diào)節(jié)機體肺部與小腸中固有淋巴細胞亞群失衡與活化，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)，延緩機體體重下降，提高機體存活率。即該lrevs具有一藥雙靶特性，表現(xiàn)為同步對肺損傷與腸損傷(尤其為流感病毒感染介導(dǎo)的肺損傷與腸損傷)有顯著的治療效果。因此本發(fā)明的lrevs能夠用于開發(fā)藥物或健康功能食品，以預(yù)防和/或治療肺損傷和/或腸損傷。