本發(fā)明屬于生物納米藥物，涉及自噬小體腫瘤抗原的研究和一類共載自噬小體蛋白和免疫佐劑的抗腫瘤納米疫苗的研制和應(yīng)用研究。

背景技術(shù)：

1、腫瘤疫苗是一種突破性的癌癥免疫治療方法，旨在激發(fā)并增強針對腫瘤抗原（ag）的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，最終消除腫瘤細胞。近年來，腫瘤疫苗將腫瘤特異性抗原與免疫佐劑共同遞送至抗原呈遞細胞（apcs），特別是樹突狀細胞（dcs），以誘發(fā)特異性的腫瘤免疫反應(yīng)。大量研究致力于利用在腫瘤中異常表達的自身抗原，即腫瘤相關(guān)抗原（taas）來定制疫苗。然而，使用腫瘤細胞衍生物如細胞裂解液、細胞衍生納米囊泡或提取的細胞膜作為taas在抗腫瘤免疫反應(yīng)方面遇到了挑戰(zhàn)，這主要歸因于這些抗原的免疫原性有限。此外，自體腫瘤細胞衍生的疫苗需要進行腫瘤切除，這不僅限制了在無法切除腫瘤的情況下對腫瘤抗原的獲取，還增加了轉(zhuǎn)移的風險，成為臨床應(yīng)用的限制。

2、自噬是在所有真核生物中嚴格調(diào)控和應(yīng)激誘導的一種分解代謝通路，在抗原呈遞和激發(fā)宿主細胞免疫方面發(fā)揮著重要作用。盡管來源于腫瘤細胞的自噬小體疫苗（traps）能夠促進免疫增強，仍然存在一些局限性，例如traps的粒徑較大對于內(nèi)吞作用并不理想，且其對淋巴結(jié)的靶向能力較差。因此，將抗原和佐劑有效遞送到淋巴結(jié)，增強抗原交叉呈遞從而刺激可控且強有力的腫瘤特異性t細胞反應(yīng)，成為一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是公開一種仿生自噬小體（baps）的腫瘤納米疫苗及其制備方法與應(yīng)用，具體為一種共載自噬小體來源的腫瘤抗原和免疫佐劑的仿生納米腫瘤疫苗及其制備方法，以及其在腫瘤尤其是實體瘤治療中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

3、一種仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗，包括兩親性嵌段聚合物及所述兩親性嵌段聚合物裝載的免疫佐劑和自噬小體蛋白，其中，所述自噬小體蛋白與腫瘤相關(guān)。

4、一種藥物，其活性成分包括上述仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗；進一步的，還可以包括其他活性成分。其他活性成分是指除了上述仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗，其他能夠?qū)δ[瘤防治發(fā)揮效果的成分，比如免疫檢查點抑制劑或細胞因子。

5、本發(fā)明公開了上述仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗的制備方法，包括以下步驟，以免疫佐劑、自噬小體蛋白、兩親性嵌段聚合物為原料，制備仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗。

6、本發(fā)明仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗可以有效發(fā)揮防治腫瘤的作用，還可以與免疫檢查點抑制劑或細胞因子等聯(lián)用，協(xié)同發(fā)揮防治腫瘤的作用，如與細胞毒性t淋巴細胞相關(guān)蛋白4抗體（anti-ctla-4）、抗程序性細胞死亡受體配體?1（anti-pd-l1）、抗程序性細胞死亡受體1（anti-pd-1）、白介素15（il-15）、il-2等中的一種或幾種聯(lián)用。

7、本發(fā)明中，自噬小體蛋白為自噬小體裂解物或者基因工程蛋白產(chǎn)物；其中，自噬小體來自腫瘤細胞培養(yǎng)上清，或者自噬小體來自移轉(zhuǎn)患者腹水和/或胸腔積液。自噬小體從腫瘤細胞培養(yǎng)上清或者在腫瘤?移轉(zhuǎn)的患者腹水和胸腔積液中獲取自噬小體。具體的，從腫瘤細胞培養(yǎng)上清中獲取自噬小體時對腫瘤細胞進行自噬誘導，例如利用自噬誘導劑、乏氧等，將獲得的自噬小體經(jīng)離心或磁珠分選等方式富集。自噬小體蛋白的獲取操作為常規(guī)技術(shù)，可以采用裂解液，比如np-40、ripa等；也可以采用凍融的方法，比如液氮凍融法，從自噬小體獲得豐富的自噬小體蛋白作為腫瘤抗原。

8、本發(fā)明中，所述免疫佐劑包括toll樣受體激動劑、nod樣受體激動劑、sting激動劑中的一種或幾種。

9、本發(fā)明仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗中，優(yōu)選自噬小體蛋白為腫瘤細胞自噬小體的裂解物；優(yōu)選免疫佐劑為cpg寡脫氧核苷酸、polyic、adu-s100等。自噬小體蛋白與免疫佐劑的投料質(zhì)量比為1:（0.1～8），優(yōu)選的投料質(zhì)量比為1:（3～8），更優(yōu)選的投料質(zhì)量比為1:（5～8）。投料比中，佐劑的量指所有免疫佐劑的總量。進一步的，當佐劑為兩種時，兩種佐劑的質(zhì)量比為1∶（1～8），優(yōu)選為1∶（2～5）。

10、本發(fā)明中，兩親性嵌段聚合物為親水鏈段-p(a-dtc)-陽離子片段。兩親性嵌段聚合物由親水鏈段、疏水鏈段以及陽離子片段組成，親水鏈段為聚乙二醇鏈段（peg），優(yōu)選的，peg的數(shù)均分子量為2000～12000?da，優(yōu)選的分子量為3000～8000?da；疏水鏈段是無規(guī)共聚鏈段，表示為p(a-dtc)?，其分子量為親水鏈段分子量的2～10倍，優(yōu)選2～6倍；其中，a包括酯單體、碳酸酯單體，優(yōu)選的，a為環(huán)酯單體、環(huán)碳酸酯單體等，比如三亞甲基碳酸酯單體tmc、丙交酯單體la、己內(nèi)酯單體cl等；pdtc為聚二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯，?pdtc鏈段的分子量為疏水鏈段總分子量的5%～40%，優(yōu)選10～30%。陽離子片段包括聚乙酰亞胺pei和精胺sp等，其分子量為100～3000?da，優(yōu)選為精胺。

11、本發(fā)明公開了上述仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗、藥物在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用。其中，所述腫瘤為實體瘤或血液瘤，優(yōu)選實體瘤，比如淋巴瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌等，尤其是在預(yù)防和/或治療結(jié)腸癌中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明公開的抗腫瘤用共載自噬小體蛋白和免疫佐劑的仿生納米腫瘤疫苗包括兩親性嵌段聚合物及所述兩親性嵌段聚合物裝載的免疫佐劑和自噬小體蛋白，以自噬小體來源的自噬小體蛋白為腫瘤抗原；兩親性嵌段聚合物形成的聚合物囊泡裝載免疫佐劑和腫瘤抗原；所述兩親性嵌段聚合物為親水鏈段-p(a-dtc)-陽離子片段。其中，所述免疫佐劑包括toll樣受體激動劑、nod樣受體激動劑、sting激動劑中的一種或幾種；所述自噬小體蛋白為腫瘤自噬小體的裂解物。

13、本發(fā)明仿生自噬小體的腫瘤納米疫苗由兩親性嵌段聚合物組裝并交聯(lián)得到，其具有不對稱膜結(jié)構(gòu)，外殼為聚乙二醇（peg），膜層為可逆交聯(lián)的疏水聚碳酸酯，內(nèi)層為精氨（sp）；可以與免疫佐劑和自噬小體蛋白通過靜電作用結(jié)合，從而實現(xiàn)佐劑和抗原的高效穩(wěn)定裝載。

14、本發(fā)明中，仿生納米腫瘤疫苗可以與免疫檢查點抑制劑或細胞因子等聯(lián)用，如細胞毒性t淋巴細胞相關(guān)蛋白4抗體（anti-ctla-4）、抗程序性細胞死亡受體配體?1（anti-pd-l1）、抗程序性細胞死亡受體1（anti-pd-1）、白介素15（il-15）、il-2等。

15、本發(fā)明中，從腫瘤細胞培養(yǎng)上清或者在移轉(zhuǎn)患者腹水和胸腔積液中獲取自噬小體。其中，從腫瘤細胞培養(yǎng)上清中獲取自噬小體需對腫瘤細胞進行自噬誘導，例如利用自噬誘導劑、乏氧等，將獲得的自噬小體經(jīng)離心或磁珠分選等方式富集，具體為現(xiàn)有技術(shù)。自噬小體裂解物的獲取操作為常規(guī)技術(shù)，可以采用裂解液，比如np-40、ripa等；也可以采用凍融的方法，比如液氮凍融法，獲得出豐富的自噬小體蛋白作為腫瘤抗原。

16、自噬小體中含有更廣泛的腫瘤特異性抗原，從而激活腫瘤細胞上的主要組織相容性復合體i類（mhc-i），增強免疫應(yīng)答。研究表明，來源于腫瘤細胞的自噬小體疫苗（traps）富含自噬小體包載的細胞蛋白、缺陷核糖體產(chǎn)物（drips）、短生存期蛋白（slips）以及表面標志物，在介導腫瘤免疫反應(yīng)方面表現(xiàn)出比來源于腫瘤細胞的疫苗更高的效力。更重要的是，traps可以從癌癥患者的胸腔積液和腹水中提取。

17、本發(fā)明的仿生納米腫瘤疫苗，經(jīng)皮下給藥后，具有自發(fā)靶向淋巴結(jié)作用，有效促進抗原呈遞細胞特別是dc的成熟。具有生物活性的免疫佐劑和自噬小體蛋白在雙硫交聯(lián)的囊泡內(nèi)腔中，可避免在輸送過程中泄露而造成損失，并在細胞內(nèi)還原劑谷胱甘肽（gsh）的作用下，雙硫鍵迅速斷裂釋放活性成分，有效激活dc。進一步的，dc促進細胞毒性t淋巴細胞（ctl）對腫瘤抗原識別作用，提高對腫瘤細胞的特異性殺傷。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

19、1.?本發(fā)明提取腫瘤抗原源于腫瘤自噬小體，與傳統(tǒng)的腫瘤細胞/組織裂解物相比具有更強的免疫原性，仿生納米腫瘤疫苗對于刺激dc成熟和抗原提呈的效果更強，在荷瘤小鼠體內(nèi)具有更好的療效，解決了腫瘤疫苗抗原免疫原性低的問題。

20、2.?本發(fā)明設(shè)計了一種共載腫瘤抗原和免疫佐劑的仿生納米腫瘤疫苗，實現(xiàn)免疫佐劑和腫瘤抗原的高效穩(wěn)定裝載以及淋巴結(jié)的靶向富集，從而有效解決生物活性分子易受酶解和細胞攝取效率低下的問題。該囊泡膜采用可逆交聯(lián)的生物可降解聚合物ptmc，且其側(cè)鏈設(shè)計為雙硫戊環(huán)，提供了還原敏感的可逆交聯(lián)特性。這種設(shè)計不僅能夠確保藥物在血液中的長時間循環(huán)，還能夠在細胞內(nèi)迅速降解，從而有效釋放免疫佐劑和腫瘤抗原至dc中。

21、3.?本發(fā)明公開的仿生納米腫瘤疫苗在體內(nèi)外均表現(xiàn)出顯著的dc激活效果。該疫苗能夠同時釋放腫瘤抗原和免疫佐劑于dc中，不僅促進了dc的成熟，還提升了抗原呈遞的效率，從而增強了ctl的增殖及腫瘤的浸潤。其在體內(nèi)展現(xiàn)出高效的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤的發(fā)生，并促使腫瘤完全消退。所有接受治療的小鼠均獲得了持久的免疫記憶，能夠全面抑制腫瘤的復發(fā)。此外，該仿生納米腫瘤疫苗也可作為預(yù)防性腫瘤疫苗，對于腫瘤有顯著預(yù)防效果，擴大了抗腫瘤效應(yīng)的適用范圍。

22、4.?本發(fā)明公開的仿生納米腫瘤疫苗可以與臨床常用的免疫檢查點抑制劑或細胞因子等聯(lián)用，對“冷腫瘤”也有較好的治療效果，為腫瘤的高效免疫治療提供新的研究思路。