本發(fā)明涉及基因編輯結(jié)果檢測(cè)，具體涉及一種用于基因編輯材料檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

1、基因編輯結(jié)果的檢測(cè)主要包括基于sanger測(cè)序的擴(kuò)增子檢測(cè)以及基于二代測(cè)序(next-generation?sequencing，ngs)的擴(kuò)增子檢測(cè)。sanger測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)700到1000bp長(zhǎng)度大小的片段，且其準(zhǔn)確率高，因此sanger測(cè)序是目前基因型檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，各種基于sanger測(cè)序的突變分析軟件也相繼得到開發(fā)，如tide、ice、dsdecode等。但sanger測(cè)序一次只能檢測(cè)一個(gè)樣品，對(duì)于大規(guī)模樣本的基因型鑒定，其效率低，測(cè)序成本較高，且對(duì)于復(fù)雜的突變類型以及多倍體樣品，sanger測(cè)序難以檢測(cè)其結(jié)果，無(wú)法滿足目前各種科學(xué)研究對(duì)編輯材料基因型檢測(cè)的各種需求。2006年，ngs技術(shù)的發(fā)展解決了sanger測(cè)序通量低且無(wú)法檢測(cè)復(fù)雜突變類型的問題。其原理為將dna片段打斷后接上接頭，并固定在芯片上，通過添加含有熒光信號(hào)的dntp進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)從而確定目的樣品的基因型。長(zhǎng)片段測(cè)序也稱為第三代測(cè)序技術(shù)(third-generationsequencing,tgs)，主要分為單分子熒光測(cè)序技術(shù)以及納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)10kb以上的片段，對(duì)基因組大范圍的片段進(jìn)行覆蓋測(cè)序，因此能對(duì)大片段刪除、平鋪刪除等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析。即使長(zhǎng)片段測(cè)序在測(cè)序過程中會(huì)產(chǎn)生各種錯(cuò)誤，但能通過測(cè)序深度進(jìn)行校正，從而使其測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)99％以上。對(duì)于長(zhǎng)片段測(cè)序技術(shù)，目前主要用于樣本的基因組組裝、甲基化檢測(cè)、基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)等方面，而未充分應(yīng)用到基因編輯變異類型分析中。

2、目前各種測(cè)序技術(shù)已十分成熟，且各種技術(shù)的不足能夠互相彌補(bǔ)，成本也越來(lái)越低，這為基因編輯檢測(cè)提供了便利。但目前缺乏一種可以對(duì)大批量樣本進(jìn)行建庫(kù)的方法，使得對(duì)大批量基因編輯樣本的檢測(cè)需要花費(fèi)較高的成本和時(shí)間。同時(shí)，分析測(cè)序結(jié)果需要一定的生物信息分析能力以及一定的計(jì)算機(jī)編程能力，而且需要學(xué)習(xí)不同軟件的使用方法等，這將耗費(fèi)大量的時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于基因編輯材料檢測(cè)的方法，該方法可快速對(duì)大批量樣本的基因編輯結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，全方面檢測(cè)基因編輯材料中所有類型的突變，同時(shí)方便不熟練運(yùn)用各種計(jì)算機(jī)編程語(yǔ)言的科研人員能夠短時(shí)間內(nèi)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2、一種用于基因編輯材料檢測(cè)的方法，包括：

3、構(gòu)建多種特異性識(shí)別序列；

4、根據(jù)所述特異性識(shí)別序列對(duì)基因片段進(jìn)行測(cè)序；

5、采用superdecode軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析。

6、優(yōu)選地，所述構(gòu)建多種特異性識(shí)別序列包括：

7、對(duì)樣本擴(kuò)增子添加position-barcode、plate-barcode和library-barcode特異性識(shí)別序列庫(kù)；

8、position-barcode序列庫(kù)包括192種特異性的position-barcode序列，用于ngs建庫(kù)以及tgs建庫(kù)的特異性識(shí)別序列各96種；

9、plate-barcode序列庫(kù)包括102種特異性的plate-barcode序列，其中96種用于ngs建庫(kù)，6種用于tgs建庫(kù)；

10、所述library-barcode序列庫(kù)包括20種特異性的library-barcode序列，均用于ngs建庫(kù)。

11、優(yōu)選地，所述根據(jù)所述特異性識(shí)別序列對(duì)基因片段進(jìn)行測(cè)序包括：

12、對(duì)基因片段進(jìn)行sanger測(cè)序、ngs以及tgs。

13、優(yōu)選地，所述采用superdecode軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析包括對(duì)sanger測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析，具體為：

14、根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前突變分析的第一項(xiàng)目信息；

15、利用dsd(degenerate?sequence?decoding)的測(cè)序重疊波峰圖解碼原理，讀取sanger測(cè)序結(jié)果中的重疊波峰；

16、基于序列分析軟件在野生型序列中查找對(duì)應(yīng)的序列，對(duì)擴(kuò)增子的sanger測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析，讀取目的樣本在靶點(diǎn)序列處的變異類型。

17、優(yōu)選地，所述采用superdecode軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析包括對(duì)ngs結(jié)果進(jìn)行突變分析，具體為：

18、根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前突變分析的第二項(xiàng)目信息；

19、將雙端測(cè)序中成對(duì)的reads合并補(bǔ)全為完整的序列，并基于樣本的特異性識(shí)別序列拆分文庫(kù)；

20、將reads對(duì)應(yīng)到特定樣本中，通過序列比對(duì)方法將樣本的reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)，獲得樣本的變異信息。

21、優(yōu)選地，所述采用superdecode軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析包括對(duì)tgs結(jié)果進(jìn)行突變分析，具體為：

22、根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前突變分析的第三項(xiàng)目信息；

23、基于樣本的特異性識(shí)別序列拆分文庫(kù)，將reads對(duì)應(yīng)到特定樣本中；

24、提取特定樣本所有reads中共有的序列，以去除測(cè)序?qū)е碌碾S機(jī)突變，最后利用序列比對(duì)方法將樣本的reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)，獲得樣本變異信息。

25、優(yōu)選地，所述根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前解突變分析的第一項(xiàng)目信息包括：

26、所述第一項(xiàng)目信息包括：擴(kuò)增子野生型序列信息、樣本擴(kuò)增子的sanger測(cè)序結(jié)果文件、可選擇的第一設(shè)置條件。

27、優(yōu)選地，所述根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前突變分析的第二項(xiàng)目信息包括：

28、所述第二項(xiàng)目信息包括：擴(kuò)增子野生型序列信息、基因編輯的靶向序列信息、樣本ngs結(jié)果信息、每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的特異性識(shí)別序列信息以及可選擇的第二設(shè)置條件；

29、所述可選擇的第二設(shè)置條件為對(duì)突變分析參數(shù)的設(shè)置，包括：

30、樣本分析模式，選擇包括diploid、polyploid以及l(fā)ow?frequency；

31、輸出閾值，用于設(shè)置結(jié)果輸出的閾值；

32、運(yùn)行線程數(shù)，用于設(shè)置程序運(yùn)行所用線程數(shù)，調(diào)節(jié)hidecode解碼運(yùn)行速度。

33、優(yōu)選地，所述根據(jù)用戶輸入的文件和設(shè)置獲取當(dāng)前突變分析的第三項(xiàng)目信息包括：

34、所述第三項(xiàng)目信息包括：擴(kuò)增子野生型序列信息、基因編輯的靶向序列信息、樣本tgs結(jié)果信息、每個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的特異性識(shí)別序列信息以及可選擇的第三設(shè)置條件；

35、所述可選擇的第三設(shè)置條件為對(duì)突變分析參數(shù)的設(shè)置，包括：

36、樣本分析模式，選擇包括diploid、polyploid以及l(fā)ow?frequency；

37、輸出閾值，用于設(shè)置結(jié)果輸出的閾值；

38、運(yùn)行線程數(shù)，用于設(shè)置程序運(yùn)行所用線程數(shù)，調(diào)節(jié)ladecode解碼運(yùn)行速度。

39、一種用于基因編輯材料檢測(cè)的系統(tǒng)，包括：

40、數(shù)據(jù)獲取模塊，用于構(gòu)建多種特異性識(shí)別序列；

41、測(cè)序模塊，用于根據(jù)所述特異性識(shí)別序列對(duì)基因片段進(jìn)行測(cè)序；

42、分析模塊，用于采用superdecode軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行突變分析。

43、本發(fā)明的有益效果在于：1.本發(fā)明基于pcr擴(kuò)增的方法，對(duì)基因編輯材料進(jìn)行擴(kuò)增子的構(gòu)建，以及特異性識(shí)別序列的引入，快速且低成本的實(shí)現(xiàn)了大批量樣本的ngs以及tgs的建庫(kù)；2.本發(fā)明開發(fā)用于基因編輯材料檢測(cè)的軟件superdecode，可對(duì)目前常用的sanger、ngs以及tgs結(jié)果進(jìn)行突變分析，可檢測(cè)樣本中所有類型的突變，包括大片段刪除、序列插入、單堿基突變、嵌合突變等；3.本發(fā)明開發(fā)的superdecode為window平臺(tái)軟件，相對(duì)于網(wǎng)頁(yè)版工具，superdecode可快速讀取大量樣本的測(cè)序結(jié)果文件，并進(jìn)行突變分析。對(duì)于linux系統(tǒng)的工具，superdecode提供了方便簡(jiǎn)潔的操作化界面，方便科研人員的使用，極大提高了基因編輯材料檢測(cè)的效率。