本發(fā)明屬于材料與生物醫(yī)療領(lǐng)域，特別涉及一種基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、手術(shù)切除一直是腫瘤特別是實(shí)體瘤治療的主要手段，而腫瘤影像的診斷信息直接關(guān)系到手術(shù)切除的效果。目前，臨床上針對(duì)癌癥常用的影像診斷手段包括超聲診斷、磁共振成像(mri)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)、正電子發(fā)射式計(jì)算機(jī)斷層顯像(pet-ct)。這些手段在術(shù)前腫瘤分布和解剖位置的宏觀視圖呈現(xiàn)上有積極作用，但因?yàn)閹в休椛?，成本高，步驟繁瑣，仍然無(wú)法在術(shù)中提供實(shí)時(shí)的影像導(dǎo)航。據(jù)此，領(lǐng)域內(nèi)研究主要集中于基于傳統(tǒng)影像成像技術(shù)的改進(jìn)，如術(shù)中核磁磁共振技術(shù)(imri)和新型術(shù)中成像技術(shù)的開(kāi)發(fā)如熒光成像技術(shù)、光熱成像技術(shù)等。

2、熒光成像雖然顯示出術(shù)中描繪腫瘤邊界的巨大潛力，但是不可避免的生物自身熒光假陽(yáng)性和快速的光化學(xué)破壞，降低了其臨床實(shí)用性；imri通過(guò)對(duì)手術(shù)室的改造，能實(shí)現(xiàn)在術(shù)中使用，但不能提供實(shí)時(shí)的腫瘤影像信息。而其他新興的成像技術(shù)，如超聲造影和光聲成像，其造影劑在成像過(guò)程中容易受損，表現(xiàn)出有限的手術(shù)時(shí)間窗口，不能夠提供充足的時(shí)間來(lái)完成手術(shù)。相比較下，光熱成像因其操作簡(jiǎn)單、信號(hào)供給穩(wěn)定、可靈活應(yīng)用于術(shù)中指導(dǎo)等優(yōu)勢(shì)而受矚目。光熱成像是指一類通過(guò)光熱參數(shù)的變化來(lái)針對(duì)各項(xiàng)生理信號(hào)和病灶位置進(jìn)行可視化的技術(shù)。光熱材料在激光照射一段時(shí)間，吸收光輻射后，由于吸收能量發(fā)生非輻射弛豫而產(chǎn)生熱輻射信號(hào)。利用熱成像儀可以將熱輻射信號(hào)轉(zhuǎn)換為物體溫度變化的視覺(jué)圖像。與熒光成像相比，光熱材料輔助熱成像能夠通過(guò)調(diào)節(jié)與背景熒光無(wú)關(guān)的照射時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)信號(hào)靈敏度。

3、現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了整合素是一類重要的細(xì)胞表面受體，研究顯示，整合素αβυ3是目前研究最廣泛的整合素家庭成員，在正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)，而在多種腫瘤細(xì)胞中卻表達(dá)量急劇升高，且整合素αβv3能與rgd(arg-gly-asp)序列蛋白結(jié)合，因此可以作為理想的腫瘤影像劑靶點(diǎn)。已有研究表明聚多巴胺與傳統(tǒng)光熱材料相比，具有更加優(yōu)越的光熱轉(zhuǎn)換效率、良好的生物相容性和易修飾性，因此聚多巴胺有望成為腫瘤納米適配體的光熱材料載體。

4、此外，無(wú)論是熒光、超聲、光聲、ct還是mri，都依賴口服或靜脈注射造影劑，增加了人體肝臟代謝的負(fù)擔(dān)，存在不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)隱患。在已開(kāi)發(fā)的腫瘤影像劑中，未見(jiàn)可以基于體外原位適配的腫瘤影像劑。因此，開(kāi)發(fā)一種通用型策略，在體外使腫瘤安全便捷成像是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑的制備方法。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供通過(guò)上述制備方法得到的基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑。

3、本發(fā)明的再一目的在于提供上述基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑的制備方法，包括如下步驟：

5、(1)合成聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球(pda)；

6、(2)接枝腫瘤靶向肽，得到具有光熱/熒光雙模態(tài)成像且能靶向腫瘤的噴涂型影像劑，即為所述的基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑。

7、步驟(1)中所述的聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球中，聚多巴胺是使用多巴胺(da)為單體合成含共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的聚多巴胺納米球。在室溫弱堿性溶液中，使用鹽酸多巴胺為單體，通過(guò)氧化多巴胺為多巴琨，再通過(guò)親核反應(yīng)得到5，6二羥基吲哚(dhi)，dhi通過(guò)共價(jià)氧化聚合成dhi二聚物或三聚物，同時(shí)上述聚合過(guò)程中添加與dhi能共價(jià)聚合物的聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)，得到由兩種組分構(gòu)成的聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球；具體優(yōu)選包括如下步驟：

8、a、將多巴胺溶于水中，得到溶液a；

9、b、將聚乙烯亞胺碳化聚合物點(diǎn)、水、有機(jī)溶劑混合得到溶液b；

10、c、將溶液b加入到溶液a中，加入氨溶液，混合均勻后，反應(yīng)；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物離心收集，得到的沉淀洗滌，干燥，得到聚多巴胺納米球。

11、步驟a中所述的多巴胺優(yōu)選為鹽酸多巴胺。

12、步驟a中所述的溶液a的濃度優(yōu)選45～55mg/ml；更優(yōu)選為50mg/ml。

13、步驟a中所述的水優(yōu)選為去離子水。

14、步驟b中所述的聚乙烯亞胺碳化聚合物點(diǎn)通過(guò)一步法制備，由檸檬酸與聚乙烯亞胺(分子量600-25000)的混合溶液通過(guò)微波輔助法制得。具體包括如下步驟：

15、取50-300mg檸檬酸與10-200mg聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)溶解于5ml?0.05m?hcl水溶液中，攪拌均勻后放入微波反應(yīng)儀中100-500w反應(yīng)1-10min；反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至常溫，透析，凍干，得到具有熒光性能的聚乙烯亞胺碳化聚合物點(diǎn)。

16、步驟b中所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為甲醇、乙醇中的至少一種；更優(yōu)選為無(wú)水乙醇。

17、步驟b中所述的聚乙烯亞胺碳化聚合物點(diǎn)的濃度優(yōu)選0.2～5mg/ml。

18、步驟b中所述水與有機(jī)溶劑的體積比優(yōu)選為5：8～10；更優(yōu)選為5：9。

19、步驟c中所述的氨溶液的濃度優(yōu)選為體積百分比26％～30％；更優(yōu)選為體積百分比28％。

20、步驟c中所述的氨溶液的用量?jī)?yōu)選按氨溶液：溶液a＝體積比1：6～7計(jì)算；更優(yōu)選為按氨溶液：溶液a＝體積比1：6.6計(jì)算。

21、步驟c中所述的反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為20～28小時(shí)；更優(yōu)選為24小時(shí)。

22、步驟c中所述的離心的條件優(yōu)選為10000～14000rpm離心15～30min；更優(yōu)選為12000rpm離心20min。

23、步驟c中所述的洗滌的溶劑優(yōu)選為去離子水。

24、步驟c中所述的洗滌次數(shù)優(yōu)選為2～4次；更優(yōu)選為3次。

25、步驟c中所述的干燥優(yōu)選為真空干燥。

26、步驟(2)中所述的接枝腫瘤靶向肽是通過(guò)邁克加成反應(yīng)或席夫堿反應(yīng)接枝到聚多胺納米球上；具體優(yōu)選包括如下步驟：

27、d、將聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球分散于水溶液中，得到pda溶液；

28、e、將rgd靶向肽、乳糖、糖蛋白、葉酸和生物素oc12等各種配體分子加入聚多巴胺溶液反應(yīng)；

29、f、將得到的產(chǎn)物離心，取沉淀，洗滌，干燥，得到光熱成像劑中的納米適配體pda-ligands。

30、步驟d中所述的水溶劑優(yōu)選為去離子水。

31、步驟d中所述的聚多巴胺溶液優(yōu)選濃度為45～55mg/ml；更優(yōu)選濃度為50mg/ml。

32、步驟e中所述的配體的質(zhì)量根據(jù)聚多巴胺質(zhì)量?jī)?yōu)選聚多巴胺：配體分子＝質(zhì)量比為5：0.8～1.2；更優(yōu)選為聚多巴胺：配體分子＝質(zhì)量比為5：1。

33、步驟f中所述的離心的條件優(yōu)選為10000～14000rpm離心15～30min；更優(yōu)選為12000rpm離心20min。

34、步驟f中所述的洗滌的溶劑優(yōu)選為去離子水。

35、步驟f中所述的干燥優(yōu)選為真空干燥。

36、一種基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑，通過(guò)上述制備方法制備得到。

37、上述基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑在制備抗腫瘤藥物和腫瘤診斷劑中的應(yīng)用。

38、本發(fā)明提供用于的原位噴灑的腫瘤納米適配體影像劑解決傳統(tǒng)注射型腫瘤影像劑安全性隱患問(wèn)題的方法。本發(fā)明利用聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球接枝各種配體，作為特異性靶向腫瘤的光熱/熒光材料，通過(guò)激光照射或熒光激發(fā)，原位轉(zhuǎn)化腫瘤的生物信號(hào)為熱信號(hào)，再通過(guò)熱成像儀將熱信號(hào)轉(zhuǎn)化為直觀的圖像信號(hào)。通過(guò)調(diào)整激光照射時(shí)間，可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)獨(dú)立于腫瘤微環(huán)境的信號(hào)靈敏度，增強(qiáng)腫瘤影像的顯示，從而克服微環(huán)境的異質(zhì)性造成的成像信號(hào)差異。該光熱探針可以通過(guò)靶向過(guò)度表達(dá)整合素的腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)于靶標(biāo)部位的特異性升溫，避免了對(duì)正常組織的傷害。由于腫瘤組織和正常組織之間存在明顯的溫差，從而顯示出較低的背景噪聲，可以對(duì)腫瘤和周圍正常組織進(jìn)行更清晰的區(qū)分。

39、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

40、(1)本發(fā)明提出了一種基于原位適配的噴涂型手術(shù)輔助影像劑及其制備和使用方法，由可以靶向各種腫瘤細(xì)胞的配體功能化聚多巴胺/聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)復(fù)合納米球制備，可以將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大為直觀的熱圖像信號(hào)，原位可視化腫瘤邊界。發(fā)明采用原位局部噴涂配合便攜式紅外攝像儀的方法，具有成本低、使用便捷、無(wú)輻射危害、術(shù)中實(shí)時(shí)成像指導(dǎo)、避免口服或靜脈注射造影劑的不良風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)?？勺鳛樾碌耐ㄓ霉ぞ撸瑤椭饪漆t(yī)生在手術(shù)中實(shí)時(shí)決策，提高腫瘤切除手術(shù)成效。

41、(2)本發(fā)明采用小瓶噴霧形態(tài)，攜帶和使用方便。與傳統(tǒng)影像技術(shù)所依賴的大型醫(yī)療設(shè)備不同，我們的光熱成像劑只需原位噴灑在腫瘤表面附近，并通過(guò)近紅外線短時(shí)間加熱，即可利用便攜式熱成像儀顯示出腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞的邊界。

42、(3)迄今為止，光熱成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要應(yīng)用于腫瘤和細(xì)菌感染的光熱治療，而在傳感應(yīng)用方面，僅限于對(duì)細(xì)胞或分子的檢測(cè)。對(duì)于光熱材料體外輔助熱成像引導(dǎo)下的腫瘤精準(zhǔn)手術(shù)切除，尚未見(jiàn)專利報(bào)道。本發(fā)明創(chuàng)新性地將光熱納米材料應(yīng)用于腫瘤熱成像領(lǐng)域，提腫瘤術(shù)中成像提供新路徑。