本發(fā)明涉及生物，具體涉及豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖捌湟呙绾蛻?yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬圓環(huán)病毒3型(pcv3)是一種無囊膜的二十面體單鏈dna(ssdna)病毒，屬于圓環(huán)病毒科(circoviridae)圓環(huán)病毒屬(circovirus)。2016年pcv3在美國首次被發(fā)現(xiàn)并報道，近幾年來已成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。pcv3可逃避宿主的天然免疫系統(tǒng)反應(yīng)，導(dǎo)致類似pcv2感染發(fā)病的臨床表現(xiàn)，如豬皮炎腎病綜合征(pdns)和母豬繁殖障礙綜合征(srds)等。然而pcv3是與pcv2遺傳進化親緣關(guān)系較遠且存在較大差異的新型豬圓環(huán)病毒，pcv3基因組長約2000bp，編碼了兩個主要的開放閱讀框(orf)，其中orf1編碼了復(fù)制相關(guān)的蛋白(rep)，orf2編碼了決定病毒抗原特性的病毒衣殼(cap)蛋白。在兩種病毒間，cap基因僅有26％的氨基酸一致性，因此臨床中pcv2疫苗無法提供針對pcv3的保護。

2、納米顆粒的尺寸在20-200nm，這是引流到淋巴結(jié)和與b細胞直接相互作用的最佳尺寸。納米顆粒表面的高度重復(fù)結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)b細胞受體的高效交聯(lián)，這是b細胞激活的早期和關(guān)鍵步驟。此外，這種重復(fù)結(jié)構(gòu)結(jié)合天然抗體和固定補體，進一步增強b細胞的活化以及向濾泡樹突狀細胞的轉(zhuǎn)運和沉積。納米顆粒攜帶toll樣受體7/8或9的配體，它們直接激活b細胞進行同型轉(zhuǎn)換，并激活樹突狀細胞進行t細胞啟動。

3、多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，已成為一種新型的疫苗。cap蛋白是pcv3主要的抗原蛋白，但e.coli表達的pcv3?cap未組裝為vlp，免疫效果較差，是實現(xiàn)商品化的瓶頸，因此期望通過納米顆粒展示pcv3?cap的有效表位，形成表位納米顆粒疫苗成為預(yù)防pcv3的有效抗原。

4、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種pcv3表位納米顆?？乖?/p>

2、本發(fā)明的目的之一在于提供一種pcv3表位納米顆粒疫苗。

3、本發(fā)明的目的之一在于提供一種pcv3表位納米顆?？乖闹苽浞椒ā?/p>

4、本發(fā)明的目的之一在于提供一種pcv3表位納米顆粒抗原在制備預(yù)防豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，其中，所述豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病為由豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的單獨感染或混合感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病。

5、本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆粒抗原，該豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆粒抗原為具有pcv3融合表位的spycatcher-e2pcd納米顆?；蛘呔哂衟cv3融合表位的spycatcher-pcv2納米顆粒。

6、所述豬圓環(huán)病毒3型融合表位包含b細胞表位p10?73-87aa、p21?161-175aa、p26201-214aa，和t細胞表位p20?153-167aa、p21161-175aa、p24?185-199aa，其中p10、p20、p21、p24、p26的氨基酸序列分別是seq?id?no.6、7、8、9和10。優(yōu)選地，pcv3融合表位-spytag序列是如序列seq.id?no?4所示的核苷酸序列。

7、本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖?，其中，具有pcv3融合表位的spycatcher-pcv2納米顆粒是vlp(病毒樣粒子)納米顆粒。

8、一種豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖闹苽浞椒?，其中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖瓰榫哂衟cv3融合表位的spycatcher-e2pcd納米顆粒，包括以下步驟：構(gòu)建spycatcher-e2pcd納米顆粒；利用spycatcher-e2pcd納米顆粒展示pcv3融合表位，并形成納米顆?？乖?。在一個實施方式中，利用spycatcher-e2pcd納米顆粒展示pcv3融合表位包括：構(gòu)建pcv3融合表位；可溶表達并純化pcv3融合表位；將spycatcher-e2pcd納米顆粒與pcv3融合表位進行混合，優(yōu)選地按照摩爾比1:3的比例混合。

9、一種豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖闹苽浞椒?，其中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖瓰榫哂衟cv3融合表位的spycatcher-pcv2納米顆粒，所述制備方法包括以下步驟：在胞內(nèi)利用spycatcher-pcv2展示pcv3融合表位，形成vlp納米顆粒。在一個實施方式中，在胞內(nèi)利用spycatcher-pcv2展示pcv3融合表位包括：擴增spycatcher-pcv2?cap片段；擴增pcv3融合表位-spytag片段；依次連接至質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞；共表達spycatcher-pcv2?cap和pcv3融合表位-spytag。

10、本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒3型納米顆粒疫苗，其中，所述納米顆粒疫苗包括免疫量的所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖约八帉W(xué)上可接受的載體；其中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖瓰榫哂衟cv3融合表位的spycatcher-e2pcd納米顆?；蛘呔哂衟cv3融合表位的spycatcher-pcv2納米顆粒。

11、作為本發(fā)明的一種實施方式，在本發(fā)明的納米顆粒疫苗中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖繛椤?0μg/ml。

12、作為本發(fā)明的一種實施方式，在本發(fā)明的納米顆粒疫苗中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖繛?0μg/ml～150μg/ml，優(yōu)選30μg/ml～100μg/ml。

13、在本發(fā)明的納米顆粒疫苗中，所述豬圓環(huán)病毒3型表位納米顆?？乖窟€可以選自30μg/ml～50μg/ml，或50μg/ml～100μg/ml。

14、所述藥學(xué)上可接受的載體包括佐劑，所述佐劑包括：(1)礦物油、鋁膠佐劑、皂苷、阿夫立定、dda；(2)油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物；以及ribi佐劑系統(tǒng)、block?co-polymer、saf-m、單磷酰脂質(zhì)a、avridine脂質(zhì)-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、ims?1314、胞壁酰二肽、montanide?isa?206、montanide?isa?201、gel佐劑中的一種或幾種；優(yōu)選地，皂苷為quil?a、qs-21、gpi-0100；所述佐劑含量為5％-60％v/v，優(yōu)選從30％-60％?v/v，更優(yōu)選50％v/v。

15、根據(jù)較佳的實施方式，所述佐劑為montanide?isa?201佐劑。優(yōu)選地，所述佐劑含量為50％v/v。

16、本發(fā)明通過基因工程重組技術(shù)實現(xiàn)了pcv3?cap在e.coli中表達，純化后的cap免疫豬后可產(chǎn)生針對pcv3?cap的特異性抗體。通過化學(xué)合成26條重疊多肽，與蛋白免疫后陽性血清點雜交，篩選到p10?73-87aa、p26?201-214aa、p21?161-175aa為b細胞表位。通過多肽分別刺激蛋白免疫后豬外周血淋巴細胞，進行elispot-γ實驗，篩選到p24?185-199aa、p21?161-175aa、p20?153-167aa為t細胞表位。利用spycatcher/spytag系統(tǒng)構(gòu)建新型納米顆粒載體spycatcher-e2pcd，利用spycatcher-e2pcd納米顆粒載體展示pcv3融合表位，并形成納米顆粒疫苗，納米顆粒疫苗既能重復(fù)展示表位，有利于免疫細胞的識別，增強免疫效果，納米顆粒的直徑為約22nm，有利于抗原提呈細胞的識別吞噬，促進cd4+cd8+t淋巴細胞的增殖，免疫豬后能夠產(chǎn)生強烈體液免疫和細胞免疫。進一步的，在胞內(nèi)利用spycatcher-pcv2展示pcv3融合表位，形成vlp納米顆粒，利用該納米顆粒的疫苗具有同時預(yù)防pcv2和pcv3的潛力。

17、本發(fā)明所述的pcv3表位納米顆粒能夠用于制備pcv3亞單位疫苗，預(yù)防pcv3感染。