本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多孔金屬骨植入材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷和疾病等造成的骨缺損給患者造成巨大痛苦。在骨損傷修復(fù)和功能重建中，由醫(yī)用金屬材料制備的骨骼植入物，比如醫(yī)用金屬螺釘、人工關(guān)節(jié)、口腔種植體等在骨缺損修復(fù)和功能重建中發(fā)揮著不可替代的作用。而骨植入物與宿主骨質(zhì)良好整合并維持長(zhǎng)期穩(wěn)固對(duì)患者的臨床預(yù)后十分關(guān)鍵。

糖尿病是世界性的公共健康難題，而我國(guó)早已成為糖尿病全球第一大國(guó)。2010年全世界糖尿病患病人群已達(dá)3.82億，其中我國(guó)占1.136億，患病率11.6％，我國(guó)的患病人數(shù)和患病率都居世界之首，給個(gè)人和整個(gè)社會(huì)都造成嚴(yán)重健康危害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病作為系統(tǒng)性慢性病，造成多器官的并發(fā)癥，其中骨骼健康也受到嚴(yán)重危害。流行病學(xué)研究已證實(shí)，與正常人群相比，糖尿病患者中金屬骨骼植入物的松動(dòng)率明顯增高，其中脊柱螺釘?shù)乃蓜?dòng)率高達(dá)驚人的30％。松動(dòng)造成植入物失效，同時(shí)可能損傷周?chē)墓恰⒓∪?、神?jīng)和血管等組織，給患者帶來(lái)巨大痛苦甚至生命威脅。而目前這一嚴(yán)重的臨床難題尚未得到有效解決。

在解決骨內(nèi)植入松動(dòng)的問(wèn)題上，內(nèi)植物本身的改進(jìn)能發(fā)揮關(guān)鍵作用。骨內(nèi)植物絕大多數(shù)為金屬，而金屬與骨的彈性模量存在很大差異，材料與骨的界面會(huì)形成應(yīng)力屏障，使得植入物與骨無(wú)法良好整合，甚至造成材料周?chē)侨芙?，?dǎo)致植入物的松動(dòng)和失效。研究顯示，在金屬材料內(nèi)形成多孔結(jié)構(gòu)能降低材料的彈性模量，有效減小界面的應(yīng)力屏障，并給骨組織沿孔隙向植入物內(nèi)長(zhǎng)入提供了空間，從而能改善材料的骨整合。因而，研究者們針對(duì)多孔金屬材料的制備和優(yōu)化展開(kāi)了大量工作，提出了不同的技術(shù)方案，如漿料發(fā)泡法、冶金技術(shù)空間站位法、松裝燒結(jié)法、多層鈦網(wǎng)壓縮成孔法等。漿料發(fā)泡法等需要采用發(fā)泡劑成孔、高溫?zé)Y(jié)成型等類(lèi)似手段，鈦網(wǎng)壓縮成孔法利用多層平面鈦網(wǎng)疊加壓縮成立體孔隙，這些方法制備的多孔材料孔隙的大小、數(shù)量及連通性以及材料整體外形不易控制，制成品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變異性大，重復(fù)性差，無(wú)法做到醫(yī)用植入物的標(biāo)準(zhǔn)化精確設(shè)計(jì)和制備；另有研究證明高溫?zé)Y(jié)會(huì)導(dǎo)致金屬材料的理化性質(zhì)不同程度地改變，無(wú)法保證其生物安全性。

此外，患者存在個(gè)體差異，不同部位骨骼形態(tài)差異大，骨缺損形態(tài)常常不規(guī)則，因而骨植入物需要形成相匹配的形態(tài)和孔隙結(jié)構(gòu)。這使得根據(jù)患者的具體情況精確設(shè)計(jì)和制備個(gè)體化的骨骼植入物成為醫(yī)學(xué)發(fā)展的大趨勢(shì)，也是數(shù)字醫(yī)學(xué)和生物材料相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)；另一方面，有研究證明，多孔植入物內(nèi)部不同大小的梯度孔隙設(shè)計(jì)，能有效優(yōu)化其多方面的性能，而孔隙結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計(jì)和制備則是技術(shù)前提。近年來(lái)，隨著快速成型技術(shù)的發(fā)展，3d打印技術(shù)在材料制備領(lǐng)域的應(yīng)用使得材料的個(gè)體化定制和材料結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計(jì)和控制成為可能。3d打印不僅能快速制備多孔金屬骨內(nèi)植物，還能避免其他技術(shù)方案中存在的許多問(wèn)題。

醫(yī)用植入物材料須有可靠的生物安全性，但生物安全性高也意味材料的生物活性低(生物惰性)，即誘導(dǎo)骨組織在材料表面及其周?chē)偕迯?fù)的性能差，其中骨植入物制備中應(yīng)用最廣的鈦金屬就是典型的例子。另外，為有效減小界面的應(yīng)力屏障，多孔材料的孔隙不能太小，而這又造成骨組織向孔隙內(nèi)長(zhǎng)入困難。

綜上，對(duì)于糖尿病巨大的患病人群和糖尿病患者骨植入物松動(dòng)高發(fā)的嚴(yán)重問(wèn)題，開(kāi)發(fā)針對(duì)性的骨植入物新型材料具有很大的社會(huì)價(jià)值和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種多孔金屬骨植入材料及其制備方法和應(yīng)用，該材料結(jié)構(gòu)可精確控制，能做到個(gè)體化定制，能夠有效改善糖尿病患者中的金屬骨植入物的骨整合，降低植入物的松動(dòng)率。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種多孔金屬骨植入材料，由多孔金屬材料基體和填充于多孔金屬材料基體孔隙中的絲素蛋白材料組成；其中，多孔金屬材料基體由金屬原材料粉末通過(guò)3d打印制得；絲素蛋白材料中負(fù)載有生物活性藥物。

所述的金屬原材料粉末為純鈦、鈦合金或鈷合金，即可以制備成相應(yīng)的不同的多孔金屬骨植入材料。

優(yōu)選地，能夠用于3d打印的金屬原材料粉末的直徑為10～50μm?？筛鶕?jù)需要制備的具體植入物種類(lèi)進(jìn)行優(yōu)化選擇，比如對(duì)脊柱螺釘可選直徑為15μm的小粉末，對(duì)于人工關(guān)節(jié)的制備可選50μm的較大粉末。

優(yōu)選地，多孔金屬材料基體的孔徑為100～1000μm，可根據(jù)所需制備的不同植入物種類(lèi)進(jìn)行選擇。比如制備骨折固定用的金屬螺釘時(shí)可選200μm的較小孔隙。

優(yōu)選地，多孔金屬材料基體孔隙率為69％～80％，彈性模量小于10gpa。

優(yōu)選地，多孔金屬材料孔隙內(nèi)復(fù)合的絲素蛋白的干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.05～0.3g：1cm³。更優(yōu)選地，該比例為0.1-0.2g/cm³。

優(yōu)選地，與絲素蛋白復(fù)合進(jìn)行緩釋的生物活性藥物可以是脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體的激動(dòng)劑adiporon和骨形成蛋白-2(bmp-2)中的一種或幾種。更進(jìn)一步優(yōu)選地，多孔金屬材料孔隙內(nèi)絲素蛋白復(fù)合和緩釋脂聯(lián)素，用于促進(jìn)糖尿病條件下的骨修復(fù)。進(jìn)一步，多孔金屬材料內(nèi)復(fù)合的脂聯(lián)素與絲素蛋白的質(zhì)量比例為(1～5)：10000。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述多孔金屬骨植入材料的制備方法，包括以下步驟：

1)根據(jù)需求制備個(gè)體化定制的3d打印多孔金屬材料基體；

2)制備絲素蛋白溶液，并將生物活性藥物負(fù)載于絲素蛋白中；

3)將負(fù)載生物活性藥物的絲素蛋白填充于多孔金屬材料基體的孔隙中，然后經(jīng)冷凍干燥處理，制得多孔金屬骨植入材料。

優(yōu)選地，步驟1)中，制備個(gè)體化定制的3d打印多孔金屬材料基體。采集患者的ct圖像數(shù)據(jù)，在三維圖像軟件中分析和設(shè)計(jì)出針對(duì)該患者的個(gè)體化的植入物材料外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為100～800μm，孔隙直徑為100～1000μm，以正方體或正十二面結(jié)構(gòu)單位填充和擴(kuò)展該圖像，得到目標(biāo)植入物的三維圖像。將該三維圖像文件導(dǎo)入金屬材料3d打印機(jī)，制備得外形和孔隙結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)圖形一致的多孔金屬材料基體。

優(yōu)選地，將制得的多孔金屬材料基體分別在酒精、丙酮和蒸餾水中超聲清洗，各20min，洗去表面污物，50～60℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

優(yōu)選地，步驟2)中，通過(guò)三維圖像數(shù)據(jù)計(jì)算得到多孔金屬材料基體內(nèi)部孔隙的總體積，按比例取絲素蛋白，將絲素蛋白加入libr溶液中，充分溶解后用去離子水透析除去libr，制得絲素蛋白溶液，然后將生物活性藥物加入絲素蛋白溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，完成?fù)載。

優(yōu)選地，步驟3)中，將負(fù)載生物活性藥物的絲素蛋白滴加在多孔金屬材料基體上，充分分散均勻后，進(jìn)行真空冷凍干燥，制得多孔金屬骨植入材料

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明制得的多孔金屬骨植入材料，該多孔金屬骨植入材料由多孔金屬材料基體和填充于多孔金屬材料基體孔隙中的絲素蛋白材料組成；多孔金屬材料基體由金屬原材料粉末通過(guò)3d打印制得；絲素蛋白材料中負(fù)載有生物活性藥物。采用3d打印技術(shù)完成個(gè)體化設(shè)計(jì)和定制，材料結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)控制以及快速制備，更能滿(mǎn)足未來(lái)臨床應(yīng)用的需求。絲素蛋白在多孔金屬材料孔隙內(nèi)形成不規(guī)則仿生多孔結(jié)構(gòu)，這既有利于絲素蛋白發(fā)揮其骨修復(fù)促進(jìn)作用，從而改善醫(yī)用金屬材料的生物惰性；又在材料孔隙中為細(xì)胞和血管生長(zhǎng)提供良好的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨組織向孔隙內(nèi)生長(zhǎng)。絲素蛋白可緩慢降解，其本身及其降解產(chǎn)生的多種肽段和氨基酸可作用于參與骨修復(fù)的細(xì)胞，促進(jìn)孔隙內(nèi)的骨新生，最終促進(jìn)植入物與骨的良好整合。

進(jìn)一步地，絲素蛋白負(fù)載并緩釋針對(duì)糖尿病病理機(jī)制的生物活性藥物，比如脂聯(lián)素，可有效拮抗糖尿病對(duì)骨代謝微環(huán)境產(chǎn)生的病理性影響，從而為改善糖尿病條件下材料-骨界面的骨再生，促進(jìn)骨與材料更好的整合，降低內(nèi)植物的松動(dòng)率提供了針對(duì)性的有效解決方案。

本發(fā)明公開(kāi)的多孔金屬骨植入材料制備方法，整個(gè)過(guò)程條件溫和，能有效保持絲素蛋白等組分的天然原有屬性，且不會(huì)產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，生物安全性高。

本發(fā)明針對(duì)糖尿病巨大的患病人群和糖尿病患者骨植入物松動(dòng)高發(fā)的嚴(yán)重問(wèn)題，所制得的多孔金屬骨植入材料能夠針對(duì)性的應(yīng)用于糖尿病人群。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中利用3d打印得到的多孔ti6al4v合金骨植入物材料的基體。

圖2為實(shí)施例1中最后制備得的孔隙中復(fù)合了載脂聯(lián)素絲素蛋白的針對(duì)糖尿病人群的多孔鈦合金骨植入物材料。

圖3為實(shí)施例1中最終制備的材料的掃描電鏡照片，顯示了孔隙中填充的成不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)的載藥絲素蛋白。

圖4為實(shí)施例3中不同材料和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)材料表面成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。

圖5為實(shí)施例3中不同材料和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)材料表面成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶酶活性(成骨分化程度)的影響。

圖6為實(shí)施例4中不同骨植入材料植入兔股骨髁部后6周材料的骨結(jié)合分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

附圖中數(shù)據(jù)都是平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；*代表和第一組(正常環(huán)境+普通醫(yī)用實(shí)心金屬材料組)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，#代表和第二組(糖尿病環(huán)境+普通醫(yī)用實(shí)心金屬材料組)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開(kāi)的多孔金屬骨植入材料的制備方法，包括以下步驟：

第一步：制備個(gè)體化定制的3d打印金屬植入物材料。采集患者的ct圖像數(shù)據(jù)，在三維圖像軟件中分析和設(shè)計(jì)出針對(duì)該患者的個(gè)體化的植入物材料外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為100～800μm，孔隙直徑為100～1000μm，以正方體或正十二面結(jié)構(gòu)單位填充和擴(kuò)展該圖像，得到目標(biāo)植入物的三維圖像。將該三維圖像文件導(dǎo)入金屬材料3d打印機(jī)，制備得外形和孔隙結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)圖形一致的多孔金屬植入物。植入物材料分別在酒精、丙酮和蒸餾水中超聲清洗，各20min，洗去表面污物，50～60℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

第二步：制備絲素蛋白溶液。根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)估算多孔金屬材料內(nèi)部孔隙的總體積。按絲素蛋白的干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.1～0.2g：1cm³的比例稱(chēng)取對(duì)應(yīng)量的絲素蛋白。將絲素蛋白加入9.3m的libr溶液在60℃條件下恒溫4h以充分溶解，之后該溶液對(duì)去離子水進(jìn)行透析72h，以除去溶液中的libr，制備得質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

第三步：將生物活性藥物負(fù)載于絲素蛋白上。在低溫環(huán)境(4～10℃)中，按比例將生物活性藥物加入絲素蛋白溶液并充分?jǐn)嚢?，使藥物與絲素蛋白在溶液中充分均勻混合，藥物會(huì)通過(guò)物理吸附等方式負(fù)載于絲素蛋白纖維上。

第四步：載有藥物的絲素蛋白復(fù)合在多孔金屬材料的孔隙中。將第三步制備好的絲素蛋白溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔金屬材料基體上，使溶液通過(guò)孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分均勻擴(kuò)散，滴加的量以溶液剛好充滿(mǎn)孔隙為準(zhǔn)。

作為可選步驟，加入絲素蛋白溶液的多孔金屬材料可以在4℃冰箱中靜置12-24h，使溶液在孔隙內(nèi)擴(kuò)散均勻并在孔隙內(nèi)初步形成形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的水凝膠，之后進(jìn)行第五步。

第五步：冷凍干燥制備得目標(biāo)材料。將第四步所得復(fù)合材料放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，冷凍干燥，使絲素蛋白在金屬材料孔隙內(nèi)原位干燥形成不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)填充，制備成本發(fā)明所述的針對(duì)糖尿病人群的多孔金屬骨植入物材料。

實(shí)施例1一種針對(duì)糖尿病人群的多孔金屬骨植入物材料的制備

1.制備個(gè)體化定制的3d打印金屬植入物材料。

(1)對(duì)糖尿病患者，采集患者骨缺損部位的ct圖像數(shù)據(jù)，導(dǎo)入三維圖像軟件cad中，根據(jù)患者具體情況設(shè)計(jì)出個(gè)體化的目標(biāo)植入物材料的外形和內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)。其中，桿件寬度為200μm，平均孔隙直徑為400μm，以正方體結(jié)構(gòu)單位填充和擴(kuò)展該圖像，得到目標(biāo)植入物的三維圖像。

(2)將該三維圖像文件導(dǎo)入電子束熔融(ebm)金屬材料3d打印機(jī)，利用直徑為30μm的ti6al4v合金粉末，通過(guò)3d打印制備得個(gè)體化定制的多孔金屬植入物，參見(jiàn)圖1。

(3)多孔金屬植入物材料經(jīng)過(guò)酒精、丙酮和蒸餾水超聲清洗，每種液體中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干備用。

2.制備絲素蛋白溶液

根據(jù)三維圖像數(shù)據(jù)計(jì)算多孔金屬材料內(nèi)部孔隙的總體積。按絲素蛋白干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.2g：1cm³的比例稱(chēng)取絲素蛋白。用去離子水配置9.3m的libr溶液用于溶解絲素蛋白。在適宜大小的離心管中加入絲素蛋白質(zhì)量5倍體積的libr溶液，絲素蛋白完全沒(méi)入其中，60℃恒溫4h，使絲素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量為3500d的適宜大小的透析袋將該溶液對(duì)去離子水進(jìn)行透析，共72h，以除去溶液中的libr。透析完成后12000rmp/min轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清液，得到質(zhì)量體積比為3～6％的絲素蛋白溶液，備用。

3.將生物活性藥物與絲素蛋白負(fù)載于絲素蛋白上

在低溫環(huán)境(4～10℃)中，按脂聯(lián)素與絲素蛋白的干重比為1：10000的比例，將脂聯(lián)素加入絲素蛋白溶液并充分?jǐn)嚢?，使脂?lián)素與絲素蛋白在溶液中充分均勻混合，脂聯(lián)素通過(guò)物理吸附的方式負(fù)載于絲素蛋白纖維上。

4.載有藥物的絲素蛋白復(fù)合在多孔金屬材料的孔隙中

將第3步制備好的載藥絲素蛋白溶液從上方緩慢滴加在干燥的多孔金屬材料基體上，使溶液通過(guò)孔隙間的相互連通在材料內(nèi)充分?jǐn)U散，滴加的量以溶液剛好充滿(mǎn)孔隙為準(zhǔn)。加入絲素蛋白溶液的多孔金屬材料在4℃冰箱中靜置12～24h，使溶液在孔隙內(nèi)擴(kuò)散均勻并在孔隙內(nèi)形成形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的水凝膠，從而不易在移動(dòng)過(guò)程中發(fā)生孔隙內(nèi)液體流失。

5.冷凍干燥制備得目標(biāo)材料

將第4步所得復(fù)合材料放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，-20℃冷凍干燥48h，使絲素蛋白在金屬材料孔隙內(nèi)原位干燥形成不規(guī)則仿生多孔結(jié)構(gòu)填充，制備成復(fù)合絲素蛋白進(jìn)行脂聯(lián)素緩釋的針對(duì)糖尿病人群的多孔鈦合金植入物材料(圖2和圖3)。從圖中可以看出，多孔金屬骨植入材料孔隙內(nèi)填充有不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)的載藥絲素蛋白。后者為植入物周?chē)鷧⑴c骨組織再生的細(xì)胞提供了的良好的結(jié)構(gòu)依托和生物學(xué)微環(huán)境，有利于骨組織再生和向孔隙內(nèi)長(zhǎng)入。

實(shí)施例2一種針對(duì)糖尿病人群的多孔金屬骨植入物材料的制備

本實(shí)施例與實(shí)施例一部分相同，其不同之處在于：

1.第1步中，在cad軟件中設(shè)計(jì)的多孔金屬材料桿件寬度為400μm，平均孔隙直徑為800μm，以正十二面體結(jié)構(gòu)單位填充材料孔隙。利用直徑20μm的鉻鈷鉬合金微球狀材料粉末，電子束熔融3d打印得多孔金屬材料基體。

2.第2步中，按絲素蛋白干重與材料內(nèi)部孔隙總體積的比例為0.1g：1cm³的比例稱(chēng)取絲素蛋白，溶解制備絲素蛋白溶液，備用。

3.第3步中，稱(chēng)取脂聯(lián)素受體的激動(dòng)劑adiporon，其中adiporon與絲素蛋白的質(zhì)量比為1:1×10⁴。將adiporon加入絲素蛋白溶液并充分?jǐn)嚢?，使脂?lián)素與絲素蛋白在溶液中充分均勻混合，adiporon通過(guò)物理吸附的方式負(fù)載于絲素蛋白的肽鏈上。

4.第4和第5步中，載藥絲素蛋白溶液滴加進(jìn)多孔金屬材料孔隙中后，不在4℃中靜置，直接放入冷凍干燥機(jī)，-40℃冷凍干燥24小時(shí)。制備得一種針對(duì)糖尿病人群的多孔金屬骨植入物材料。

實(shí)施例3評(píng)估多孔金屬骨植入物材料對(duì)糖尿病條件下成骨細(xì)胞細(xì)胞功能的影響

本實(shí)施例給出實(shí)施例1中所制備的骨植入材料對(duì)糖尿病條件下骨再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞——成骨細(xì)胞——細(xì)胞功能的影響，即給出該材料對(duì)糖尿病環(huán)境中成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨分化的促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)方法：以普通的醫(yī)用鈦合金金屬片為對(duì)照組材料，以實(shí)施例1中所制備的多孔鈦合金骨植入物材料為實(shí)驗(yàn)組材料，將各組材料在同等條件下在酒精、去離子水兩種液體中分別超聲清洗10分鐘，室溫自然晾干，之后利用c60射線照射1小時(shí)滅菌。利用分離培養(yǎng)的sd大鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞，將其按1×10⁴個(gè)/毫升的細(xì)胞密度在每個(gè)材料上接種5×10⁴個(gè)細(xì)胞，于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行材料與細(xì)胞的共培養(yǎng)。

分為3組：

1)正常培養(yǎng)基+普通鈦片組；

2)糖尿病培養(yǎng)基+普通鈦片組；

3)糖尿病+多孔鈦合金骨植入物材料組。

其中糖尿病培養(yǎng)基為文獻(xiàn)中公認(rèn)的高脂高糖培養(yǎng)基(模擬糖尿病環(huán)境)培養(yǎng)。培養(yǎng)的第3和第7天，用mtt法檢測(cè)不同環(huán)境中成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖活力的差異；培養(yǎng)的第7天，用堿性磷酸酶(alp)酶活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鈦表面成骨細(xì)胞成骨分化程度(alp活性反應(yīng)成骨分化程度)，按照試劑盒的專(zhuān)業(yè)說(shuō)明書(shū)操作，評(píng)價(jià)不同環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化狀態(tài)的影響。

結(jié)果：與正常培養(yǎng)中普通鈦片上的細(xì)胞相比，糖尿病培養(yǎng)基中普通鈦片上的成骨細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖(參見(jiàn)圖4)和alp活性(參見(jiàn)圖5)都明顯下降；而糖尿病培養(yǎng)基中多孔鈦金屬骨植入材料上的細(xì)胞細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)alp的活力都較普通鈦片上的細(xì)胞明顯提高。

結(jié)果分析：上述結(jié)果表明，糖尿病條件造成了明顯的成骨細(xì)胞細(xì)胞功能抑制，而本發(fā)明所制備的多孔鈦金屬骨植入材料對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨分化功能有明顯改善作用。

實(shí)施例4糖尿病動(dòng)物體內(nèi)多孔金屬骨植入材料對(duì)骨再生修復(fù)和骨整合效果的提升作用

本實(shí)施例給出實(shí)施例1中所制備的多孔鈦金屬骨植入材料對(duì)糖尿病動(dòng)物體內(nèi)的材料周?chē)窃偕筒牧瞎钦闲Ч拇龠M(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)方法：將四氧嘧啶(stz)50mg/kg尾靜脈注射于體重約3.5kg的雄性新西蘭白兔，每天1次，連續(xù)3天。最后一次注射后7天，測(cè)空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl為糖尿病動(dòng)物，用于后續(xù)試驗(yàn)。在外科手術(shù)條件下，兔雙側(cè)股骨髁部植入直徑10mm、厚3mm的圓餅狀材料。動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組12只：

1)正常動(dòng)物+普通實(shí)心鈦合金材料；

2)糖尿病動(dòng)物+普通實(shí)心鈦合金材料；

3)糖尿病動(dòng)物+多孔鈦金屬骨植入材料。

材料植入后6周取材，取植入了材料的股骨標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)固定后用顯微ct掃描(ge公司)檢測(cè)。利用顯微ct掃描數(shù)據(jù)計(jì)算骨植入物的骨結(jié)合分?jǐn)?shù)，評(píng)價(jià)各組鈦合金材料周?chē)窃偕闆r和材料骨整合效果。

結(jié)果：與正常動(dòng)物體內(nèi)植入的普通醫(yī)用實(shí)心鈦合金相比，糖尿病動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)心鈦合金材料的骨結(jié)合分?jǐn)?shù)顯著降低，參見(jiàn)圖6，從圖6中可以看出，材料周?chē)墓窃偕艿揭种疲牧系墓墙Y(jié)合效果不佳。而與實(shí)心鈦合金材料相比，糖尿病動(dòng)物體內(nèi)植入的多孔鈦合金骨植入材料的骨結(jié)合分?jǐn)?shù)則明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果分析：上述結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明制備的多孔金屬骨植入材料能有效提高糖尿病條件下體內(nèi)骨植入物周?chē)墓窃偕筒牧系墓钦闲Ч?，增?qiáng)金屬骨植入物的穩(wěn)定性。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明采用的絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含18種氨基酸，其中的11種為人體必需氨基酸。絲素蛋白本身具有良好的機(jī)械性能和理化性質(zhì)，而且經(jīng)過(guò)不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜以及凝膠等。絲素蛋白對(duì)人體無(wú)毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，可降解。脂聯(lián)素是人體內(nèi)的一種細(xì)胞因子，由脂肪細(xì)胞等細(xì)胞分泌產(chǎn)生，通過(guò)內(nèi)分泌等方式調(diào)節(jié)多種組織細(xì)胞的代謝，在全身及細(xì)胞代謝平衡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

2、人體不同部位及不同骨組織具有不同的結(jié)構(gòu)和彈性模量，比如皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的彈性模量相差很大，因而相應(yīng)的植入物多孔金屬材料也應(yīng)根據(jù)不同情況制備成不同的孔隙大小以匹配目標(biāo)骨組織，以減低應(yīng)力屏障。3d打印制備多孔金屬植入物材料可達(dá)到個(gè)體化設(shè)計(jì)和定制，材料結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)控制以及快速制備，更能滿(mǎn)足未來(lái)臨床應(yīng)用的需求。

3、在金屬材料上復(fù)合其他材料可采用多種技術(shù)方案，比如通過(guò)物理吸附、電化學(xué)沉積、等離子體噴涂等方法在材料孔隙內(nèi)形成功能性材料涂層或材料填充。然而絲素蛋白作為天然生物蛋白，加工工藝需要溫和。對(duì)絲素蛋白而言，物理吸附不夠牢固，高溫、電沉積等手段會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)和活性，因而都不適用。而通過(guò)冷凍干燥技術(shù)既能保證絲素蛋白的結(jié)構(gòu)和活性不被破壞，又能使絲素蛋白在多孔金屬材料孔隙內(nèi)形成不規(guī)則仿生多孔結(jié)構(gòu)。這既有利于絲素蛋白發(fā)揮其骨修復(fù)促進(jìn)作用，從而改善醫(yī)用金屬材料的生物惰性；又在材料孔隙中為細(xì)胞和血管生長(zhǎng)提供良好的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨組織向孔隙內(nèi)生長(zhǎng)。絲素蛋白可緩慢降解，其本身及其降解產(chǎn)生的多種肽段和氨基酸可作用于參與骨修復(fù)的細(xì)胞，促進(jìn)孔隙內(nèi)的骨新生，最終促進(jìn)植入物與骨的良好整合。這為醫(yī)用植入物材料的功能化改良提供了的新方案。

4、絲素蛋白負(fù)載并緩釋針對(duì)糖尿病病理機(jī)制的生物活性藥物，比如脂聯(lián)素，可有效拮抗糖尿病對(duì)骨代謝微環(huán)境產(chǎn)生的病理性影響，從而為改善糖尿病條件下材料-骨界面的骨再生，促進(jìn)骨與材料更好的整合，降低內(nèi)植物的松動(dòng)率提供了針對(duì)性的有效解決方案。

5、本發(fā)明所用基礎(chǔ)金屬原材料都是臨床最常用的金屬材料，安全可靠，早已形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，成本低。而絲素蛋白和脂聯(lián)素等生物活性藥物都是經(jīng)臨床應(yīng)用檢驗(yàn)過(guò)的安全無(wú)害物質(zhì)，且其生產(chǎn)工藝已經(jīng)較成熟，能滿(mǎn)足廣大臨床需求。