本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于聚磷酸酯的混合載藥膠束及其制備方法和一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束。

背景技術(shù)：

聚合物膠束是近幾年發(fā)展起來(lái)一種新型的納米載藥體系，一般是由兩親性兩嵌段(親水-疏水)聚合物或三嵌段(親水-疏水-親水)聚合物自組裝構(gòu)成，除此之外也有一些由接枝型的親水-疏水聚合物或者離子型的親水離子型共聚物形成。

主動(dòng)靶向主要是指賦予藥物或其載體主動(dòng)與靶標(biāo)結(jié)合的能力，主要手段包括將抗體、多肽、糖鏈、核酸適配體等能夠與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的探針?lè)肿油ㄟ^(guò)化學(xué)或物理方法偶聯(lián)到藥物或其載體表面，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向效果。

目前，親水鏈為peg(聚乙二醇)的兩親性聚合物構(gòu)成的膠束是最常用的載藥膠束，peg具有良好的長(zhǎng)循環(huán)作用、低免疫原性、良好的生物相容性等優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)peg大大抑制了腫瘤細(xì)胞對(duì)其的內(nèi)吞，降低了治療效果。主動(dòng)靶向修飾可以增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞量，但peg缺少活性位點(diǎn)，難以進(jìn)行靶向修飾。同時(shí)，peg在人體內(nèi)難以降解，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后藥物釋放緩慢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種基于聚磷酸酯的混合載藥膠束及其制備方法和一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束。本發(fā)明提供的基于聚磷酸酯的混合載藥膠束親水性好，且容易進(jìn)行靶向修飾，兼具體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功效和促靶細(xì)胞內(nèi)吞并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物釋放的作用，主動(dòng)靶向修飾后的混合載藥膠束具有優(yōu)良的“被動(dòng)”靶向和“主動(dòng)”靶向雙重效應(yīng)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于聚磷酸酯的混合載藥膠束，包括載體和被所述載體包覆的疏水性化療藥物；所述載體包括聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物；

所述聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物具有式i所示結(jié)構(gòu)：

式i中，m＝5～30，n＝10～150。

優(yōu)選的，所述聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的質(zhì)量比為(1～20):(1～5)。

優(yōu)選的，所述聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物中聚乳酸嵌段的重均分子量為2000～20000；聚磷酸酯嵌段的重均分子量為2000～10000；

所述聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物中聚乳酸嵌段的重均分子量為2000～20000；聚乙二醇嵌段的重均分子量為2000～10000。

優(yōu)選的，所述疏水性化療藥物和載體的質(zhì)量比為(0.1～2):10。

本發(fā)明提供了上述方案所述混合載藥膠束的制備方法，包括以下步驟：

將聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物疏水性化療藥物、有機(jī)堿性化合物和有機(jī)溶劑混合，得到油相；

將油相加入水中進(jìn)行乳化，得到乳液；

將乳液中的有機(jī)溶劑去除，得到基于聚磷酸酯的混合載藥膠束。

優(yōu)選的，所述有機(jī)堿性化合物包括三乙胺、乙二胺和吡啶中的一種或幾種。

優(yōu)選的，所述有機(jī)堿性化合物和疏水性化療藥物的摩爾比為(1～10):1。

優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為氯代烷烴和醇類的混合溶劑。

本發(fā)明提供了一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾混合載藥膠束，包括上述方案所述的混合載藥膠束或上述方案所述制備方法制備的混合載藥膠束以及修飾在混合載藥膠束載體上的主動(dòng)靶向基團(tuán)；

所述主動(dòng)靶向基團(tuán)偶聯(lián)在聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的聚磷酸酯嵌段上；

所述主動(dòng)靶向基團(tuán)為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸肽。

優(yōu)選的，所述主動(dòng)靶向基團(tuán)的質(zhì)量為混合載藥膠束中聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物總質(zhì)量的1％～20％。

本發(fā)明提供了一種基于聚磷酸酯的混合載藥膠束，包括載體和被所述載體包覆的疏水性化療藥物；所述載體包括聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物。本發(fā)明由聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物組成復(fù)合膠束，通過(guò)聚乳酸嵌段之間的疏水相互作用形成具有相同聚乳酸疏水內(nèi)核、不同親水外殼的復(fù)合膠束，既能克服單一膠束的缺點(diǎn)，又能保留單一膠束各自的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明提供的混合載藥膠束親水性好，具有良好的穩(wěn)定性，且容易進(jìn)行靶向修飾，兼具體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功效和促靶細(xì)胞內(nèi)吞及促進(jìn)胞內(nèi)藥物釋放的作用。實(shí)施例結(jié)果表明，以阿霉素為疏水性化療藥物，靜脈注射本發(fā)明混合載藥膠束1h后，小鼠血清中的阿霉素濃度明顯高于注射游離阿霉素的小鼠，說(shuō)明本發(fā)明的混合載藥膠束具有優(yōu)異的體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功效；以bel-7402細(xì)胞為例對(duì)本發(fā)明提供的混合載藥膠束促靶細(xì)胞內(nèi)吞作用及胞內(nèi)藥物釋放進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在ph6.5及7.4的情況下，bel-7402細(xì)胞對(duì)混合載藥膠束的內(nèi)吞量明顯高于peg-plla膠束。

本發(fā)明提供了上述方案所述混合載藥膠束的制備方法，本發(fā)明提供的制備方法操作簡(jiǎn)單，成本低，容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明還提供了一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾混合載藥膠束，包括上述方案所述的混合載藥膠束或上述方案所述制備方法制備的混合載藥膠束以及修飾在混合載藥膠束載體上的主動(dòng)靶向基團(tuán)；所述主動(dòng)靶向基團(tuán)偶聯(lián)在聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的聚磷酸酯嵌段上；所述主動(dòng)靶向基團(tuán)為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸肽(rgdf)。本發(fā)明將rdgf修飾在聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的聚磷酸酯嵌段上，形成主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾混合載藥膠束。實(shí)施例結(jié)果表明，本發(fā)明提供的主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束中的rgdf在ph7.4的條件下可以在peg的水化層中得以隱藏，避免正常組織的吞噬，到達(dá)腫瘤部位后，腫瘤部位的微酸環(huán)境使rgdf得以暴露，達(dá)到主動(dòng)靶向的效果，增加靶細(xì)胞的內(nèi)吞，最終達(dá)到被動(dòng)靶向及主動(dòng)靶向的雙重效應(yīng)，從而進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的paeep12-plla70和實(shí)施例8制備的rgdf-paeep-plla的¹h-nmr核磁圖譜；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的paeep12-plla70和實(shí)施例8制備的rgdf-paeep-plla的紅外圖譜；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2、實(shí)施例9制備的混合載藥膠束和peg-plla載藥膠束的藥物體外釋放曲線圖；

圖4為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的bel7402細(xì)胞對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2、實(shí)施例9制備的混合載藥膠束和peg-plla載藥膠束的內(nèi)吞量圖；

圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的bel7402細(xì)胞對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2、實(shí)施例10制備的混合載藥膠束和peg-plla載藥膠束的內(nèi)吞量圖；

圖6為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的bel7402細(xì)胞對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束和peg-plla載藥膠束的內(nèi)吞量圖；

圖7為小鼠raw264.7巨噬細(xì)胞對(duì)實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束的內(nèi)吞量圖；

圖8為實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束在bel7402細(xì)胞內(nèi)12h的藥物釋放情況圖；

圖9為實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束在小鼠體內(nèi)的藥時(shí)曲線；

圖10為包載dir的實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布情況圖；

圖11為實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束在荷瘤小鼠體內(nèi)24h后的組織分布情況圖；

圖12為荷瘤小鼠使用實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束治療21天內(nèi)的腫瘤體積變化曲線圖；

圖13為荷瘤小鼠使用實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束治療21天內(nèi)的體重變化曲線圖；

圖14為荷瘤小鼠使用實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束治療21天后腫瘤的重量圖；

圖15為荷瘤小鼠使用實(shí)施例2、實(shí)施例9、實(shí)施例11制備的混合載藥膠束治療21天后的腫瘤圖片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種基于聚磷酸酯的混合載藥膠束，包括載體和被所述載體包覆的疏水性化療藥物；所述載體包括聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物；

所述聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物具有式i所示結(jié)構(gòu)：

式i中，m＝5～30，n＝10～150。

本發(fā)明提供的混合載藥膠束包括載體，所述載體包括包括聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物(paeep-plla)，具有式i所示結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，所述m的取值范圍為5～30，優(yōu)選為15～20；所述n的取值范圍為10～150，優(yōu)選為60～140，更優(yōu)選為70；所述paeep-plla中聚乳酸嵌段的重均分子量?jī)?yōu)選為2000～20000，更優(yōu)選為6000～8000；所述paeep-plla中聚磷酸酯嵌段的重均分子量?jī)?yōu)選為2000～10000，更優(yōu)選為3000～7000，最優(yōu)選為3000～5000。

本發(fā)明對(duì)聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的來(lái)源沒(méi)有特殊要求，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行制備即可，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的方法制備優(yōu)選包括以下步驟：

(1)將聚乳酸、2-(n-(叔丁氧羰基)乙醇胺)-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷和有機(jī)溶劑混合，在有機(jī)金屬催化劑作用下進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物；

(2)將所述步驟(1)得到的中間產(chǎn)物與有機(jī)溶劑和酸性試劑混合，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到具有式i所示結(jié)構(gòu)的聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物。

本發(fā)明將聚乳酸(plla)、2-(n-(叔丁氧羰基)乙醇胺)-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(n-boc-eaop)和有機(jī)溶劑混合，在有機(jī)金屬催化劑作用下進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物(n-boc-paeep-plla)。在本發(fā)明中，所述plla、n-boc-eaop、有機(jī)溶劑和有機(jī)金屬催化劑的質(zhì)量比優(yōu)選為(1～2):1:(50～200):(0.1～0.5)，更優(yōu)選為1:1:(100～150):(0.2～0.3)。

本發(fā)明對(duì)于所述plla的來(lái)源沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的plla市售商品或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備得到的plla產(chǎn)品即可。

本發(fā)明對(duì)于所述n-boc-eaop的來(lái)源沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備得到的n-boc-eaop產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，所述n-boc-eaop優(yōu)選按照以下步驟制備得到：

將2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷和n-(叔丁氧羰基)乙醇胺在有機(jī)溶劑中進(jìn)行取代反應(yīng)，得到n-boc-eaop。

在本發(fā)明中，所述2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷、n-(叔丁氧羰基)乙醇胺和有機(jī)溶劑的摩爾比優(yōu)選為1：(0.9～1.1)：(15～40)，更優(yōu)選為1：1：(20～30)。在本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為非質(zhì)子有機(jī)溶劑。本發(fā)明對(duì)于所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非質(zhì)子有機(jī)溶劑即可。在本發(fā)明中，所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑優(yōu)選包括四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

在本發(fā)明中，所述取代反應(yīng)的溫度優(yōu)選為-4～0℃；時(shí)間優(yōu)選為12～24h，更優(yōu)選為14～20h，最優(yōu)選為16～18h。

完成所述取代反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選將取代反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行后處理，得到所述n-boc-eaop。在本發(fā)明中，所述后處理優(yōu)選包括以下步驟：

去除取代反應(yīng)的產(chǎn)物中的溶劑，將得到的固體干燥，得到n-boc-eaop。

本發(fā)明對(duì)于去除溶劑的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的去除溶劑的技術(shù)方案即可。本發(fā)明優(yōu)選將所述取代反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除溶劑。本發(fā)明對(duì)于所述干燥的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的干燥方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用真空干燥。在本發(fā)明中，所述真空干燥的溫度優(yōu)選為50～70℃，更優(yōu)選為55～65℃；時(shí)間優(yōu)選為20～28h，更優(yōu)選為22～26h；真空度優(yōu)選小于0.05atm。

在本發(fā)明中，與所述plla和n-boc-eaop混合的有機(jī)溶劑優(yōu)選為非質(zhì)子有機(jī)溶劑。本發(fā)明對(duì)于所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非質(zhì)子有機(jī)溶劑即可。在本發(fā)明中，所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑優(yōu)選包括四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

本發(fā)明對(duì)于所述有機(jī)金屬催化劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于催化開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的有機(jī)金屬催化劑即可。在本發(fā)明中，所述有機(jī)金屬催化劑優(yōu)選包括有機(jī)錫催化劑和/或有機(jī)鋁催化劑。本發(fā)明對(duì)于所述有機(jī)錫催化劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于催化開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的有機(jī)錫催化劑即可，如辛酸亞錫(sn(oct)2)。本發(fā)明對(duì)于所述有機(jī)鋁催化劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于催化開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的有機(jī)鋁催化劑即可，如三異丙醇鋁(al(oipr)3)或三異丁基鋁(ibu3al)。

在本發(fā)明中，所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的溫度優(yōu)選為50～60℃，更優(yōu)選為53～57℃；時(shí)間優(yōu)選為3～12h，更優(yōu)選為5～10h，最優(yōu)選為6～8h。本發(fā)明提供的開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)條件溫和，所需反應(yīng)溫度較低。

完成所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選將所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行后處理，得到中間產(chǎn)物。在本發(fā)明中，所述后處理優(yōu)選包括以下步驟：

將所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物沉淀、固液分離、干燥，得到中間產(chǎn)物。

本發(fā)明對(duì)于所述沉淀的方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的能夠?qū)⑺鲩_(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行沉淀的技術(shù)方案即可。本發(fā)明優(yōu)選采用非極性有機(jī)溶劑對(duì)所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行沉淀。本發(fā)明對(duì)于所述非極性有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非極性有機(jī)溶劑即可，如乙醚或石油醚。在本發(fā)明中，所述非極性有機(jī)溶劑與所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物的質(zhì)量比優(yōu)選為(45～55)：1，更優(yōu)選為(48～52)：1。

完成所述沉淀后，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)所述沉淀后得到的物料進(jìn)行固液分離。本發(fā)明對(duì)于所述固液分離的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固液分離方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用過(guò)濾實(shí)現(xiàn)所述固液分離。

完成所述固液分離后，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)所述固液分離后得到的固體進(jìn)行干燥，得到中間產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì)于所述干燥的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的干燥方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用真空干燥。在本發(fā)明中，所述真空干燥的溫度優(yōu)選為50～70℃，更優(yōu)選為55～65℃；時(shí)間優(yōu)選為20～28h，更優(yōu)選為22～26h；真空度優(yōu)選小于0.05atm。

得到中間產(chǎn)物后，本發(fā)明將所述中間產(chǎn)物與有機(jī)溶劑和酸性試劑混合，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到具有式i所示結(jié)構(gòu)的聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物。在本發(fā)明中，所述中間產(chǎn)物、有機(jī)溶劑和酸性試劑的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(10～20)：(0.5～1)，更優(yōu)選為1：(13～17)：(0.6～0.8)。

在本發(fā)明中，與所述中間產(chǎn)物和酸性試劑混合的有機(jī)溶劑優(yōu)選為非質(zhì)子有機(jī)溶劑。本發(fā)明對(duì)于所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非質(zhì)子有機(jī)溶劑即可。在本發(fā)明中，所述非質(zhì)子有機(jī)溶劑優(yōu)選包括四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷。

本發(fā)明對(duì)于所述酸性試劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)以脫去叔丁氧羰基boc保護(hù)基團(tuán)的酸性試劑即可，如三氟乙酸或氯化氫。

在本發(fā)明中，所述脫保護(hù)反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20～40℃，更優(yōu)選為25～35℃；具體的，本發(fā)明的實(shí)施例中，所述脫保護(hù)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，無(wú)需加熱也無(wú)需冷卻。在本發(fā)明中，所述脫保護(hù)反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為3～6h，更優(yōu)選為4～5h。本發(fā)明提供的脫保護(hù)反應(yīng)條件溫和，在室溫下即可進(jìn)行所述脫保護(hù)反應(yīng)。

完成所述脫保護(hù)反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選將所述脫保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行后處理，得到所述具有式i所示結(jié)構(gòu)的聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物。在本發(fā)明中，所述后處理優(yōu)選包括以下步驟：

將所述脫保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)物沉淀、固液分離、干燥，得到所述具有式i所示結(jié)構(gòu)的聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物。

本發(fā)明對(duì)于所述沉淀的方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的能夠?qū)⑺鲩_(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行沉淀的技術(shù)方案即可。本發(fā)明優(yōu)選采用非極性有機(jī)溶劑對(duì)所述開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行沉淀。本發(fā)明對(duì)于進(jìn)行所述沉淀所需的非極性有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的非極性有機(jī)溶劑即可，如乙醚或石油醚。在本發(fā)明中，所述非極性有機(jī)溶劑與所述脫保護(hù)反應(yīng)的產(chǎn)物的質(zhì)量比優(yōu)選為(15～25)：1，更優(yōu)選為(18～22)：1。

完成所述沉淀后，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)所述沉淀后得到的物料進(jìn)行固液分離。本發(fā)明對(duì)于所述固液分離的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固液分離方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用過(guò)濾實(shí)現(xiàn)所述固液分離。

完成所述固液分離后，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)所述固液分離后得到的固體進(jìn)行干燥，得到中間產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì)于所述干燥的方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的干燥方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用真空干燥。在本發(fā)明中，所述真空干燥的溫度優(yōu)選為40～60℃，更優(yōu)選為45～55℃；時(shí)間優(yōu)選為9～15h，更優(yōu)選為11～13h；真空度優(yōu)選小于0.05atm。

在本發(fā)明中，所述載體包括聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物(peg-plla)。在本發(fā)明中，所述peg-plla中聚乳酸嵌段的重均分子量?jī)?yōu)選為2000～20000，更優(yōu)選為6000～8000；所述peg-plla中聚乙二醇嵌段的重均分子量?jī)?yōu)選為2000～10000，更優(yōu)選為6000～8000。

在本發(fā)明中，所述paeep-plla和peg-plla的質(zhì)量比優(yōu)選為(1～20):(1～5)，更優(yōu)選為(2～18):1，最優(yōu)選為16:1。

在本發(fā)明中，所述peg-plla的結(jié)構(gòu)如式ⅱ所示：

在本發(fā)明中，所述p的取值范圍優(yōu)選為10～150，更優(yōu)選為50～100；所述q的取值范圍優(yōu)選為10～150，更優(yōu)選為50～100。

本發(fā)明對(duì)peg-plla的來(lái)源沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知來(lái)源的peg-plla即可，具體的如市售商品。

本發(fā)明通過(guò)控制兩種嵌段共聚物中各個(gè)嵌段的分子量和兩種共聚物的質(zhì)量比來(lái)提高混合載藥膠束的長(zhǎng)循環(huán)功效和靶細(xì)胞內(nèi)吞效果。本發(fā)明提供的混合載藥膠束的載體中包括聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物，通過(guò)聚乳酸嵌段之間的疏水相互作用力形成具有相同聚乳酸疏水內(nèi)核、不同親水外殼的復(fù)合膠束，混合載藥膠束能夠克服單一的聚乙二醇-聚乳酸膠束靶細(xì)胞內(nèi)吞效果差、難以進(jìn)行靶向修飾的缺點(diǎn)和單一的聚磷酸酯-聚乳酸膠束水溶性差，體內(nèi)藥效不好的缺點(diǎn)；并且復(fù)合膠束的親水外殼中因含有聚磷酸酯而具有酸敏和酶敏特性，易于降解，使得藥物在細(xì)胞內(nèi)能夠快速釋放，已達(dá)到抗腫瘤藥物高效輸送的目的。

在本發(fā)明中，所述疏水性化療藥物和載體的質(zhì)量比優(yōu)選為(0.1～2):10，更優(yōu)選為(0.5～1.8):10，最優(yōu)選為1.5:10。本發(fā)明對(duì)所述疏水性化療藥物的種類沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的疏水性化療藥物均可，具體的如鹽酸阿霉素、紫杉醇、順鉑等。

本發(fā)明提供了上述方案所述混合載藥膠束的制備方法，包括以下步驟：

將聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物、疏水性化療藥物、有機(jī)堿性化合物和有機(jī)溶劑混合，得到油相；

將油相加入水中進(jìn)行乳化，得到乳液；

將乳液中的有機(jī)溶劑去除，得到基于聚磷酸酯的混合載藥膠束。

本發(fā)明將聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物(paeep-plla)、聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物(peg-plla)、疏水性化療藥物、有機(jī)堿性化合物和有機(jī)溶劑混合，得到油相。在本發(fā)明中，所述peg-plla和paeep-plla的質(zhì)量比優(yōu)選為(1～20):(1～5)，更優(yōu)選為(2～18):1，最優(yōu)選為16:1；所述疏水性化療藥物和paeep-plla、peg-plla總質(zhì)量的質(zhì)量比優(yōu)選為(0.1～2):10，更優(yōu)選為(0.5～1.8):10，最優(yōu)選為1.5:10；所述有機(jī)堿性化合物優(yōu)選包括三乙胺、乙二胺和吡啶中的一種或幾種，更優(yōu)選為三乙胺；所述有機(jī)堿性化合物和疏水性化療藥物的摩爾比為(1～3):1，更優(yōu)選為2:1；所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為氯代烷烴和醇類的混合溶劑；所述氯代烷烴優(yōu)選為氯仿或二氯甲烷；所述醇類優(yōu)選為甲醇或乙醇；所述氯代烷烴和醇的體積比優(yōu)選為(1～3):1，更優(yōu)選為2:1；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為氯仿和甲醇以體積比2:1混合的溶劑；所述有機(jī)溶劑和paeep-plla、peg-plla總質(zhì)量的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～15):1，更優(yōu)選為(12～13):1。

本發(fā)明對(duì)所述paeep-plla、peg-plla、疏水性化療藥物、有機(jī)堿性化合物和有機(jī)溶劑的混合順序沒(méi)有特殊要求，采用任意順序混合，能夠使paeep-plla、peg-plla、疏水性化療藥物、有機(jī)堿性化合物完全溶解于有機(jī)溶劑中即可。

得到油相后，本發(fā)明將油相加入水中進(jìn)行乳化，得到乳液。在本發(fā)明中，所述水優(yōu)選為超純水，所述水和油相中有機(jī)溶劑的體積比優(yōu)選為(5～15):1，更優(yōu)選為10:1。

本發(fā)明優(yōu)選將油相滴加到水中進(jìn)行乳化，所述滴加的速度優(yōu)選為0.05～0.1ml/s，更優(yōu)選為0.06～0.08ml/s；所述乳化優(yōu)選為超聲乳化，所述超聲乳化的功率優(yōu)選為200～400w，更優(yōu)選為300w；所述超聲乳化的時(shí)間優(yōu)選為5～10min，更優(yōu)選為6～8min；本發(fā)明的超聲乳化時(shí)間自油相滴加開(kāi)始時(shí)開(kāi)始計(jì)算；本發(fā)明對(duì)超聲乳化使用的儀器沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的超聲乳化儀器即可，具體的如細(xì)胞破碎儀。

得到乳液后，本發(fā)明將乳液中的有機(jī)溶劑去除，得到基于聚磷酸酯的混合載藥膠束(peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束)。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)攪拌使乳液中的有機(jī)溶劑揮發(fā)；所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為150～300rpm，更優(yōu)選為250～280rpm；所述攪拌的時(shí)間優(yōu)選為24～48h，更優(yōu)選為35～40h；所述攪拌的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱和降溫。

本發(fā)明提供的混合載藥膠束的載體包括peg-plla和paeep-plla，其中paeep-plla的paeep嵌段中存在氨基，容易進(jìn)行主動(dòng)靶向修飾，主動(dòng)靶向修飾后的混合載藥膠束的腫瘤治療效果可以得到進(jìn)一步的提高。

本發(fā)明還提供了一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾混合載藥膠束，包括上述方案所述的混合載藥膠束以及修飾在混合載藥膠束載體上的主動(dòng)靶向基團(tuán)；所述主動(dòng)靶向基團(tuán)偶聯(lián)在聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物的聚磷酸酯嵌段上；所述主動(dòng)靶向基團(tuán)為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸肽(rgdf)。在本發(fā)明中，所述主動(dòng)靶向基團(tuán)的質(zhì)量?jī)?yōu)選為混合載藥膠束中聚磷酸酯-聚乳酸兩嵌段共聚物和聚乙二醇-聚乳酸兩嵌段共聚物總質(zhì)量的1％～20％，更優(yōu)選為5％～15％，最優(yōu)選為6.5％～8.5％，再優(yōu)選為6.5％。

在本發(fā)明中，所述主動(dòng)靶向基團(tuán)偶聯(lián)在paeep-plla的聚磷酸酯嵌段(paeep)上，本發(fā)明對(duì)在paeep嵌段上偶聯(lián)主動(dòng)靶向基團(tuán)的方法沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的偶聯(lián)方法即可。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述在paeep嵌段上偶聯(lián)主動(dòng)靶向基團(tuán)的方法優(yōu)選包括以下步驟：

將paeep-plla、rgdf、偶聯(lián)劑和有機(jī)溶劑混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到rgdf修飾的paeep-plla(rgdf-paeep-plla)。

在本發(fā)明中，所述rgdf和paeep-plla中paeep側(cè)鏈上氨基的摩爾比優(yōu)選為(1～3):1，更優(yōu)選為2:1；所述偶聯(lián)劑優(yōu)選為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的混合物、n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)的混合物；所述edc和nhs的混合物中edc和nhs的摩爾比優(yōu)選為1:1；所述dcc和dmap的混合物中dcc和dmap的摩爾比優(yōu)選為1:1；所述偶聯(lián)劑和rgdf的摩爾比優(yōu)選為(5～12):1，更優(yōu)選為10:1。

在本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為二甲基亞砜，或氯代烷烴和醇的混合溶劑；所述氯代烷烴優(yōu)選為氯仿或二氯甲烷；所述醇優(yōu)選為乙醇或甲醇；所述氯代烷烴和醇的體積比優(yōu)選為(2～3):1，更優(yōu)選為2.5:1；所述有機(jī)溶劑和paeep-plla、rgdf總質(zhì)量的質(zhì)量比優(yōu)選為(5～10):1，更優(yōu)選為(6～8):1。

在本發(fā)明中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱和降溫；所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為24～48h，更優(yōu)選為30～40h；本發(fā)明優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為150～300rpm，更優(yōu)選為200～250rpm。

所述偶聯(lián)反應(yīng)完成后，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行后處理，得到rgdf-paeep-plla。在本發(fā)明中，所述后處理優(yōu)選包括以下步驟：

將反應(yīng)液固液分離，得到固態(tài)產(chǎn)物；

對(duì)所述固態(tài)產(chǎn)物依次進(jìn)行透析和冷凍干燥。

本發(fā)明對(duì)固液分離的具體方法沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固液分離方法即可，具體的如過(guò)濾。

得到固態(tài)產(chǎn)物后，本發(fā)明對(duì)所述固態(tài)產(chǎn)物依次進(jìn)行透析和冷凍干燥。在本發(fā)明中，所述透析用透析袋的截留分子量?jī)?yōu)選為800～1200，更優(yōu)選為1000；所述透析的時(shí)間優(yōu)選為24～72h，更優(yōu)選為36～48h；本發(fā)明通過(guò)透析除去產(chǎn)物中未偶聯(lián)上的rgdf和偶聯(lián)劑等小分子雜質(zhì)。

所述透析后，本發(fā)明將透析產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥，得到rgdf-paeep-plla。在本發(fā)明中，所述冷凍干燥的時(shí)間優(yōu)選為24～48h，更優(yōu)選為30～40h；所述冷凍干燥優(yōu)選為真空冷凍干燥；本發(fā)明對(duì)真空冷凍干燥的真空度沒(méi)有特殊要求，能夠保持在真空狀態(tài)下進(jìn)行冷凍干燥即可。

在本發(fā)明中，所述主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束的制備方法和上述制備混合載藥膠束的方案一致，區(qū)別僅在于首先將主動(dòng)靶向基團(tuán)偶聯(lián)在paeep-plla的paeep嵌段上，然后再將rgdf-paeep-plla和peg-plla混合，按照和上述方案相同的方法進(jìn)行乳化和有機(jī)溶劑的去除即可。

本發(fā)明通過(guò)在paeep-plla的paeep嵌段上偶聯(lián)rgdf，得到主動(dòng)靶向修飾的混合載藥膠束，本發(fā)明提供的混合載藥膠束在中性條件下可將rgdf隱藏在peg水化層中，降低單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，而在腫瘤微酸環(huán)境中，paeep的側(cè)鏈及rgdf質(zhì)子化程度增加，得rgdf暴露出來(lái)，達(dá)到主動(dòng)靶向的效果，增加靶細(xì)胞的內(nèi)吞，最終達(dá)到被動(dòng)靶向及主動(dòng)靶向的雙重效應(yīng)，從而進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的基于聚磷酸酯的混合載藥膠束及其制備方法和一種主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

將2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷1mol、n-(叔丁氧羰基)乙醇胺0.9mol和四氫呋喃40mol混合，在0℃條件下進(jìn)行取代反應(yīng)12h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后，在真空度為0.03atm的條件下60℃真空干燥20h，得到2-(n-(叔丁氧羰基)乙醇胺)-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(n-boc-eaop)

(2)將聚乳酸、n-boc-eaop和四氫呋喃混合，在有機(jī)鋁催化劑作用下，于60℃條件下進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)3h，得到中間產(chǎn)物；

(3)將所述步驟(2)得到的中間產(chǎn)物與四氫呋喃和三氟乙酸混合，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，然后用乙醚對(duì)所述脫保護(hù)反應(yīng)結(jié)束后得到的物料進(jìn)行沉淀，過(guò)濾，將得到的固體在真空度為0.03atm的條件下40℃真空干燥15h，得到paeep12-plla70。

合成路線如式a所示：

實(shí)施例2

分別稱取鹽酸阿霉素8.2mg，peg83-plla70(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)60.2mg及實(shí)施例1制備的paeep12-plla70(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，plla嵌段的重均分子量為5000)40.2mg，共同溶于1ml氯仿與0.5ml甲醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間5min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中150rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例3

按照實(shí)施例1的方法制備paeep12-plla70；

分別稱取鹽酸阿霉素9.6mg，peg83-plla70(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)71.4mg及paeep12-plla70(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，plla嵌段的重均分子量為5000)30.5mg，共同溶于1ml氯仿與0.5ml乙醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率300w，時(shí)間10min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中300rpm下攪拌32h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例4

按照實(shí)施例1的方法制備paeep12-plla70；

分別稱取鹽酸阿霉素10.2mg，peg83-plla70(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)80.8mg及paeep12-plla70(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，plla嵌段的重均分子量為5000)20.3mg，共同溶于1ml三氯甲烷與0.5ml甲醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率300w，時(shí)間10min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中400rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例5

按照實(shí)施例1的方法制備paeep21-plla90；

分別稱取鹽酸阿霉素8.5mg，peg100-plla90(其中peg嵌段的重均分子量為8000，plla嵌段的重均分子量為6400)60.2mg及paeep21-plla90(其中paeep嵌段的重均分子量為3500，plla嵌段的重均分子量為6400)40.7mg，共同溶于3ml氯仿與1ml甲醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間10min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例6

按照實(shí)施例1的方法制備paeep21-plla120；

分別稱取鹽酸阿霉素9.2mg，peg100-plla90(其中peg嵌段的重均分子量為8000，plla嵌段的重均分子量為6400)72.5mg及paeep21-plla120(其中paeep嵌段的重均分子量為3500，plla嵌段的重均分子量為8600)30.3mg，共同溶于1ml二氯甲烷與0.5ml甲醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入10ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間10min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例7

按照實(shí)施例1的方法制備paeep21-plla120；

分別稱取鹽酸阿霉素8.3mg，peg100-plla120(其中peg嵌段的重均分子量為8000，plla嵌段的重均分子量為8600)80.8mg及paeep21-plla120(其中paeep嵌段的重均分子量為3500，plla嵌段的重均分子量為8600)20.2mg，共同溶于1ml氯仿與0.5ml甲醇的混合溶劑中，并加入50μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入10ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間10min，得到均一穩(wěn)定的乳液；將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到混合載藥膠束。

實(shí)施例8

取實(shí)施例1制備的paeep12-plla70，按照paeep側(cè)鏈上的氨基與rgdf的摩爾比為1:1.5分別稱取相應(yīng)的paeep-plla聚合物、rgdf及與rgdf等摩爾比的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl)、nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，共同溶解于dmso溶劑中，其中反應(yīng)物總質(zhì)量與溶劑質(zhì)量比為1:10，室溫下攪拌反應(yīng)24h，攪拌速率150rpm；

反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物放置于透析袋(mwco＝1000)中透析24h除去未偶聯(lián)上的肽、edc及nhs等小分子雜質(zhì)，真空冷凍干燥48h后得到白色rgdf-paeep-plla粉末。

采用核磁共振分別對(duì)實(shí)施例1制備的paeep12-plla70和實(shí)施例8制備的rgdf-paeep-plla進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如圖1所示；

采用紅外光譜儀分別對(duì)實(shí)施例1制備的paeep12-plla70和實(shí)施例8制備的rgdf-paeep-plla進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如圖2所示；

根據(jù)圖1和圖2可以看出，實(shí)施例8所得產(chǎn)物確實(shí)為rgdf-paeep-plla，rgdf成功修飾在了paeep12-plla70的paeep嵌段上，且rgdf嵌段分子量為8k。

實(shí)施例9

按照實(shí)施例8的方法制備rgdf-paeep-plla(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，嵌段數(shù)量為12；plla嵌段的重均分子量為5000，嵌段數(shù)量為70，rgdf的質(zhì)量占peg-plla和rgdf-paeep-plla總質(zhì)量的6.5％)；

稱取9.7mg鹽酸阿霉素，87.5mgpeg-plla(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)及12.5mgrgdf-paeep-plla，共同溶于1ml二氯甲烷與1ml乙醇的混合溶劑中，并加入100μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入20ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間5min，得到均一穩(wěn)定的乳液，將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到rgdf修飾的載藥膠束，記為rgdf-m(6.5％)。

實(shí)施例10

按照實(shí)施例8的方法制備rgdf-paeep-plla(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，嵌段數(shù)量為12；plla嵌段的重均分子量為5000，嵌段數(shù)量為70，rgdf的質(zhì)量占peg-plla和rgdf-paeep-plla總質(zhì)量的8.5％)；

稱取10.5mg鹽酸阿霉素，80.5mgpeg-plla(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)及20.0mgrgdf-paeep-plla，共同溶于3ml氯仿與1ml乙醇的混合溶劑中，并加入100μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間5min，得到均一穩(wěn)定的乳液，將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到rgdf修飾的載藥膠束，記為rgdf-m(8.5％)。

實(shí)施例11

按照實(shí)施例8的方法制備rgdf-paeep-plla(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，嵌段數(shù)量為12；plla嵌段的重均分子量為5000，嵌段數(shù)量為70，rgdf的質(zhì)量占peg-plla和rgdf-paeep-plla總質(zhì)量的10.5％)；

稱取10.5mg鹽酸阿霉素，80.5mgpeg-plla(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)及20.0mgrgdf-paeep-plla，共同溶于3ml氯仿與1ml乙醇的混合溶劑中，并加入100μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間5min，得到均一穩(wěn)定的乳液，將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到rgdf修飾的載藥膠束，記為rgdf-m(10.5％)。

實(shí)施例12

按照實(shí)施例8的方法制備rgdf-paeep-plla(其中paeep嵌段的重均分子量為2000，嵌段數(shù)量為12；plla嵌段的重均分子量為5000，嵌段數(shù)量為70，rgdf的質(zhì)量占peg-plla和rgdf-paeep-plla總質(zhì)量的5.2％)；

稱取10.5mg鹽酸阿霉素，80.5mgpeg-plla(其中peg嵌段的重均分子量為5000，plla嵌段的重均分子量為5000)及20.0mgrgdf-paeep-plla，共同溶于3ml氯仿與1ml乙醇的混合溶劑中，并加入100μl三乙胺溶液將鹽酸阿霉素進(jìn)行脫鹽酸處理，待完全溶解后，逐滴加入15ml超純水中同時(shí)使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲乳化，保持功率200w，時(shí)間5min，得到均一穩(wěn)定的乳液，將乳液置于室溫中200rpm下攪拌24h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到rgdf修飾的載藥膠束，記為rgdf-m(5.2％)。

實(shí)施例13

(1)對(duì)實(shí)施例2～7制備的peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束的粒徑分布進(jìn)行分析，所得結(jié)果如表1所示：

表1實(shí)施例2～7制備的peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束的粒徑分布

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)可以看出：peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束粒徑分布位于160～190nm之間，且pdi較小，表示粒徑分布均一。

(2)膠束穩(wěn)定性考察：將實(shí)施例2～7制備的peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束與含bsa(濃度為0.25mg/ml)的pbs緩沖液(ph7.4，10mm)混合后在37℃條件下共孵育24h，然后檢測(cè)其粒徑分布變化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束在孵育24h后的粒徑分布與zeta電位

根據(jù)表2可以看出，peg-plla/paeep-plla混合載藥膠束孵育24h后粒徑變化不大，表明本發(fā)明制備的混合載藥膠束穩(wěn)定性良好。

(3)對(duì)實(shí)施例9～12制備的rgdf修飾的混合載藥膠束的粒徑分布進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如表3所示。

表3rgdf修飾的混合載藥膠束的粒徑分布

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)可以看出，rgdf修飾的混合載藥膠束粒徑分布位于160～190nm之間，且pdi較小，表示粒徑分布均一。

(4)對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))制備的載藥膠束在不同ph值條件下進(jìn)行體外藥物釋放研究，同時(shí)對(duì)本領(lǐng)域中普通的peg-plla載藥膠束進(jìn)行體外藥物釋放研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，在ph7.4的環(huán)境下，三組膠束的釋放行為基本一致，24h后釋放量基本達(dá)到飽和。ph6.5時(shí)，rgdf-m(6.5％)膠束釋放速率明顯加快，而在ph4.5時(shí)，peg-plla膠束釋放量達(dá)到了75％～80％左右，control-m及rgdf-m(6.5％)膠束的釋放量則基本達(dá)到100％。由此可知，添加paeep-plla后的混合載藥膠束以及rgdf修飾的混合載藥膠束在低ph的條件下，藥物釋放速率更快，這取決于paeep-plla的酸敏和酶敏特性。

(5)分別在ph7.4和ph6.5的條件下使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)bel7402細(xì)胞對(duì)實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、10(rgdf-m(8.5％))、11(rgdf-m(10.5％))制備的混合載藥膠束以及本領(lǐng)域普通的peg-plla載藥膠束的內(nèi)吞量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5和圖6所示。

根據(jù)圖4的結(jié)果可以看出，bel7402細(xì)胞對(duì)peg-plla膠束的內(nèi)吞量無(wú)ph敏感性變化；bel7402細(xì)胞對(duì)于control-m的內(nèi)吞量敏感性也不大，但是在ph7.4和ph6.5的條件下內(nèi)吞量都明顯高于peg-plla膠束；rgdf-m(6.5％)在ph7.4的條件下的內(nèi)吞量明顯小于ph6.5條件下的內(nèi)吞量，說(shuō)明在中性條件下，rgdf修飾的混合載藥膠束中的rgdf隱藏在peg水化層中，而在ph6.5的弱酸性條件下，rgdf本身及paeep的側(cè)鏈上帶有的氨基質(zhì)子化程度增加，增加了paeep嵌段的伸展程度，從而使rgdf暴露至膠束表面實(shí)現(xiàn)靶向效果，故其內(nèi)吞量與peg-plla組相比顯著增加。

根據(jù)圖5可以看出，在ph7.4及ph6.5的條件下bel7402細(xì)胞對(duì)rgdf-m(8.5％)膠束的內(nèi)吞明顯高于peg-plla膠束。

根據(jù)圖6可以看出，在rgdf-m(10.5％)一組中，在ph7.4時(shí)，由于rgdf含量較高，因而在ph7.4及ph6.5的條件下均能顯著增加靶細(xì)胞對(duì)其的內(nèi)吞。

(6)采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)小鼠單核巨噬細(xì)胞raw264.7對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2(記為control-m)、9和11制備的載藥膠束的內(nèi)吞量，將小鼠單核巨噬細(xì)胞raw264.7與全培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)2h，其中全培養(yǎng)基中包含10％fbs和載藥膠束，載藥膠束中脫鹽酸鹽的阿霉素(dox)濃度為5μg/ml；2h后，用pbs清洗消化細(xì)胞，離心收集后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)載藥膠束的內(nèi)吞量，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。

根據(jù)圖7的結(jié)果可有看出與peg-plla膠束相比，raw264.7細(xì)胞對(duì)control-m、rgdf-m(10.5％)及rgdf-m(6.5％)混合載藥膠束的內(nèi)吞量略有下降，這是因?yàn)閏ontrol-m、rgdf-m(10.5％)及rgdf-m(6.5％)混合載藥膠束中擁有peg/paeep的混合親水層，因此具有與peg-plla膠束類似甚至更優(yōu)的抗蛋白吸附能力，這表明混合載藥膠束具有抗單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬的能力，因而擁有較高的被動(dòng)靶向效率，對(duì)于腫瘤的治療至關(guān)重要。

(7)將實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、11(rgdf-m(10.5％))制備的載藥膠束、普通的pef-plla載藥膠束與bel7402細(xì)胞的共孵育12h，12h后棄去藥物、pbs清洗、細(xì)胞固定、dapi染色及封片，用熒光共聚焦顯微鏡觀察藥物釋放的情況，觀察結(jié)果如圖8所示；

根據(jù)圖8可以看出，peg-plla膠束組的細(xì)胞核內(nèi)dox的熒光很弱，這表明胞內(nèi)釋放的阿霉素量很少，而混合載藥膠束組的細(xì)胞核內(nèi)阿霉素量明顯增加，且rgdf-m(10.5％)及rgdf-m(6.5％)兩組的核內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度相比control-m更強(qiáng)，這表明在混合了paeep-plla的混合載藥膠束在胞內(nèi)藥物釋放速率顯著增加，這取決于paeep的酸敏感及酶敏感性，而偶聯(lián)了rgdf靶向肽的膠束胞內(nèi)釋放速率更快。

(8)選用12周齡的正常balb/c雌性小鼠，分別靜脈注射實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、11(rgdf-m(6.5％))制備的載藥膠束、普通的peg-plla載藥膠束以及游離的阿霉素，控制注射的阿霉素劑量都為5mg/kg，在不同時(shí)間點(diǎn)從小鼠的眼眶靜脈叢取血獲取血清后，以體積比為5:1的比例用甲醇稀釋血清，采用熒光定量的方法計(jì)算血液中dox的含量，建立藥時(shí)曲線，所得結(jié)果如圖9所示；

根據(jù)圖9可以看出，游離阿霉素靜脈注射1h后，血液中含有的藥物含量迅速下降；而peg-plla膠束、rgdf-m(10.5％)、control-m以及rgdf-m(6.5％)實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)的濃度分別為游離阿霉素組濃度的12.3、12.7、16.3以及18.7倍。這表明擁有paeep/peg親疏水微相分離界面的混合載藥膠束具有比單純peg-plla膠束更優(yōu)的抗蛋白吸附能力，增加了膠束在體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。并且rgdf-m(6.5％)與rgdf-m(10.5％)相比，1h后的血藥濃度前者是后者的1.5倍，這表明rgdf-m(6.5％)擁有更強(qiáng)的抗蛋白吸附能力及長(zhǎng)循環(huán)能力。

(9)為了更直觀的觀察混合載藥膠束在小鼠體內(nèi)的分布情況，本發(fā)明分別使用游離的阿霉素、實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、11(rgdf-m(10.5％))制備的載藥膠束和peg-plla載藥膠束包裹熒光染料dir，然后靜脈注射至小鼠體內(nèi)，用近紅外圖像顯示混合載藥膠束的體內(nèi)分布情況，所得結(jié)果如圖10所示；

根據(jù)圖10可以看出，與游離阿霉素組相比較，其他四組膠束都有明顯的腫瘤部位的蓄積，48h后腫瘤部位的累積量最高，并且rgdf-m(6.5％)組的腫瘤部位的蓄積量最多；rgdf-m(10.5％)膠束組腫瘤部位的熒光強(qiáng)度高于peg-plla膠束組但是卻低于control-m組，這是由于表面較多的rgdf修飾同時(shí)又增加了單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)其的內(nèi)吞。游離阿霉素組的熒光主要分布于肝臟與脾臟，rgdf-m(6.5％)組的腫瘤熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，但是在肝臟及脾臟熒光強(qiáng)度較弱，這充分說(shuō)明了其抗單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(mps)吞噬能力最強(qiáng)。

(10)為了進(jìn)一步研究載藥膠束在小鼠的體內(nèi)分布情況，本發(fā)明考察了實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、11(rgdf-m(10.5％))制備的載藥膠束載藥膠束經(jīng)靜脈注射入小鼠體內(nèi)后24h的分布情況，所得結(jié)果如圖11所示；

根據(jù)圖11可以看出，腫瘤部位的阿霉素含量，rgdf-m(6.5％)膠束組明顯高于游離阿霉素、peg-plla膠束以及rgdf-m(10.5％)組(p<0.05)；且混合載藥膠束組control-m、rgdf-m(10.5％)以及rgdf-m(6.5％)組在肝臟以及脾臟的累積量明顯低于peg-plla組膠束(p<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了混合載藥膠束的優(yōu)越性。

(11)采用游離阿霉素、實(shí)施例2(記為control-m)、9(rgdf-m(6.5％))、11(rgdf-m(10.5％))制備的載藥膠束和peg-plla載藥膠束對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療，治療周期為21天，統(tǒng)計(jì)治療過(guò)程中腫瘤體積和小鼠體重變化，結(jié)果如圖12～圖13所示；

對(duì)治療21天后腫瘤重量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖14所示；

使用x射線光譜儀對(duì)治療21天后的腫瘤進(jìn)行觀察，觀察結(jié)果如圖15所示；

根據(jù)圖12～圖15的結(jié)果可以看出，在治療21天后，無(wú)論在腫瘤體積還是在腫瘤重量上，三組混合載藥膠束體系的抑瘤效果則明顯優(yōu)于peg-plla膠束組及游離阿霉素組；并且混合載藥膠束中rgdf-m(6.5％)組的抗腫瘤效果最好，這說(shuō)明rgdf修飾的混合載藥膠束中rgdf的含量會(huì)影響治療效果。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供了的基于聚磷酸酯的混合載藥膠束具有良好的穩(wěn)定性，兼具體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功效和促靶細(xì)胞內(nèi)吞的作用，且容易進(jìn)行靶向修飾；本發(fā)明提供的主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束中的rgdf在ph7.4的條件下可以在peg的水化層中得以隱藏，避免正常組織的吞噬，到達(dá)腫瘤部位后，腫瘤部位的微酸環(huán)境使rgdf得以暴露，達(dá)到主動(dòng)靶向的效果，進(jìn)一步增加靶細(xì)胞的內(nèi)吞，從而進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果；本發(fā)明提供的基于磷酸酯的混合載藥膠束和主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的混合載藥膠束的腫瘤治療效果優(yōu)異，明顯優(yōu)于單一的peg-plla載藥膠束。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。